李 彬，蔡宇良＊，趙曉軍，宛 甜，高天翔

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌712100；2 銅川市園藝工作站，陜西銅川727031）

‘馬哈利’櫻桃（Prunusmahaleb‘Mahaleb’）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus），是西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院從匈牙利引進(jìn)的櫻桃育種資源植物，由于其抗根癌病性強(qiáng)，又具有矮化、耐鹽堿等許多優(yōu)良的生物學(xué)特性［1］，是世界性的甜櫻桃砧木，現(xiàn)己成為西北地區(qū)甜櫻桃的主要砧木之一。關(guān)于‘馬哈利’生殖發(fā)育的研究較少，張雪等［2］對(duì)‘馬哈利’櫻桃的大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育進(jìn)行了研究，但并沒有涉及到雄性不育的情況，‘馬哈利’櫻桃結(jié)實(shí)率低可能與雄性不育有關(guān)。果樹雄性不育的現(xiàn)象非常普遍，前人在果樹雄性不育的機(jī)理上也做了相關(guān)基礎(chǔ)研究，劉玲等［3］在棗中發(fā)現(xiàn)了雄性不育的現(xiàn)象；沈元月等［4］在白桃的雄性不育研究中發(fā)現(xiàn)了小孢子消失的現(xiàn)象；杏的雄性不育品種‘Trevatt Blue’（P.armeniaca）中也觀察到了小孢子的退化問題［5］，櫻桃的雄性不育研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)就在‘馬哈利’櫻桃觀察到了雄性不育現(xiàn)象。

有效利用‘馬哈利’櫻桃雄性不育株，能夠大幅度提高雜交效率［6］，而且在保持苗木一致性，保證栽培苗木整齊度方面也有很大的意義［7］。本研究在對(duì)‘馬哈利’櫻桃雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行解剖學(xué)研究的基礎(chǔ)上，以期在試驗(yàn)站保存的‘馬哈利’野生種質(zhì)資源中尋找到雄性不育株系，通過對(duì)不育株和正?？捎昊ㄋ幇l(fā)育過程的比較，闡明其雄性不育發(fā)生的時(shí)期、方式和特征，完善對(duì)‘馬哈利’櫻桃生殖生物學(xué)的研究，為進(jìn)一步利用‘馬哈利’櫻桃雄性不育特性培育櫻桃優(yōu)質(zhì)苗木提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料獲得與采集

試驗(yàn)材料采自西北農(nóng)林科技大學(xué)眉縣櫻桃試驗(yàn)園。試驗(yàn)品種為正常開花結(jié)實(shí)的‘馬哈利’實(shí)生種，共6株，經(jīng)過花粉活力測(cè)定等試驗(yàn)，確定其中1株為雄性不育株，其余5株為正常發(fā)育株（對(duì)照）。取樣時(shí)間為2013年8月到2014年5月，2014年3月1日花芽萌動(dòng)開始至成熟花粉形成（4月1日）期，每天采集不同發(fā)育狀態(tài)的花芽或花蕾20個(gè)，其余時(shí)間每2周取樣1次，每次采集10個(gè)樣。

‘馬哈利’花芽取樣時(shí)從整個(gè)樹體的東西南北四個(gè)方向，上中下三層以及內(nèi)外膛分別取樣，以確保試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)因?yàn)榛ㄑ渴艿江h(huán)境因素與生長(zhǎng)狀態(tài)的影響而造成誤差。

開花期取少量未經(jīng)授粉‘馬哈利’新鮮花芽，剝?nèi)∑渲谢ǚ郏Ｒ?guī)石蠟切片方法（如下）和常規(guī)干燥處理，分別用作顯微鏡和電鏡掃描材料。

1.2 方 法

1.2.1 石蠟切片 用于細(xì)胞學(xué)觀察的花芽，采用FAA 固定液固定，4 ℃冰箱保存。按照常規(guī)石蠟切片法制片，分別經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋步驟后切片，期間采取愛氏蘇木精整體染色，對(duì)樣品進(jìn)行橫切與縱切，切片厚度8μm，中性樹膠封片［8］，選取具有代表性并且清晰的樣本，在Olympus BX－51型光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并照相。

1.2.2 掃描電鏡 用于電鏡下掃描的材料，用戊二醛固定，經(jīng)過脫水、臨界點(diǎn)干燥、上銅臺(tái)噴金等步驟，在JSM－6360LV 掃描電鏡下對(duì)花藥和花粉進(jìn)行觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘馬哈利’櫻桃雄性不育系花藥的發(fā)育過程

‘馬哈利’櫻桃雄性不育系的花藥發(fā)育在孢原細(xì)胞時(shí)期到四分體時(shí)期的表現(xiàn)與正常株系植株的表現(xiàn)基本一致，都是在3月初花芽分化結(jié)束，3月1日左右開始出現(xiàn)雄蕊原基（圖版Ⅰ，1），孢原細(xì)胞隨后分化形成，具有很明顯的細(xì)胞核?；ㄋ幈谟涉咴?xì)胞分裂產(chǎn)生的初生壁細(xì)胞分裂分化而成，由外向內(nèi)共有表皮、藥室內(nèi)壁、中層（2層）和絨氈層5層細(xì)胞。

初生造孢細(xì)胞是由孢原細(xì)胞分裂而來，發(fā)育形成小孢子母細(xì)胞（圖版Ⅰ，2）后進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期。小孢子母細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂形成2個(gè)子核，隨后進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ期，再次分裂之后形成四面體形狀的四分體，外面由胼胝質(zhì)壁包圍（圖版Ⅰ，3）?；ㄋ幈诩?xì)胞則伴隨著小孢子發(fā)育過程也持續(xù)產(chǎn)生著變化，早期的絨氈層細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，細(xì)胞較大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，排列整齊。發(fā)育過程進(jìn)行到單核小孢子形成時(shí)，絨氈層細(xì)胞明顯退化（圖版Ⅰ，4）直至完全消失，花藥壁最終分化發(fā)育成4室蝶形腔狀形。小孢子細(xì)胞從四分體中分離出后，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大且位于細(xì)胞中央，經(jīng)過單核靠邊期（圖版Ⅰ，5）后，最終經(jīng)過發(fā)育后形成成熟花粉粒（圖版Ⅰ，6）。

與對(duì)照相比，雄性不育株系花藥發(fā)育則從四分體時(shí)期開始出現(xiàn)異常，在形成正常的四分體之后，絨氈層細(xì)胞液泡增大且細(xì)胞形狀不規(guī)則（圖版Ⅰ，7），并沒有正常退化而是向藥室中央收縮，排列開始混亂（圖版Ⅰ，8），在此過程當(dāng)中，四分體形態(tài)變異，出現(xiàn)了退化的跡象。絨氈層細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增，把敗育的小孢子圍在藥室中央，形成整體團(tuán)塊狀，最終，異常的絨氈層和敗育的小孢子核、質(zhì)開始互融，小孢子已經(jīng)完全無法正常發(fā)育并逐漸解體（圖版Ⅰ，9），最后全部消失，不育株的花藥內(nèi)花粉囊成為了同為蝶形腔狀形的空腔（圖版Ⅰ，10）。觀察還發(fā)現(xiàn)少部分不育株可以形成少量的成熟花粉，著色較深，但是大部分花粉粒在藥室破裂時(shí)著色淺呈現(xiàn)無活性狀態(tài)（圖版Ⅰ，11），出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。另外觀察到可育的花粉粒總是貼近絨氈層和纖維層（圖版Ⅰ，12），一方面可能是為藥壁破裂散粉做準(zhǔn)備，另一方面花粉為了吸收足夠的營(yíng)養(yǎng)。

本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明從雄性不育株上采集的樣品當(dāng)中，91.67%實(shí)驗(yàn)樣中的小孢子在四分體時(shí)期之前正常發(fā)育，從四分體時(shí)期開始絨氈層細(xì)胞和小孢子發(fā)育出現(xiàn)異常并且最終出現(xiàn)敗育的現(xiàn)象；其余8.33%的樣品發(fā)育情況并沒有出現(xiàn)異常，與花粉正常發(fā)育的對(duì)照組相比在發(fā)育過程并無區(qū)別，四分體時(shí)期之后小孢子發(fā)育成為花粉，絨氈層正常退化，但是在藥壁開裂時(shí)期只有極小部分花粉粒具有活力，絕大部分呈現(xiàn)出無活力的狀態(tài)，出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。

2.2 開花期花藥和花粉的掃描電鏡觀察

雄性不育系的植株與正常植株相比，除了在花粉發(fā)育過程當(dāng)中的區(qū)別之外，在開花期也有很顯著的特征。在同一比例尺下，正常的花藥不僅體積大，而且飽滿，從外形上可以明顯看出4室蝶形的形狀（圖版Ⅰ，13），而敗育的花藥外形干癟，體積遠(yuǎn)小于正常花藥（圖版Ⅰ，14）。將花藥剝開繼續(xù)觀察，可以觀察到正常成熟花藥出粉量大（圖版Ⅰ，15），且花粉粒飽滿呈扁三角形狀，外具橫紋，且有3 個(gè)萌發(fā)溝（圖版Ⅰ，16）。相反可以看到，敗育花藥跟上述石蠟切片觀察結(jié)果相同，絕大部分花藥是空的（圖版Ⅰ，17），極個(gè)別有出粉的花粉粒也呈敗育狀，干癟并且看不出形狀（圖版Ⅰ，18）。

3 討 論

3.1 ‘馬哈利’雄性不育發(fā)生的形態(tài)與時(shí)期

‘馬哈利’櫻桃的小孢子形態(tài)在四分體時(shí)期前并沒有發(fā)現(xiàn)異常，隨后在四分體時(shí)期的絨氈層細(xì)胞排列混亂，部分細(xì)胞當(dāng)中出現(xiàn)液泡，絨氈層膨大并與小孢子粘連在一起，阻礙了小孢子正常的減數(shù)分裂，最終一同降解消失，不能形成正常的花粉粒，最終出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，這與韓愛華等［9］對(duì)“新梨7號(hào)”花粉敗育途徑的研究、羅來水等［10］在桃樹雄性不育的研究等關(guān)于雄性不育株系花粉發(fā)育觀察的結(jié)果相一致。但關(guān)于其小孢子發(fā)育異常的生化及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

根據(jù)Laser針對(duì)CMS類型花粉敗育時(shí)期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果和Kaul針對(duì)NMS類型敗育時(shí)期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看［11］，四分體時(shí)期以后敗育比例達(dá)到70%，減數(shù)分裂前、減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后各時(shí)期敗育的比例大體相同，從孢原細(xì)胞分化開始，每個(gè)過程都可能出現(xiàn)導(dǎo)致雄性不育發(fā)生的異?，F(xiàn)象，本試驗(yàn)結(jié)果中四分體時(shí)期以后出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，符合前人的研究結(jié)果。

3.2 ‘馬哈利’雄性不育發(fā)生的原因

在本次觀察過程中，還出現(xiàn)了一部分花粉未完全成熟時(shí)花藥壁就提前破裂散粉的情況，這部分花粉著色淺且活力弱，可能是‘馬哈利’雄性不育的另一種類型。結(jié)合絨氈層液泡化并且膨大的現(xiàn)象，以及對(duì)敗育花粉粒形態(tài)學(xué)觀察，可以確認(rèn)‘馬哈利’雄性不育跟小孢子發(fā)育時(shí)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)有著比較密切的聯(lián)系，而且發(fā)育不整齊，內(nèi)含物不足，形態(tài)不飽滿的花粉也會(huì)造成坐果率和結(jié)實(shí)率偏低。綜合‘馬哈利’敗育的整個(gè)過程，絨氈層細(xì)胞的異常分化起到了很大作用。絨氈層細(xì)胞是包裹在花粉母細(xì)胞之外、藥壁最內(nèi)層的一層細(xì)胞［12］。在花粉形成和發(fā)育的過程當(dāng)中，絨氈層一個(gè)很重要的作用就是在小孢子發(fā)育過程當(dāng)中轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［13］。另外一方面，絨氈層在發(fā)育過程中也會(huì)分泌和提供胼胝質(zhì)酶、孢粉素和花粉囊液等對(duì)發(fā)育有重要影響的物質(zhì)［14］。參考前人研究和本試驗(yàn)結(jié)果，‘馬哈利’在四分體時(shí)期絨氈層液泡化并且異常膨大，一方面，其細(xì)胞膨大的過程當(dāng)中本身消耗了大量的物質(zhì)，造成了發(fā)育物質(zhì)對(duì)外運(yùn)輸?shù)牟蛔悖瑫r(shí)擠壓了小孢子的發(fā)育空間；另一方面，絨氈層細(xì)胞異常發(fā)育導(dǎo)致分泌物不足或者沒有分泌物也嚴(yán)重影響了諸如四分體正常釋放小孢子或者小孢子正常減數(shù)分裂等發(fā)育過程。

另外，耿三?。?5］、葉要妹［16］等在對(duì)辣椒、百日草等雄性不育系材料進(jìn)行研究的過程當(dāng)中，都對(duì)花器做了形態(tài)學(xué)觀察，部分植物的不育系會(huì)出現(xiàn)花朵張開度、花瓣或者花絲等數(shù)據(jù)有別于正常發(fā)育植株的情況，但是在本試驗(yàn)觀察過程中發(fā)現(xiàn)，‘馬哈利’雄性不育系的花器與正?？捎仓甑幕ㄆ魇菦]有區(qū)別的，維管束和花絲等組織均正常發(fā)育，這為田間尋找雄性不育株系帶來了困難，但是從側(cè)面證明其他的藥壁組織的發(fā)育和‘馬哈利’雄性不育并沒有很明確的關(guān)系。

本試驗(yàn)表明，藥壁組織及其他組織均沒有直接出現(xiàn)敗育或者營(yíng)養(yǎng)供給異常的現(xiàn)象，表明‘馬哈利’雄性不育株系的花粉在發(fā)育過程當(dāng)中破壞了絨氈層的正常發(fā)育，致使絨氈層細(xì)胞異常膨大和提前的程序性死亡，進(jìn)而造成了小孢子的異常發(fā)育。一般認(rèn)為絨氈層發(fā)育和行為的異常是雄性不育的基因調(diào)控所導(dǎo)致的，它們的表達(dá)與否涉及到了敗育現(xiàn)象是否出現(xiàn)［17］，目前關(guān)于‘馬哈利’雄性不育決定基因的研究還處于空白階段，雄性不育性狀的顯隱性、控制基因的作用時(shí)期以及發(fā)生敗育的過程當(dāng)中水分營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、內(nèi)源激素分泌等問題還需要通過分子標(biāo)記和生理生化實(shí)驗(yàn)來解決［18］，但關(guān)于其小孢子發(fā)育異常的生化及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，這樣才能明確‘馬哈利’雄性不育的機(jī)理和原因，為進(jìn)一步利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

在果樹的發(fā)育過程中，其雄性育性是環(huán)境調(diào)控一定基因型表達(dá)出的結(jié)果，在考慮到雄性不育基因等遺傳因素帶來影響的同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)‘馬哈利’的可育花粉總是靠近絨氈層，距離藥壁比較近，跟生境敏感型雄性不育的部分特征相似［19］，這表明‘馬哈利’雄性不育可能在一定程度上也會(huì)受到環(huán)境的影響，結(jié)合敗育過程跟營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺失有關(guān)，建議在‘馬哈利’小孢子分化發(fā)育的敏感時(shí)期，加強(qiáng)果園的水肥管理，盡量創(chuàng)造好的發(fā)育條件，提高受精成活率，達(dá)到育種和高產(chǎn)的目的。

圖版Ⅰ Ta.絨氈層；Tt.四面體型四分體PlateⅠ Ta.Tapetum；Tt.Tetrahedral tetrads

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