李小梅，杜曉華，穆金燕，劉會(huì)超

（河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

大花三色堇（Viola×wittrockiana.Gams.），又名蝴蝶花、貓臉花，為堇菜科（Violaceae）堇菜屬（ViolaL.）園藝雜交種，由三色堇（V.tricolorL.）、黃堇（V.luteaHuds.）及阿爾泰堇菜（V.alticaKer Gawl.）雜交獲得［1］。因其色彩艷麗、花色豐富、花期長、耐寒等優(yōu)點(diǎn)而成為春秋季重要的花壇與盆栽花卉，在歐洲、美國和日本十分盛行，近年在中國城鄉(xiāng)美化中開始大量應(yīng)用，市場需求快速增長［2］。然而，目前中國大花三色堇生產(chǎn)用種子主要依賴進(jìn)口，其品種主要為F1代，價(jià)高且適應(yīng)中國生境的品種較少［2］。加快培育具有中國自有知識產(chǎn)權(quán)、適應(yīng)中國生境的大花三色堇品種是當(dāng)務(wù)之急。長期以來大花三色堇育種主要集中在歐美和日本等國的種子公司，因涉及商業(yè)秘密，外界對資源間的遺傳關(guān)系不甚明了。對從各地引進(jìn)的大花三色堇種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析對于大花三色堇種質(zhì)資源的收集、分類和育種具有重要的指導(dǎo)意義。

在大花三色堇種質(zhì)資源研究方面，杜曉華等［3］基于表型對來自國內(nèi)外的33份資源進(jìn)行遺傳差異分析。Ko等［4］將RAPD 標(biāo)記和表型相結(jié)合研究了30種堇菜屬植物的親緣關(guān)系。Yockteng等［5］利用ITS與ISSR 標(biāo)記研究了25種美麗堇菜亞屬植物的系統(tǒng)分類。Culley等［6］用ISSR 標(biāo)記分析了美國俄亥俄州6個(gè)堇菜種質(zhì)親緣關(guān)系，研究城市生境與種質(zhì)基因的關(guān)系。王健等［7］用RAPD 標(biāo)記研究了18個(gè)三色堇自交系的遺傳多樣性。王濤等［8］采用SRAP標(biāo)記研究了43份三色堇與角堇資源的遺傳多樣性。限制性位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）是一種基于基因組上廣泛分布的限制性酶切位點(diǎn)多態(tài)性的DNA標(biāo)記系統(tǒng)，具有操作簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率等特點(diǎn)［9］。該標(biāo) 記已在辣椒［10］、紫菜［11］、紅花檵木［12］、大白菜［13］、龍須菜［14］、苧麻［15］、重樓屬［16］、麥冬［17］等 植物的遺傳多樣性分析中被廣泛應(yīng)用［18］。但目前尚未見其在堇菜屬植物上的應(yīng)用報(bào)道。

本研究隨機(jī)選取了從國外育種公司和國內(nèi)育種單位引進(jìn)后純化以及本單位選育的41份大花三色堇種質(zhì)資源，采用RSAP標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析，旨在為大花三色堇種質(zhì)資源的收集、分類與種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)，并評價(jià)RSAP標(biāo)記系統(tǒng)在大花三色堇遺傳多樣分析中的適用性及其效力。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的41份大花三色堇種質(zhì)資源為多年自交純化的自交系（表1），由河南科技學(xué)院新鄉(xiāng)市草花育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 RSAP分析 以大花三色堇幼嫩葉片為材料，采用SDS法提取總DNA［19］。

RSAP分析方法參照杜曉華等［10］的方法進(jìn)行，采用10條RSAP引物（表2），組成45對引物組合，對41份大花三色堇資源進(jìn)行分析。PCR 擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25μL，其中模板DNA 為20ng，Mg2＋濃度2.5 mmol／L，dNTPs濃度0.2 mmol／L，TaqDNA 聚合酶為1.5 U，2條引物均為600nmol／L。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變 性5min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變 性1 min，45 ℃退 火1 min，72 ℃延 伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增在Biometra Tgradient PCR 儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，先在60 W 功率下預(yù)電泳30min，加樣后在75 W 功率下電泳2.5～3h，銀染檢測，具體參照許紹斌等［20］的方法進(jìn)行。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 RSAP分析產(chǎn)生的多態(tài)性條帶，按二元數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為“1”，無帯記為“0”，模糊不清帶不統(tǒng)計(jì)。每對引物組合的多態(tài)性比率（%）＝引物組合擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)／總條帶數(shù)×100，每個(gè)引物的鑒別能力（%）＝此引物組合可鑒別的材料數(shù)／總材料數(shù)×100。采用POPGENE version 1.32 軟件計(jì)算每對RSAP引物的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)。采用MVSP 3.1 軟件計(jì)算各材料間和組群間的Nei’s相似系數(shù)和遺傳距離，并進(jìn)行基于UPGMA法的聚類和主坐標(biāo)作圖。

表1 供試的41份大花三色堇種質(zhì)資源信息Table1 Basic information of 41pansy germplasms used in this study

采用STRUCTURE 2.3.4［21］對所有RSAP標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行Bayesian分析，推測合理組群數(shù)目及個(gè)體所在的組群。組群數(shù)目（K）設(shè)定為2～13，假定位點(diǎn)是獨(dú)立的，采用非混合模型（no admixture），將Length of Burn Period 設(shè)為5000，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）設(shè)定為50000，依據(jù)軟件計(jì)算的后驗(yàn)概率LnP（D）值計(jì)算△K值，繪制△K曲線圖。按照G.Evanno［22］提出的依據(jù)△LnP（D）最大值，推斷最合理的組群數(shù)目K。

表2 實(shí)驗(yàn)用10條RSAP引物Table2 10RSAP primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 RSAP引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

從45 對引物組合中篩選出26 對引物組合對41份材料PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明（表3），每對引物組合可擴(kuò)增出12～37條清晰條帶，26對引物組合共擴(kuò)增出588 條條帶；每對引物組合產(chǎn)生多態(tài)性條帶12～34條，平均單引物組合產(chǎn)生21.81條多態(tài)性條帶，26對引物組合共產(chǎn)生多態(tài)性條帶567條，多態(tài)性比率97.03%。18對引物組合的多態(tài)性條帶百分率為100%，對41份大花三色堇資源的鑒別能力為100%，意味著使用其中任何一個(gè)單引物組合可區(qū)分供試的所有種質(zhì)資源，占到引物組合總數(shù)的69%。其余引物組合的鑒別能力也在83%～98%之間，能區(qū)分大部分種質(zhì)。RSAP 引物有效等位位點(diǎn)數(shù)為1.18～1.63，平均為1.40，以R1－R9引物組合所得值最大。

表3 26對引物組合對41份大花三色堇擴(kuò)增結(jié)果Table3 Amplification results of 26RSAP primers on 41pansy accessions

2.2 大花三色堇種質(zhì)資源遺傳多樣性與聚類分析

利用POPGENE version 1.32軟件計(jì)算各位點(diǎn)Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon 信息指數(shù)，結(jié)果顯示，41份大花三色堇種質(zhì)的平均Nei’s遺傳多樣性指 數(shù) 為0.248 9；平 均Shannon 信 息 指 數(shù) 為0.395 1。高于自花授粉植物普通煙草遺傳多樣性指數(shù)0.157［23］，與異花授粉玫瑰的遺傳多樣性指數(shù)（0.266 5）和Shannon信息指數(shù)（0.403 3）［24］相近。

Bayesian分析結(jié)果表明，參試的41份大花三色堇種質(zhì)最合理組群數(shù)為6（表4）。依據(jù)“Q 值＞0.6視為譜系相對單一”的標(biāo)準(zhǔn)［25］，37份種質(zhì)（90%）可劃分到相應(yīng)的組群中，其中德國Sperli公司和美國泛美種子公司（除M－YC－1外）的所有種質(zhì)，及荷蘭花園種業(yè)3份種質(zhì)（HCG－X－1、HAR2和HAR2－1）和河南科技學(xué)院1份種質(zhì)（YB）歸屬組群Ⅰ；荷蘭花園種業(yè)的其余5份種質(zhì)歸屬組群Ⅱ；上海園林所所有種質(zhì)與酒泉金秋園藝和河南科技學(xué)院的絕大多數(shù)種質(zhì)歸屬組群Ⅲ；酒泉金秋園藝1 份種質(zhì)（229.07）和河南科技學(xué)院2份種質(zhì)（WH 和WO）歸屬組群Ⅳ；酒泉金秋園藝1份種質(zhì)（G11－5－1）歸屬組群Ⅴ；美國泛美1份種質(zhì)（M－YC－1）歸屬組群Ⅵ。酒泉金秋園藝3份種質(zhì)（G11－6－1、229.04和229.05）和河南科技學(xué)院的1份種質(zhì)（YL）在任何組群中的Q 值≤0.6，說明其譜系較為復(fù)雜。如果不考慮G11－5－1和M－YC－1，則絕大多數(shù)（35 份）種質(zhì)可歸屬為4個(gè)組群，大多數(shù)種質(zhì)的組群歸屬與其地理來源存在較高的相關(guān)性。

表4 41份大花三色堇種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)Table4 Genetic structure of 41pansy germplasms

圖1 41份大花三色堇的RSAP聚類圖Fig.1 Dendrogram of 41pansy accessions based on RSAP

基于Nei’s相似系數(shù)的的親緣關(guān)系分析表明，41份材料間的平均遺傳相似系數(shù)為0.522，其中來自德國Sperli的‘SRFY’與上海園林所的ER01親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)0.318；上海園林所的EWO 與河南科技學(xué)院自選的CW－1之間，酒泉金秋園藝的‘229.01’與‘229.14’之間的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)0.688。基于UPGMA 法的聚類結(jié)果顯示（圖1），在相似系數(shù)0.430處，41份材料可聚為三大類，其中美國泛美的‘M－YC－1’單獨(dú)為Ⅰ類；德國Sperli種質(zhì)和美國泛美的‘XXL－YB’聚為第Ⅱ類；其余37 份種質(zhì)為第Ⅲ類。第Ⅲ類在相似系數(shù)0.518 處，又可分為4 個(gè)亞類：荷蘭花園種業(yè)的‘HMB’單獨(dú)為A 亞類；河南科技學(xué)院YP 為B 亞類；C亞類包括了美國泛美和荷蘭花園種業(yè)的絕大多數(shù)種質(zhì)資源；D 亞類包括了上海園林所、酒泉金秋園藝及河南科技學(xué)院幾乎所有材料（除YP外）。聚類結(jié)果顯示，來源地相近的種質(zhì)絕大多數(shù)聚為一類，表明大花三色堇種質(zhì)遺傳多樣性基礎(chǔ)與來源地相關(guān)性較高。

2.3 不同地理來源大花三色堇種質(zhì)資源遺傳多樣性與聚類分析

為進(jìn)一步分析地理來源對大花三色堇種質(zhì)遺傳多樣性影響，綜合遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果和聚類結(jié)果，將41份材料按照地理來源劃分為4個(gè)種質(zhì)群：德國種質(zhì)群、美國種質(zhì)群、荷蘭種質(zhì)群和中國種質(zhì)群。從Shannon信息指數(shù)看（表5），從高到低依次為：中國種質(zhì)群＞荷蘭種質(zhì)群＞美國種質(zhì)群＞德國種質(zhì)群。從各地理種質(zhì)群Nei’s遺傳多樣性指數(shù)看，中國種質(zhì)群最大（0.238 5），其次為荷蘭種質(zhì)群（0.209 5），再次為美國種質(zhì)群（0.196 5），德國種質(zhì)群最?。?.057 8）。

4個(gè)地理種群遺傳相似系數(shù)范圍為0.854 4～0.963 6（表5），其中荷蘭與中國種質(zhì)群之間的遺傳相似系數(shù)最高，為0.963 6，遺傳距離最近；而德國和中國種質(zhì)群的遺傳相似系數(shù)最低，為0.854 4，遺傳距離最遠(yuǎn)。基于群體間的Nei’s遺傳相似系數(shù)，采用MVSP 軟件作出了地理群體間的三維坐標(biāo)圖（圖2），從圖2可見，荷蘭種質(zhì)群與中國種質(zhì)群相距最近，其次為美國種質(zhì)群，德國種質(zhì)群相距其他種質(zhì)群較遠(yuǎn)。

2.4 不同花色大花三色堇種質(zhì)資源的遺傳多樣性

為了解大花三色堇花色的種質(zhì)資源遺傳多樣性，將41份材料按花色劃分為6個(gè)花色群：黃色群、藍(lán)色群、白色群、紅色群（包括粉色）、紫色群和黑色群。經(jīng)Popgene version 1.32軟件計(jì)算得到大花三色堇6 個(gè)花色群Shannon 信息指數(shù)變化范圍為0.199 4～0.364 9（表6），各花色群多樣性指數(shù)由高到低依次為：白色群、紫色群、紅色群、紫色群、藍(lán)色群、黑色群?？傮w來看，白色群Shannon信息指數(shù)要高于其他花色群，說明白色群的遺傳多樣性較為豐富；而黑色群和藍(lán)色群的Shannon 信息指數(shù)相對偏低，遺傳多樣性較低。

表5 大花三色堇4個(gè)地理種質(zhì)群間的Nei’s遺傳相似系數(shù)（對角線上方）、遺傳距離（對角線下方）和Shannon 信息指數(shù)Table5 Nei’s genetic similarity coefficient（above diagonal），genetic distance（below diagonal）and Shannon information index among the four groups of pansy populations separated by geographical distributions

圖2 4個(gè)大花三色堇地理種質(zhì)群三維分布圖Fig.2 3－dimension distributions of four pansy geographical groups

圖3 大花三色堇6個(gè)花色群的RSAP聚類圖Fig.3 RSAP dendrogram of 6pansy groups divided by flower color

表6 大花三色堇6個(gè)花色群體間Nei’s遺傳相似系數(shù)（對角線上方）、遺傳距離（對角線下方）和Shannon信息指數(shù)Table6 Nei’s genetic similarity coefficient（above diagonal），genetic distance（below diagonal）and Shannon information index among six pansy groups separated by flower color

6個(gè)花色群的遺傳相似系數(shù) 為0.883 6～0.992 4（表6），其中白色群體與黃色群體、白色群體與紫色群體間的遺傳相似系數(shù)在99%以上；而藍(lán)色群和黑色群的遺傳相似系數(shù)最低，為0.883 6。基于各花色群體間Nei’s遺傳相似系數(shù)聚類結(jié)果顯示（圖3），在遺傳相似系數(shù)0.964處，6個(gè)花色群聚成3類，其中，黑色群體單獨(dú)為一類，黃色和藍(lán)色群體聚為一類，紅色、白色和紫色群體聚為一類。

3 討 論

3.1 RSAP在種質(zhì)資源多樣性分析中的適用性

操作簡便、重復(fù)性高、在基因組分布均勻、成本低是理想DNA 標(biāo)記的重要內(nèi)容［26］。以揭示基因組限制性位點(diǎn)多態(tài)性為目的的RSAP 標(biāo)記系統(tǒng)與RFLP和AFLP 相比，操作更簡便，只需一步PCR就能完成，但具有與AFLP和SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）相媲美的產(chǎn)率［27］。在三色堇上，本研究單次RSAP－PCR可擴(kuò)增12～37條帶，明顯優(yōu)于RAPD標(biāo)記［28］，與SRAP－PCR 擴(kuò)增的13～30 條帶［8］相近。由于SRAP 僅檢測基因開放閱讀框區(qū)（ORF）多態(tài)性［29］，而RSAP檢測的限制性位點(diǎn)在基因組分布更加廣泛，因此對基因組變異的反映會(huì)更全面，分析效力可能更高。這一推斷在辣椒［27］和三色堇遺傳多樣性分析中均得到印證。例如，王濤等［8］在對43份三色堇和角堇的SRAP分析中，篩選的21對引物組合中6對鑒別能力達(dá)到100%；而本研究采用RSAP 對41 份大花三色堇的分析顯示，26對引物組合中就有18對引物組合（69.2%）的鑒別能力達(dá)到了100%。從分析成本來看，SRAP 獲得了500條多態(tài)性條帶，合成了引物19條引物；而RSAP合成10 條引物，即獲得了567 條多態(tài)性條帶，應(yīng)用成本上更低。綜上所述，在種質(zhì)資源多樣性分析上RSAP具有一定優(yōu)勢。當(dāng)然，SRAP 標(biāo)記的優(yōu)勢在于，發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的DNA 標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)基因的定位、克隆或標(biāo)記輔助選擇［26］。

3.2 大花三色堇種質(zhì)資源多樣性與種質(zhì)交流

從遺傳多樣性來看，大花三色堇種質(zhì)的多樣性指數(shù)高于自花授粉植物普通煙草［23］，接近異花授粉植物玫瑰［24］，這與大花三色堇的異花授粉習(xí)性［28］相一致。同為異花授粉植物，玫瑰栽培歷史久，遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新時(shí)間長；三色堇栽培時(shí)間相對短［1］；但由于三色堇常用做一二年栽培，有性雜交造成的基因重組頻繁，可能是其在遺傳多樣性上與玫瑰接近的主要原因，這也反映出近百年來大花三色堇的育種成就比較突出。

基于Bayesian 的遺傳結(jié)構(gòu)分析和基于Nei’s相似系數(shù)的聚類結(jié)果均表明，來源地相同或相近的大花三色堇種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近，這與杜曉華等［3］基于表型的聚類結(jié)果和王健等［7］采用RAPD的研究結(jié)論一致，說明大花三色堇的種質(zhì)交流存在一定的地域限制。原因可能在于：當(dāng)前大花三色堇育種主要集中在德國、美國和日本等幾家種子公司，為了自身利益，延長品種使用壽命，各公司無形中限制了種質(zhì)交流。來源于國內(nèi)幾個(gè)單位的種質(zhì)親緣關(guān)系較近，反映了國內(nèi)資源在遺傳多樣性上仍存在一定的局限性，需要繼續(xù)加強(qiáng)種質(zhì)資源的引進(jìn)和創(chuàng)新。中國種質(zhì)群與德國種質(zhì)群的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示應(yīng)要加強(qiáng)德國種質(zhì)的引進(jìn)。

3.3 花色遺傳多樣性

有關(guān)花色研究表明，花色素的形成是一個(gè)復(fù)雜的生化代謝過程，涉及許多不同基因編碼的酶。此外，花色的呈現(xiàn)還受花瓣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞液pH 等多種因素的影響［30］。因此不同花色類型的遺傳基礎(chǔ)不同。本研究通過DNA 標(biāo)記對三色堇花色遺傳多樣性分析表明，大花三色堇白色群體的遺傳多樣性指數(shù)最高，說明白色在三色堇中的遺傳基礎(chǔ)廣泛，這可能與三色堇為自然早春開花植物，因授粉媒介的關(guān)系白色類型花占主導(dǎo)地位［31］。大花三色堇黑色群體的遺傳多樣性指數(shù)較低，說明黑色類型品種培育在大花三色堇品種選育中受到一定制約。

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