田韋韋，王彩霞，田 敏，歐陽彤，張 瑩

（中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室，杭州311400）

文心蘭（Oncidiumspp.），又名舞女蘭，為蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬（Oncidium）多年生草本植物，原產(chǎn)于中美洲和南美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。文心蘭的花枝長，花小而繁多，花形奇特，顏色艷麗，是一種觀賞價值較高的洋蘭，被廣泛用作切花材料和盆栽觀賞。文心蘭同其它蘭科植物一樣，采用傳統(tǒng)的分株繁殖方法繁殖系數(shù)較低，難以滿足市場需求，利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以加快繁殖速度，實現(xiàn)種苗工廠化生產(chǎn)。在文心蘭組織培養(yǎng)過程中，再生植株易出現(xiàn)不同程度的葉色突變，而且這些突變性狀能快速地通過組織培養(yǎng)進行無性繁殖應用。

葉色突變通常是由于葉綠素的代謝過程受到影響，導致葉綠素的含量和比例發(fā)生改變引起的。葉色突變體作為一種特殊的材料，是研究高等植物光合機制、葉綠素代謝途徑和葉綠體遺傳發(fā)育等方面的理想材料。迄今，國內(nèi)外已從煙草（Nicotiana tabacumL.）［2］、擬南芥（Arabidospisthaliana）［3］、大 麥（Hordeumvulgare）［4］、水稻（Oryzasativa）［5］、黃瓜（CucumissativusL.）［6］等眾多植物中發(fā)現(xiàn)、獲得并鑒定出大量葉色突變體。然而，有關(guān)花卉葉色突變體的報道則較為匱乏，花燭（Anthurium andraeanum）中有花葉、黃化葉、天鵝絨綠葉突變體［7］，大花蕙蘭（Cymbidiumhyhridum）中有白色條紋和黃色條紋葉色突變體［8］，菊花（Chrysanthemummorifolium）中有黃綠葉突變體［9］，文心蘭（Oncidiumspp.）中有黃化突變體［10］，目前尚未見有關(guān)文心蘭淺綠條紋突變體的研究報道。作者所在研究組自2005年以擬原球莖誘導途徑進行文心蘭的組織培養(yǎng)［11］，在組織培養(yǎng)后代中發(fā)現(xiàn)了淺綠條紋突變體，此突變體具有較高的觀賞價值。本研究以文心蘭組培后代中獲得的淺綠條紋突變體為試驗材料，分析葉片光合色素及葉綠素合成前體物質(zhì)含量，觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，測定葉綠素熒光參數(shù)，以初步了解其葉色變異的生理基礎，為進一步從分子水平揭示其機理奠定基礎，并為文心蘭葉藝新品種培育提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為本研究組自2005年開始以擬原球莖誘導途徑進行組織培養(yǎng)獲得的淺綠條紋突變體，該突變體葉片呈現(xiàn)綠色與淺綠色相間的縱條紋，且其突變性狀在離體增殖培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定（圖1）。分別選取5株處于同一生長期，長勢相對一致，具5～6葉的突變體和正常植株用于試驗。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 光合色素含量 光合色素含量的測定參照李合生［12］的方法。選取突變體和正常植株最上部第2片葉片，剪成寬度小于1mm 細絲，混勻后稱取0.05g放入試管，加入5 mL 丙酮與無水乙醇混合液（1∶1，V／V）避光浸提至葉片完全變白（24h），測定溶液吸光度A470、A645和A663，共3次重復。

圖1 文心蘭淺綠條紋突變體的表型Fig.1 Phenotypes of light green stripe mutant of Oncidium

1.2.2 葉綠素合成前體物質(zhì)含量 選取突變體和正常植株最上部第2片葉片進行葉綠素合成前體物質(zhì)含量測定。δ－氨基酮戊酸（ALA）含量按照王凌健等［13］方法測定；膽色素原（PBG）、尿卟啉原（UrogenⅢ）和糞卟啉原（CoprogenⅢ）含量參照Bogorod［14］的方法測定；原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、鎂原卟啉Ⅸ（MgprotoⅨ）和原葉綠素（Pchl）含量的測定采用Hodgins等［15］的方法。將正常植株7 種葉綠素合成前體物質(zhì)含量均設為100%，突變體葉綠素合成前體物質(zhì)含量以相對于正常植株的百分比表示。

1.2.3 葉肉細胞和葉綠體超微結(jié)構(gòu) 選取突變體和正常植株最上部第2片葉片，切成1mm×3mm小塊，置于2.5%戊二醛中4 ℃固定過夜，0.1mol／L磷酸緩沖液沖洗3次，1%餓酸固定2h，再用0.1 mol／L磷酸緩沖液沖洗3次，乙醇梯度脫水，再將樣品依次浸入體積比1∶1和1∶3的spurr包埋劑和丙酮的混合液滲透1h和3h，純spurr包埋過夜，70 ℃聚合過夜，Reichert超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在JEM－1230透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.4 葉綠素熒光參數(shù) 采用M 系列調(diào)制葉綠素熒光成像系統(tǒng)Imaging－PAM，測定突變體和正常植株最上部第2片葉片葉綠素熒光參數(shù)。測定前，將葉片暗處理20min以上，打開測量光（小于1μmol·m－2·s－1）測定初始熒光（Fo），再由飽和脈沖光（2 800μmol·m－2·s－1）測得暗適應的最大熒光（Fm），隨后開啟光化光（21μmol·m－2·s－1），當時實熒光達到穩(wěn)態(tài)后關(guān)閉光化光，同時打開遠紅光（持續(xù)3～5s），測得光適應條件下最小熒光（Fo′）和最大熒光（Fm′）［16－18］。PSⅡ最大光化學效率（Fv／Fm）、PSⅡ的實際利用量子產(chǎn)額（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數(shù)（qP）和非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）等熒光參數(shù)值由系統(tǒng)自動計算生成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS 3.01軟件進行方差分析及顯著性檢驗（LSD 法），利用Microsoft Excel 2003繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭突變體與正常植株葉片光合色素含量比較

文心蘭淺綠條紋突變體葉片的3 種光合色素（葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素）的含量及其比值均顯著低于正常植株（表1）。其中，突變體葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量比正常植株分別顯著減少了37.1%、34.0%和30.8%，Chl a／Chl b 和Chl／Car分別減少了5.4%和10.0%。表明文心蘭突變體葉片呈現(xiàn)淺綠條紋與葉綠素含量下降有關(guān)。

2.2 文心蘭突變體與正常植株葉片葉綠素合成前體物質(zhì)相對含量比較

如圖2所示，文心蘭淺綠條紋突變體葉片ALA、PBG、Urogen Ⅲ和Coprogen Ⅲ含量均高于正常植株，分別為野生型的113%、135%、120%和139%；而其Proto Ⅸ、Mg－proto Ⅸ和Pchlide含 量卻不同程度地比正常植株降低，降低幅度分別為38%、28%和36%。說明文心蘭突變體葉綠素生物合成途徑受阻，受阻位點位于葉綠素合成前體物質(zhì)含量變化的拐點處，即從CoprogenⅢ到ProtoⅨ的轉(zhuǎn)化步驟。

2.3 文心蘭突變體與正常植株的葉肉細胞和葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較

利用透射電鏡對文心蘭淺綠條紋突變體和正常植株葉片的葉肉細胞、葉綠體超微結(jié)構(gòu)進行比較觀察，結(jié)果表明突變體與正常植株葉綠體結(jié)構(gòu)存在較大的差異。其中，正常植株葉綠體呈紡錘形（圖3，A），基粒數(shù)目多且排列整齊，構(gòu)成基粒的垛疊層數(shù)較多（圖3，B）；嗜鋨顆粒及囊泡較少。突變體的綠色葉片組織內(nèi)葉肉細胞和葉綠體的超微結(jié)構(gòu)與正常植株相似。突變體淺綠葉片組織的部分葉綠體形狀與正常植株相似，呈紡錘形，但多數(shù)葉綠體發(fā)育異常，為近橢圓形（圖3，C），基粒數(shù)目較少且排列疏松，基粒片層的垛疊層數(shù)明顯減少（圖3，D）；嗜鋨顆粒較多且相對集中（圖3，E），囊泡豐富（圖3，F(xiàn)），說明突變體葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育存在明顯的缺陷。

表1 文心蘭淺綠條紋突變體與正常植株葉片的光合色素含量及比值Table1 Content and partial ratio of photosynthetic pigments in leaves of light green stripe mutant and normal plant of Oncidium

2.4 文心蘭突變體與正常植株葉綠素熒光參數(shù)的比較

Fo和Fm分別是PSⅡ反應中心處于完全開放和完全關(guān)閉時的熒光產(chǎn)量，F(xiàn)v／Fm反映PSⅡ反應中心潛在的最大光化學效率，F(xiàn)v′／Fm′反 映 開 放 的PSⅡ反應中心原初光能捕獲效率。如表2所示，文心蘭突變體的Fo比正常植株高39%，但未達到顯著水平，而其Fm、Fv／Fm、Fv′／Fm′均顯著低于正常植株，降低幅度分別為48.1%、40.0%和48.5%。同時，ΦPSⅡ反映PSⅡ反應中心部分關(guān)閉情況下的實際光能捕獲效率，文心蘭突變體的光能捕獲效率顯著低于正常植株，比正常植株顯著降低了53.5%。qP反映PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學傳遞的份額，NPQ代表PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的部分，文心蘭突變體的qP、NPQ與正常植株相比有所降低但差異不顯著，分別為正常植株的90.4%和92.6%?？梢?，文心蘭突變體的葉綠體結(jié)構(gòu)可能受到破壞，導致捕光色素蛋白復合物減少，PSⅡ活性大大降低，PSⅡ的光能捕獲率降低，不利于光能的利用，但其光化學淬滅和非光化學淬滅沒有受到顯著影響。

圖2 文心蘭淺綠條紋突變體（MT）與正常植株（WT）葉片的葉綠素合成前體物質(zhì)相對含量Fig.2 Relative contents of precursors for biosynthesis of chlorophyll in leaves of light green stripe mutant（MT）and normal plant（WT）of Oncidium

圖3 文心蘭淺綠條紋突變體與正常植株的葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig.3 The ultra－structure of chloroplast from light green stripe mutant and normal plant of Oncidium

表2 文心蘭淺綠條紋突變體與正常植株葉片的葉綠素熒光動力學參數(shù)Table2 Chlorophyll fluorescence parameters in leaves of light green stripe mutant and normal plant of Oncidium

3 討 論

葉色變異是一種常見的突變性狀，突變植株葉片主要呈現(xiàn)白化、黃化、淺綠、白綠、黃綠、綠黃、條紋、斑點等表型［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，文心蘭條紋突變體中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均顯著低于正常植株，分別比正常植株降低37.1%、34.0%、30.8%和36.3%，引起葉色變異的直接原因是光合色素含量的減少。高等植物體內(nèi)的葉綠素處于不斷合成和降解的動態(tài)變化之中，其中任何一個環(huán)節(jié)受阻，都可能導致植物體葉綠素含量的變化，從而引起葉色變異。邵勤等［20］對甜瓜葉色黃化突變體葉綠素生物合成前體物質(zhì)進行測定，結(jié)果表明受阻于PBG 與Urogen Ⅲ之間。呂明等［21］研究表明芥菜型油菜黃化突變體葉綠素合成代謝受阻于Coprogen Ⅲ至Proto Ⅸ的步驟。本研究中葉綠素合成前體物質(zhì)含量的測定結(jié)果顯示，突變體葉綠素合成途徑受阻于Coprogen Ⅲ到Proto Ⅸ的過程，導致ALA、PBG、UrogenⅢ和CoprogenⅢ明顯積累，而后續(xù)合成的Proto Ⅸ、Mg－proto Ⅸ和Pchlide含量則顯著降低。綜上所述，引起文心蘭突變體葉色變異的主要是由于葉綠素生物合成受阻，導致葉綠素含量降低和比例發(fā)生改變，引起葉色變化。

據(jù)報道，大多葉色突變體葉綠體結(jié)構(gòu)都發(fā)生了不同程度的改變［22－23］。曹莉等［24］對小麥黃化突變體葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，金黃和綠黃突變體的葉綠體發(fā)育存在明顯缺陷，金黃植株的葉綠體內(nèi)無基粒、基質(zhì)片層清晰可見，有淀粉粒，嗜鋨顆粒較多，而綠黃植株的葉綠體內(nèi)有基粒，但明顯少于突變親本，且基粒片層較少，基粒類囊體較發(fā)達。中華金葉榆子代黃葉苗葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)育缺陷，基粒片層垛疊失敗，進而多種色素含量大幅下降，光合系統(tǒng)發(fā)育不完全，致使其葉片呈現(xiàn)黃色、光合性能下降、植株生長緩慢［25］。本研究的文心蘭突變體葉綠體發(fā)育不完整，基粒數(shù)目及類囊體垛疊層數(shù)均減少，嗜鋨顆粒較多，囊泡豐富，代謝能力弱。由此可以推斷突變體葉色變異的原因可能是由于葉綠體發(fā)育受阻，使葉綠素失去了依托的物質(zhì)基礎，葉綠素合成陷于停滯狀態(tài)，葉綠素含量降低，從而導致葉色改變。

葉綠素熒光參數(shù)是描述植物光合作用機理和光合生理狀況的重要指標，光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞以及耗散等過程都可以通過葉綠素熒光參數(shù)的變化反映［26］，被廣泛用于葉色突變體的光合機理研究。與正常植株相比，文心蘭淺綠條紋突變體的Fo增加了39%，表明PSⅡ反應中心可能受到破壞，類囊體膜結(jié)構(gòu)可能受到損傷［27－28］。高等植物Fv／Fm一般恒定在0.80～0.85［29－30］，當植物受到光抑制、環(huán)境脅迫或發(fā)生某些基因突變時，F(xiàn)v／Fm值會出現(xiàn)顯著變化。本研究中，突變體的Fv／Fm比正常植株減少了40%，然而突變體和正常植株均生長在相同的環(huán)境中，沒有受到任何的環(huán)境脅迫，因此突變體Fv／Fm的顯著降低不可能是外界環(huán)境引起的，推測可能是由于葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞發(fā)生光抑制或者基因突變所致。Fv′／Fm′和ΦPSⅡ是對光適應狀態(tài)下PSⅡ光化學過程的度量，本研究中文心蘭突變體的Fv′／Fm′、ΦPSⅡ顯著低于正常植株，可能是由于葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞，導致捕光色素蛋白復合物減少，PSⅡ活性大大降低，PSⅡ的光能捕獲率降低，不利于光能的利用；同時，突變體的qP、NPQ與正常植株無顯著差異，表明突變體葉綠素在一定范圍內(nèi)降低時，對光化學淬滅和非光化學淬滅無顯著影響。

綜上所述，文心蘭黃綠突變體葉綠素前體物質(zhì)合成受阻和葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，影響其葉綠素的正常合成，造成葉綠素含量降低，同時PSⅡ結(jié)構(gòu)受到破壞，導致葉色改變，光能利用率下降。另外，植物葉色突變的機制較為復雜，是生理和遺傳因素共同作用的結(jié)果，有關(guān)文心蘭葉色變異的分子機制有待進一步深入研究。

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