李 波，王 娟，楊 洋，范 玲＊

（1 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊830091；2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊830091）

蛋白質(zhì)組研究是一種分子生物學(xué)研究方法，并在棉花纖維發(fā)育機(jī)制研究方面已取得較大進(jìn)展，但利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究棉花纖維發(fā)育的報道很少。與基因組學(xué)的遺傳標(biāo)記相比，由于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對象是基因表達(dá)的產(chǎn)物，是介于基因型和表型之間的特性，因而蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記是聯(lián)系基因多樣性和表型多樣性的紐帶，具有獨(dú)特的意義。

棉纖維是由胚珠表皮細(xì)胞發(fā)育而形成的單細(xì)胞纖維，起始分化后迅速伸長，一般不再分裂，最終纖維長度可達(dá)細(xì)胞纖維直徑數(shù)千倍［1］。棉花纖維形成和發(fā)育過程可分為：纖維原始細(xì)胞分化和突起（起始期）、初生壁伸長、次生壁增厚和脫水成熟4個相互重疊的時期［2－3］。在每個發(fā)育時期棉纖維都具有不同的內(nèi)容和特點(diǎn)，分別決定著纖維的不同性狀，但相鄰時期沒有截然區(qū)分的界限，并且有所重疊［3］。Graves等［4－5］最早利用雙向電泳研究了棉花胚珠或纖維的蛋白差異圖譜，分別比較了－3DPA（開花后天數(shù)）、－2DPA 和2DPA 胚珠的差異，從而確定了棉纖維起始發(fā)育的開始。Turley［6］利用雙向電泳技術(shù)，在離體培養(yǎng)時產(chǎn)生纖維的胚珠中發(fā)現(xiàn)了5個特異表達(dá)蛋白。Ferguson 等［7］比較了纖維發(fā)育伸長期棉纖維的蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)了46個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并鑒定了其中2個蛋白質(zhì)點(diǎn)。近年來，中國棉花研究者也利用雙向電泳研究蛋白質(zhì)與棉纖維發(fā)育的關(guān)系。劉康等［8］和徐子健等［9］對棉花纖維蛋白質(zhì)的提取方法和雙向電泳條件等進(jìn)行了初步探索和改良。有研究者比較了5～25DPA 棉花胚珠和纖維2－DE圖譜差異發(fā)現(xiàn)，在整個纖維發(fā)育中大約有1 600個蛋白點(diǎn)處于穩(wěn)定表達(dá)水平［10－11］。

棉纖維蛋白質(zhì)組中有相當(dāng)多的蛋白質(zhì)是隨不同發(fā)育階段而差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與不同時期纖維的各種變化密切相關(guān)。研究這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能及其與纖維發(fā)育之間的關(guān)系，有利于闡述棉纖維伸長和次生壁增厚的分子調(diào)控機(jī)制。本研究以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系‘徐州142’為實(shí)驗(yàn)材料，采取5、10、15、20、25和30DPA 分別代表細(xì)胞分化期、初生壁伸長高峰期、初生壁合成向次生壁合成轉(zhuǎn)變前期、中期、末期以及次生壁增厚期等6個不同時期的棉纖維，比較不同時期棉纖維蛋白質(zhì)組2－DE圖譜，對其可能的功能進(jìn)行討論，以了解不同發(fā)育階段差異表達(dá)蛋白質(zhì)及其功能與纖維發(fā)育之間的關(guān)系，為棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為陸地棉‘徐州142’（Gossypium hirsutum L.cv.Xuzhou 142），種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯試驗(yàn)基地，取5、10、15、20、25和30DPA 棉鈴，剝除棉籽置－70 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 不同階段棉纖維蛋白的提取 取棉花纖維，去除棉籽，于液氮中迅速研磨成細(xì)粉狀，加入3倍體積的蛋白提取緩沖液［500 mmol／L Tris－HCl（pH 8.0），50 mmol／L EDTA，700 mmol／L 蔗 糖，2%PVP－40，1mmol／L PMSF］，漩渦，在冰浴上靜置10 min；加入等體積Tris飽和酚，溶液在室溫下混勻10min；4 ℃、12 000×g離心10min，將酚相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積蛋白提取緩沖液，漩渦，在冰浴上靜置3min后離心；取酚相，在酚相中加入5倍體積的甲醇－醋酸銨，－20 ℃過夜，進(jìn)行蛋白沉淀；4 ℃、12 000×g離心10min，收集沉淀，用甲醇－醋酸銨溶液洗滌3次，然后用冷丙酮洗滌1次，真空干燥蛋白，－70 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?2－13］。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度測定 蛋白質(zhì)濃度測定參考Bradford［14］的方法。在595nm下測定吸光度值A(chǔ)595，重復(fù)3次求吸光度平均值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 雙向電泳 采用Protean IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)（Bio－Rad），條件略有改變，取適量蛋白樣品加裂解液至總體積為400μL，沿IPG 膠條槽緩慢均勻加入，將IPG 膠條膠面朝下覆蓋在樣品上，在膠面上加少許礦物油，置于Protean IEF Cell型電泳儀上，20℃恒溫進(jìn)行，50V 主動水化12h后，250V 30min；500V1h；1 000V30 min；5 000 V1h，10 000V5h；最后穩(wěn)壓在10 000V 進(jìn)行等電聚焦，總電壓時間積為60 000Vh時結(jié)束電泳。第一向等電聚焦結(jié)束后，將IPG 膠條放于2.5mL 膠條平衡緩沖液I中振蕩平衡15min，再轉(zhuǎn)入2.5mL 膠條平衡緩沖液II中振蕩平衡15min。

用PROTEAN XL（Bio－Rad）垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行第二向電泳。平衡完后將膠條轉(zhuǎn)移到12%SDSPAGE凝膠上，用瓊脂糖封膠，以120 V 電壓進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)移至凝膠底部時停止電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色方法［8］進(jìn)行凝膠染色。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列Table1 Primer sequences applied in this study

1.2.4 RNA提取與cDNA第一鏈合成 采用熱硼酸－蛋白酶K 法提取各時期棉纖維的總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，首先將RNA與隨機(jī)引物混合，在PCR 儀上72 ℃變性5min后，及時暫停冰上依次后續(xù)組分，混勻后于25 ℃復(fù)性5 min，42 ℃延伸60min，70 ℃加熱15min 使反轉(zhuǎn)錄酶失活，cDNA 產(chǎn)物于－20 ℃保存。

1.2.5 半定量RT－PCR 利用半定量RT－PCR 方法，以5、10、15、20和25DPA 棉花纖維反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，檢測GhMDH、GhSAM、GhPGK1、GhCSD和GhFB在10 和25DPA 棉纖維中的表達(dá)情況。根據(jù)Mascot搜索結(jié)果，利用DNAMAN6.0軟件根據(jù)目的蛋白的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物序列和退火溫度如表1。以GhUBI（登錄號AY18997）作為內(nèi)標(biāo)基因，擴(kuò)增引物為GhUBI－F和GhUBI－R。GhUBI與目的基因同機(jī)分管擴(kuò)增。20μL 體系中含cDNA（20ng／μL）1μL，2×Mix 10μL，引物（25 μmol／L）0.5μL，ddH2O 8μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，共28個循環(huán)；72 ℃延伸10min。PCR產(chǎn)物置1%瓊脂糖中電泳，用紫外凝膠成像儀（Bio－Rad）觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同階段棉花纖維總蛋白含量的變化

利用Bradford法，根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白的百分含量。結(jié)果表明，在棉纖維發(fā)育過程中，蛋白的百分含量呈動態(tài)變化（圖1）。在5DPA 棉花纖維中，總蛋白含量最高達(dá)到11.7%，其后隨著發(fā)育時期的發(fā)展，總蛋白含量逐漸降低。這一結(jié)果與棉纖維發(fā)育過程中生理變化相關(guān)，在棉纖維快速延伸階段（5～15 DPA）和次生壁增厚階段（20～30 DPA），纖維迅速增加，蛋白含量降低。

圖1 棉纖維發(fā)育過程中總蛋白百分含量的動態(tài)變化Fig.1 The dynamic variation analysis during the cotton fiber development

圖2 不同時期棉纖維總蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 The dynamic variation analysis during the cotton fiber development

2.2 不同發(fā)育階段棉纖維總蛋白SDS－PAGE分析

利用飽和酚－甲醇醋酸銨法，分別提取6個不同時期棉纖維總蛋白，并利用SDS－PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖2）顯示，這6個時期都可提取出蛋白，且在分子量50kD左右蛋白含量較多，條帶較亮。

2.3 不同發(fā)育階段棉纖維蛋白的2－DE圖譜比較

6個不同時期棉纖維蛋白質(zhì)組的2－DE 圖譜共檢測到1 000多個蛋白質(zhì)點(diǎn)。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，比較了6個樣品2－DE 圖譜中15個差異點(diǎn)（圖3）。在NCBI上進(jìn)行數(shù)據(jù)查詢，分別是F－box家族蛋白、肌動蛋白、β－微管蛋白、F1－ATP 合成酶、ATP 酶β亞基、膜聯(lián)蛋白、磷酸甘油酸酯激酶I、胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶、S－腺苷－L－高半胱氨酸水解酶、谷氨酰胺合成酶、Cu／Zn超氧化物歧化酶、profilin、4－香豆酸輔酶A 連接酶。選取5個在不同樣品中表達(dá)量差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)在不同發(fā)育時期的表達(dá)有所不同，蛋白點(diǎn)1只在20～30 DPA 時期表達(dá)，蛋白點(diǎn)14只在15～30DPA 時期表達(dá)，其它3個蛋白點(diǎn)在不同發(fā)育時期表達(dá)量都不同，說明不同發(fā)育時期纖維的蛋白質(zhì)在不同時期表達(dá)量不同，其中一部分蛋白在特定時期不表達(dá)，這是蛋白質(zhì)以適應(yīng)不同纖維發(fā)育時期纖維細(xì)胞活動的需要。

2.4 部分差異蛋白在不同發(fā)育階段的表達(dá)量分析

利用PDQuest 8.0.1 軟 件 對 其 中5 個 差 異 點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶（GhMDH）存在于棉纖維發(fā)育的各個時期，并且隨著纖維的發(fā)育表達(dá)量升高；S－腺苷－L－高半胱氨酸水解酶（Gh－SAM）同樣存在于棉花纖維發(fā)育的各個階段，其在15DPA 表達(dá)量最高；胞質(zhì)磷酸甘油酸酯激酶I也存在于整個棉纖維發(fā)育階段，在10DPA 時表達(dá)量最高（GhPGK1），之后隨著時間的增加蛋白的表達(dá)量逐漸減少；Cu／Zn 超氧化物歧化酶（GhCSD）從15 DPA 開始表達(dá)，并且隨著纖維的發(fā)育含量逐漸增加；F－box家族蛋白（GhFB）在棉纖維的伸長期未見表達(dá)，其于20DPA 開始表達(dá)，含量隨著時間的增加而升高（圖4）。

2.5 部分差異蛋白的qRT－PCR分析

利用qRT－PCR 方法，分析5 種蛋白基因在棉纖維發(fā)育不同時期的表達(dá)情況（圖5）。S－腺苷－L－高半胱氨酸水解酶基因（GhSAM）在10DPA 棉花纖維中表達(dá)量相對較高；胞質(zhì)磷酸甘油酸酯激酶I基因（GhPGK1）在2 0DPA棉纖維中表達(dá)量相對較高；Cu／Zn 超氧化物歧化酶基因（GhCSD）在15 DPA 棉纖維中表達(dá)量相對較高；胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因（GhMDH）和F－box家族蛋白基因（GhFB）在25DPA 棉纖維中表達(dá)量最高。

圖3 不同發(fā)育時期棉花纖維蛋白的2－DE圖譜分析Fig.3 The 2－DE analysis during the different cotton fiber development stages

圖4 部分差異蛋白在不同發(fā)育階段的表達(dá)量Fig.4 The protein expression quantity analysis during the cotton fiber development stages

圖5 棉纖維不同發(fā)育時期部分基因的qRT－PCR表達(dá)分析Fig.5 The genes expression analysis at the different cotton fiber development stages

3 討 論

纖維生長是棉花發(fā)育周期中一個主要的過程，尤其是在次生壁增厚階段產(chǎn)生94%左右的纖維素。之前研究中，利用MADLI－TOF－MS 對延伸初期（10DPA）和次生壁合成中期（25DPA）的差異蛋白進(jìn)行了初步鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果，對6個不同發(fā)育階段的棉纖維蛋白進(jìn)行2－DE 分析，并對部分蛋白進(jìn)行了蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上的比較。

胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶（MDH）是蘋果酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，而蘋果酸在棉花纖維發(fā)育過程中起著重要的作 用，Dhindsa［15］和Basra［16］發(fā)現(xiàn)棉纖維延伸初期蘋果酸含量顯著提升，在次生壁合成初期開始減少。而Ferguson等［7］則認(rèn)為，從棉花纖維延伸到次生壁合成過程中，蘋果酸脫氫酶的活性逐漸增加；佘義斌等［17］研究發(fā)現(xiàn)，S－腺苷－L－高半胱氨酸水解酶基因隨著纖維伸長的發(fā)育進(jìn)程，表達(dá)量逐漸減弱；胞質(zhì)磷酸甘油酸酯激酶I是在糖酵解途徑中為纖維的延伸提供能量的關(guān)鍵酶［9］；Cu／Zn超氧化物歧化酶與棉花纖維次生壁發(fā)育相關(guān)［18］；F－box family蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動［19］。另外，F(xiàn)－box家族蛋白還通過其它作用方式參與了體內(nèi)眾多生化過程［20］。

本研究分別在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上對部分差異蛋白在棉花纖維發(fā)育過程中的作用進(jìn)行了分析和討論。結(jié)果顯示，在蛋白水平上，胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶、Cu／Zn超氧化物歧化酶以及F－box家族蛋白在棉花纖維次生壁增厚階段表達(dá)量明顯增加，推測其可能在棉花纖維次生壁發(fā)育階段起重要作用。在轉(zhuǎn)錄水平上，存在著和蛋白水平不一致的結(jié)果，可能是由于真核生物在轉(zhuǎn)錄與翻譯不同時也不同地，基因組與染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有著更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。真核生物的基因表達(dá)具有多層次性，可發(fā)生在染色質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄起始水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平以及翻譯后水平［21］；另外，在多肽鏈加工折疊為蛋白質(zhì)的過程中，經(jīng)過不同修飾加工的蛋白質(zhì)其穩(wěn)定性會有差異。

棉纖維發(fā)育是一個經(jīng)歷時間長、形態(tài)和生理等發(fā)生劇烈變化的過程，研究不同時期棉纖維蛋白的動態(tài)變化，可以將不同發(fā)育時期纖維的形態(tài)和生理變化與相關(guān)蛋白的活動聯(lián)系起來，從而了解這些變化的分子機(jī)制，最終為纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的遺傳工程改良提供依據(jù)。由于棉纖維細(xì)胞壁隨著細(xì)胞的發(fā)育而逐漸增厚，使得棉纖維細(xì)胞不易破碎，為實(shí)驗(yàn)帶來一定的難度，且隨著時間變化蛋白含量逐漸減少。

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