李曉榮，張菁雯，趙燕妮，徐獻(xiàn)鋒，胡玉梅，于澄宇

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵712100）

甘藍(lán)型油菜（BrassicanapusL．AACC＝38）是世界上重要的油料作物，是蕓薹（BrassicacampestrisL．AA＝20）和甘藍(lán)（B．oleraceaL．CC＝18）的種間雜交復(fù)合種［1］，但其遺傳變異程度遠(yuǎn)不如其祖先種白菜和甘藍(lán)豐富，充分利用兩個(gè)祖先種的基因資源可以擴(kuò)大其遺傳多樣性［2］。遺傳多樣性是指各群體間和群體內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳變異的總和［3］，對(duì)育種材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，不僅可以揭示育種材料間的親緣關(guān)系，為后續(xù)材料改良和品種選育提供參考，而且也是挖掘優(yōu)異等位基因、選擇特殊材料、進(jìn)行種質(zhì)資源合理保存的基礎(chǔ)。目前常用于遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記主要有SSR、AFLP、ISSR等，其中SSR 具有分布廣、易擴(kuò)增、重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性等特點(diǎn)而廣泛運(yùn)用于油菜種質(zhì)資源的研究［4］。SSR 在油菜上主要用于分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性［5－8］、群體結(jié)構(gòu)［9］、篩選核心種質(zhì)［10］和構(gòu)建連鎖圖譜［11］等。

目前中國油菜育種的主要方法為雜種優(yōu)勢(shì)利用，并結(jié)合了油菜的雙低、高產(chǎn)和高含油量等育種目標(biāo)［12］。雜種優(yōu)勢(shì)利用首先要求選育一批性狀優(yōu)良的自交系，為了獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交組合，這些自交系必須具有較高的遺傳多樣性。遺傳距離是度量親本遺傳差異的有效參數(shù)，據(jù)之可將親本較好地分類［13－14］。一般認(rèn)為，植物親本材料的遺傳距離與其雜種優(yōu)勢(shì)或雜種表現(xiàn)可能具有一定的相關(guān)性，而油菜的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)是否具有相關(guān)性爭議較大，但是育種實(shí)踐表明親本間適當(dāng)?shù)倪z傳距離是獲得較高雜種優(yōu)勢(shì)的必要條件［15］。因此對(duì)主要栽培品種、重要自交系進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，判斷其親緣關(guān)系，評(píng)價(jià)它們的異質(zhì)性，劃分雜交優(yōu)勢(shì)群是選出優(yōu)良自交系及雜交種的關(guān)鍵。高含油量材料的創(chuàng)制與應(yīng)用是當(dāng)前中國油菜品種改良的一個(gè)主攻方向，使得各個(gè)育種單位的材料快速更新?lián)Q代，高含油量油菜品種的選育也取得突破，如‘中雙11號(hào)’、‘浙油50’、‘秦優(yōu)88’等在區(qū)域試驗(yàn)中籽粒含油量都已接近50%。西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心近年來通過定向選擇、從引進(jìn)雜交組合中系譜選育、高強(qiáng)度品種間雜交等方法選育了一批高含油量育種材料，比傳統(tǒng)育種材料提高3～10 個(gè)百分點(diǎn)。但是這些材料的遺傳構(gòu)成及親緣關(guān)系尚不明確，因此剖析其遺傳多樣性是當(dāng)前迫切任務(wù)。本研究主要以甘藍(lán)型油菜新育種材料為研究對(duì)象，通過SSR 分子標(biāo)記檢測(cè)，分析引進(jìn)材料和培育自交系之間的親緣關(guān)系、遺傳多樣性，為油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用育種提供參考。

1 材料和方法

1．1 材 料

近年來西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心選育的骨干親本、高含油量自交系和引進(jìn)品種等91份，以及作為參考的芥菜型油菜、白菜型油菜和埃塞俄比亞芥等8份蕓薹屬近緣種，材料信息見表1。所有材料于2012年秋季播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌試驗(yàn)田，每個(gè)材料種1～3行，田間管理同大田生產(chǎn)。

1．2 SSR 分析

花蕾期選擇5 個(gè)正常植株，混合法取嫩葉約0．50g，存放于－80℃冰箱。改良CTAB［16］法提取總DNA，0．8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量，用TE溶液稀釋10μL DNA 母液至50～100 ng／μL儲(chǔ)存于4℃冰箱用于擴(kuò)增，其余存放于－20℃冰箱備用。

從已開發(fā)的甘藍(lán)C 組和白菜A 組染色體SSR標(biāo)記中選取均勻分布于19條染色體上的160對(duì)引物，包括BoGMS系列、cnu＿m 系列和nia＿m 系列，引物系列、名稱參考相關(guān)文獻(xiàn)［17－19］，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。用48份材料篩選出多態(tài)性高、條帶清晰的48對(duì)引物對(duì)所有材料進(jìn)行擴(kuò)增分析，其中25對(duì)為A 基因組，23對(duì)為C基因組。PCR反應(yīng)體系為10μL，包含1μL DNA（約100ng），3 μL ddH2O，上下游引物各0．5μL（50ng／μL）和5 μL Reaction Mix（康為公司合成）。PCR 程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，52～60℃退火45 s，72℃復(fù)性1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓150V，電流70～80mA，時(shí)間2h。銀染法染色分析，觀察拍照并記錄。

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

統(tǒng)計(jì)電泳明晰的條帶，以Marker為參照在相同的遷移率上按每個(gè)樣品擴(kuò)增條帶有無記為“1”或“0”，在Excel中列出“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)算基于A 組和C組標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)（GS），公式為：

式中，N表示i和j材料的公共條帶數(shù)；Ni表示i材料中擴(kuò)增的條帶數(shù)；Nj表示j材料中擴(kuò)增的條帶數(shù)［20］。在NTSYS pc．2．1軟件中構(gòu)建UPGMA（非加權(quán)算術(shù)平均）聚類圖。

表1 材料編號(hào)、系譜和來源Table 1 Code，pedigree and origin of materials

續(xù)表1 Continued Table 1

2 結(jié)果與分析

2．1 SSR引物多態(tài)性分析

用篩選的48對(duì)SSR 引物對(duì)99 份參試材料進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)到336個(gè)清晰條帶，其中255個(gè)具有多態(tài)性，占總數(shù)69．67%（圖1）。如表2所示，A 組染色體的25對(duì)引物共檢測(cè)到186個(gè)清晰條帶，其中153個(gè)條帶在不同材料中有差異，多態(tài)性比率為82．26%。條帶數(shù)為3～11，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為7．44個(gè)，以nia＿m103（11）最多。多態(tài)性條帶為1～11個(gè)，平均為6．25個(gè)。其中nia＿m060（10）、cnu＿m052（10）、nia＿m034（9）和nia＿m103（11）引物不僅擴(kuò)增條帶多，且有100%多態(tài)性比率，表明其標(biāo)記具有高效性。23對(duì)C 組染色體SSR 引物共擴(kuò)增到清晰條帶150個(gè)，102個(gè)具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為68．00%。引物條帶數(shù)為3～10個(gè)，平均每對(duì)引物為6．50個(gè)，以BoGMS1394（10）和BoGMS0867（10）最多，其次是BoGMS0847（9）和BoGMS1171（9）。多態(tài)性條帶為2～10，平均每對(duì)引物為4．42 個(gè)，BoGMS0867（10）最 多，BoGMS0847（9）次 之，BoGMS1240等8 對(duì)引物只有2 個(gè)多態(tài)性條帶。BoGMS0867、BoGMS0847 和BoGMS1171 等3 對(duì)引物具有擴(kuò)增性好，多態(tài)性高的特點(diǎn)，可作為核心引物。表2結(jié)果顯示，A 組染色體上的SSR 引物擴(kuò)增和多態(tài)性比率均高于C組。

2．2 相似系數(shù)分析

統(tǒng)計(jì)48 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果的相似系數(shù)（GS），發(fā)現(xiàn)99份育種材料的成對(duì)相似系數(shù)變幅為0．500 0～0．904 8。其中相似系數(shù)最小的2個(gè)品種為‘沭陽rapa’和‘楚0708’，相似系數(shù)為0．500 0；‘沭陽rapa’與‘浙油18’、‘國盛油6 號(hào)’和‘浙大619’的相似系數(shù)也較小，均為0．507 9。相似度最高的品種為‘秦榮2號(hào)’和‘秦榮3號(hào)’，達(dá)到0．904 8，這2個(gè)材料均來自陜西省雜交油菜中心。其次分別為‘浙油17’和‘浙油18’、‘浙油50’和‘浙油51’，相似系數(shù)均為0．900 8，均來自浙江農(nóng)科院。

將相似系數(shù)劃分成5個(gè)區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表3）顯示，相似系數(shù)在0．600 0～0．799 9區(qū)間內(nèi)所占的比例高達(dá)92．08%，包括了大部分材料；0．800 0～0．899 9 區(qū) 間 內(nèi) 有134 個(gè)，占 總 數(shù) 的2．76%；僅有233個(gè)相似系數(shù)小于0．600 0，占總數(shù)的4．60%，說明這99份參試油菜育種材料大部分遺傳相似度較高，多樣性不夠豐富。

2．3 99份油菜育種材料的聚類分析

99份油菜育種材料分別基于A 基因組、C 基因組為主標(biāo)記進(jìn)行UPGMA 的聚類結(jié)果見表4。

依據(jù)25對(duì)主要分布于A 基因組的SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果，99份材料相似系數(shù)區(qū)間為0．59～0．92，聚類分析分為7組。第I組包括62個(gè)材料，占所有材料的62．63%，其中22個(gè)陜西材料，8個(gè)中國農(nóng)科院油料作物研究所材料，5個(gè)貴州材料和7個(gè)浙江大學(xué)材料。第Ⅱ組包括15個(gè)來自12個(gè)不同地區(qū)的材料。第Ⅲ組包括8個(gè)材料，其中5個(gè)材料來自陜西，包括春油菜Polo、Stellar、D636R，而‘雜優(yōu)105’和D615含有春油菜血緣，另外還有Slog9、‘雙1’和‘滬油21’。第Ⅳ組包括7個(gè)材料，有‘G8白’、‘白花埃芥’、‘金絲芥’、169C、Q923、‘H9958 黃’、‘浙雙6號(hào)’。第Ⅴ組包括‘黃斑芥’、‘聞喜黃芥’和‘陜北黃芥’。第Ⅵ組包括‘雅油1號(hào)’、‘沭陽rapa’和‘冬油1號(hào)’?！亟?008’在0．65處與其他材料分離單獨(dú)聚為一類。

表2 48對(duì)SSR 引物信息及其對(duì)99份材料的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Information about 48pairs of SSR primers and their amplification

續(xù)表2 Continued Table 2

表3 分別基于A、C組引物擴(kuò)增結(jié)果的聚類群Table 3 Groups of 99rapeseed materials clustered based on the amplification using SSR primers in A and C genomes

圖1 引物BoGMS1171在部分參試材料中的擴(kuò)增Fig．1 DNA fragment amplified by primer BoGMS1171in some materials

依據(jù)23對(duì)主要分布在C基因組的SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果，99 份材料相似系數(shù)區(qū)間為0．62～0．96，UPGMA 聚類結(jié)果（表4）表明，在相似系數(shù)閥值為0．73處可把所有材料聚為5組。第Ⅰ組包括87個(gè)材料，占總數(shù)87．88%；第Ⅱ組包括來自澳大利亞的Saphhire和CB Boomer等2個(gè)春油菜品種；第Ⅲ組包括來自英國的Mohican和來自捷克的Solida；第Ⅳ組包括‘黃斑芥’、‘聞喜黃芥’、‘陜北黃芥’、‘雅油1號(hào)’、‘沭陽rapa’和‘冬油1號(hào)’；第Ⅴ組包括‘秦芥2008’和‘金絲芥’。在閥值為0．75處又可以把第Ⅰ組的87個(gè)材料分為6個(gè)亞組。第i亞組包括15個(gè)材料，其中包括中國農(nóng)科院油料研究所的6個(gè)材料；第ii亞組包括51個(gè)材料，大部分為陜西材料；第iii亞組包括8個(gè)材料；第iv亞組包括來自云南的A35和陜西省雜交油菜中心的3個(gè)材料；第vi亞組包括8個(gè)材料；來自埃塞俄比亞的白花埃芥與其他86個(gè)材料距離最遠(yuǎn)。比較基于A 組和C 組的聚類結(jié)果顯示，兩大類SSR 引物由于其產(chǎn)物主要分布于A 基因組和C基因組，其揭示的遺傳信息不同，遺傳相似系數(shù)不同，聚類結(jié)果也有明顯差異，C 組SSR 標(biāo)記顯示材料的遺傳差異與栽培區(qū)域關(guān)系更為密切，而A 組SSR 分析對(duì)白菜型油菜、芥菜型油菜、甘藍(lán)型油菜的區(qū)分更明確。綜合A、C 兩組SSR 標(biāo)記對(duì)99份材料進(jìn)行UPGMA 聚類，結(jié)果（圖2）表明，在閥值為0．71處將99份材料聚為5組。第Ⅰ組包括89個(gè)材料，占到所有材料的89．90%；第Ⅱ組僅包括白花埃塞俄比亞芥和‘G8白’2個(gè)白花材料，可能與‘G8白’的白花基因染色體來源有關(guān)；第Ⅲ組包括‘黃斑芥’、‘聞喜黃芥’、‘陜北黃芥’和‘金絲芥’4個(gè)材料；第Ⅳ組包括‘雅油1號(hào)’、‘沭陽rapa’和‘冬油1 號(hào)’3個(gè)白菜型材料；第Ⅴ組僅有1 個(gè)‘秦 芥2008’。第Ⅰ組89個(gè)甘藍(lán)型油菜在閥值為0．73處又分為5個(gè)亞組。第i亞組包括43個(gè)材料，主要為陜西的恢復(fù)系、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和浙江材料；第ii亞組包括9個(gè)材料，以陜西材料為主；第iii亞組包括12個(gè)材料，以貴州和國外材料為主，除H15R 外均為polima CMS的保持系；第iv亞組包括19 個(gè)材料，主要是中國農(nóng)科院油料作物研究所、浙江農(nóng)科院和來自安徽的材料，除‘X 矮’外均為polima CMS的保持系；第v亞組包括Qz052、CDH、‘雙1’、Q10、147C、和‘浙油758’。

表4 基于25對(duì)A組引物和23對(duì)C組引物擴(kuò)增結(jié)果的聚類群Table 4 Groups of 99rapeseed materials clustering with 25pairs of primers in A genome and 23pairs of primers in C genome

圖2 基于48對(duì)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果對(duì)99份油菜的UPGMA 聚類圖Fig．2 Dendrogram of UPGMA clustered based on the amplification using 48SSR primer pairs

總體看來，無論是用23對(duì)C組標(biāo)記、25對(duì)A 組標(biāo)記、還是合并這48對(duì)引物的結(jié)果進(jìn)行聚類，均可以把所有參試材料聚為三大類：第一大類包括了大部分材料，除了來源自埃塞俄比亞的白花埃芥（B．carinata）外均為B．napus型材料，第二大類為芥菜型材料，第三大類為白菜型材料。3個(gè)聚類結(jié)果皆顯示，相同種的材料聚在一起，來自同一地區(qū)、同一育種單位的品種分布于不同的大組中，說明油菜種質(zhì)資源存在交流。3個(gè)聚類結(jié)果中，來自陜西省的的大部分品種都在第一大組里，其中陜西省雜交油菜中心、浙江農(nóng)科院、中國農(nóng)科院油料所的品種高度集中，說明各個(gè)育種單位的育種材料多樣性低，或參試的材料均來自幾個(gè)有限的核心骨干材料。

3 討 論

本研究所選用的SSR 標(biāo)記引物具有易擴(kuò)增、重復(fù)性好、條帶清晰等特性，且均勻散布在油菜的19個(gè)連鎖群上。所選用的48對(duì)引物的擴(kuò)增和分辨能力各異，多態(tài)性信息含量與條帶數(shù)不盡一致，與雷天剛等［21］研究結(jié)果一致。其中C組23對(duì)引物多態(tài)性比率為68．00%，每對(duì)引物平均多態(tài)性條帶為4．42個(gè)；A 組染色體25 對(duì)引物多態(tài)性比率為82．26%，每對(duì)引物平均多態(tài)性條帶6．25個(gè)。A 組25對(duì)引物的擴(kuò)增能力、多態(tài)性均高于C 組23 對(duì)引物。這可能是中國甘藍(lán)型油菜在育種進(jìn)程中利用白菜型遠(yuǎn)緣雜交較多，A 組遺傳基礎(chǔ)較廣且白菜品種在改善品質(zhì)育種時(shí)不會(huì)明顯減少遺傳多樣性［22］，而C 組遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較狹窄所引起。成對(duì)相似系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，99 份材料遺傳相似系數(shù)的變幅在0．500 0～0．900 8，相似系數(shù)在0．600 0～0．799 9區(qū)間的材料占92．08%，所選用的甘藍(lán)型油菜育種群體的遺傳多樣性不高，這可能與農(nóng)藝性狀選擇及骨干親本的使用有關(guān)。

根據(jù)聚類結(jié)果可知，來自不同區(qū)域的材料在各大組中均有分布且在小組內(nèi)聚集，各個(gè)大組中均有來自不同育種單位的材料，品種或品系按栽培區(qū)域來源聚集現(xiàn)象不明顯，與范志雄等［23］的研究結(jié)果相似，因此按地理來源組配的強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合的可靠性可能較低。所有參試材料也沒有按恢復(fù)系、保持系，或者春性、冬性聚類，說明不同地區(qū)的油菜育種資源之間有著頻繁的交流。同時(shí)來自同一育種單位的材料大部分聚在一個(gè)亞組內(nèi)且具有較高的相似性，這可能由于育種較多依賴于核心骨干親本而引起的。Qian［24］、姚艷梅等［25］的研究表明半冬性油菜與春油菜雜交是改良春油菜生產(chǎn)潛力的有效途徑。從本研究中也可以看出，通過輪回選擇選育的‘圣光77’、多親復(fù)交選育的‘浙雙6 號(hào)’和‘蘇油1號(hào)’等品種的系譜較復(fù)雜，特異性較強(qiáng)，說明除過直接引進(jìn)外來種質(zhì)資源外，輪回選擇、多親本數(shù)復(fù)交、不同生態(tài)類型間雜交也是提高育種材料遺傳多樣性的重要途徑。

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