田松青，朱旭東，趙沿海，原海燕，顧春筍，黃蘇珍

（1 蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州215008；2 中國(guó)科學(xué)院 植物研究所南京中山植物園，南京210014；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京210095）

植物絡(luò)合素（phytochelatin，PCs）是以谷胱甘肽（GSH）為底物通過植物絡(luò)合素合酶（phytochelatin synthase，PCS，包括PC2、PC3等）催化而成［1］，能與重金屬結(jié)合成復(fù)合體而對(duì)重金屬解毒起著重要作用［2－4］。目前植物絡(luò)合素合酶基因（PCS）已在擬南芥［5］、小麥［1］、芥菜［6］、大蒜［7］、生菜［8］、百脈根［9］、豆梨［10］、蕃茄［11］、毛白楊［12］和湖北海棠［13］等植物中分離得到，已分離PCS的功能驗(yàn)證初步證明其在植物重金屬鉛螯合解毒過程起重要作用。過表達(dá)小麥絡(luò)合素合酶基因（TaPCS1）的木立煙草（Nicotiana glaucaR.Graham）植株大大增加鉛（Pb）耐受性，比野生型植物幼苗根長(zhǎng)160%；生長(zhǎng)在礦區(qū)土壤中的轉(zhuǎn)基因植株的Pb濃度達(dá)1 572mg／kg，是野生型的2倍［14］。Lombi等［15］證明與PCs合成和絡(luò)合相關(guān)的螯合Pb能增加耐Pb植物的耐性。Pb超富集植物水生蕨類Salviniaminima體內(nèi)PCs的合成量與Pb積累量有著直接關(guān)系，推論植物螯合肽絡(luò)合作用是 耐Pb機(jī)制之一［16］。香根草（Vetiveriazizanioides）在添加外源PCs 的條件下，體內(nèi)形成PCs－Pb復(fù)合物，根和地上部可以累積到19 800 和3 350 mg／kg［17］。在礦區(qū)實(shí)地試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)TaPCS1的歐美雜種山楊（Populustremula×tremuloides）品種‘Etrepole’轉(zhuǎn)基因株系的總生物量及Pb積累量顯著高于對(duì)照植株［18］。但是，不同物種植物螯合肽所起的作用差異較大，如PCs在蠶豆Pb耐性中所起作用很?。?9］，Pb富集植物礦山生態(tài)型東南景天（Sedumalfredii）在Pb脅迫下沒有誘導(dǎo)PCs合成［20］。在Pb 脅迫下金魚藻（CeratophyllumdemersumL.）體內(nèi)的GSH、Cys有所增加和誘導(dǎo)PC2、PC3螯合肽合成［21］。Gupta等［2］報(bào)道GSH（PCs的合成前體）在東南景天Pb 解毒的作用，雖然這一過程沒有任何誘導(dǎo)PCs，這說明GSH在沒有PCs 產(chǎn)生的條件下也能擔(dān)任重要的解毒功能。

路易斯安那鳶尾（Louisiana iris）是一類觀賞價(jià)值很高的宿根植物，具有一定的吸收和忍耐重金屬Pb的能力［22］，目前相關(guān)路易斯安那鳶尾PCS基因的研究尚未見報(bào)道，且該基因在重金屬Pb 螯合解毒等中的研究非常有限。本研究測(cè)定Pb處理前后根系、根狀莖和葉片中Pb含量變化，探討路易斯安那鳶尾吸收和忍耐重金屬Pb的能力。并利用在轉(zhuǎn)錄組序列分析和RNA－Seq技術(shù)檢測(cè)初步篩選出差異表達(dá)的易斯安那鳶尾LiPCS1 基因片段，通過RACE技術(shù)克隆獲得全長(zhǎng)，熒光定量RT－PCR 技術(shù)分析其不同時(shí)間Pb 處理和組織特異性表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證其富集鉛生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)［22］和生理生化［23］特性，為探討路易斯安那鳶尾品種Pb富集耐性的分子機(jī)理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為路易斯安那鳶尾品種‘Professor Neil’，由美國(guó)引進(jìn)。試驗(yàn)于2013年9月在南京中山植物園溫室進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1 鉛含量測(cè)定 選擇生長(zhǎng)一致的路易斯安那鳶尾分株苗，置于50% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，30d后生根達(dá)3cm 以上長(zhǎng)度后，移栽于2L 塑料盆，換成10% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。Pb 以Pb（NO3）2形式加入，濃度分別為0、200、400及600 mg／L，重復(fù)3次，每周換1 次處理液。處理后1 個(gè)月取樣，用HNO3－HClO4消化法和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP，Perkin－Elmer 3300DV）測(cè)定植株體內(nèi)各部分Pb 含量。采用Excel2010 和SPSS19 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，用鄧肯多重比較。

1.2.2 路易斯安那鳶尾LiPCS1基因克隆 （1）總RNA 提取 路易斯安那鳶尾幼苗用1／2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培預(yù)培養(yǎng)30d，采集新鮮葉片和根系。根據(jù)Trizol plus試劑說明書，用新鮮葉片和根系提取總RNA。

（2）克隆LiPCS1基因中間序列 從路易斯安那鳶尾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出LiPCS1基因相關(guān)序列片段信息（comp152611＿c0＿seq5），根據(jù)GenBank中已登錄的PCS同源基因的核苷酸和氨基酸序列，利用Clustal W 軟件在線比對(duì)其序列同源性和分析保守區(qū)域；利用Primer 5和Oligo 7 軟件根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中的信息和網(wǎng)上保守區(qū)序列設(shè)計(jì)中間產(chǎn)物引物（表1）。使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA 第1 條鏈，即cDNA。再以cDNA 經(jīng)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增中間片段，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s、50℃退火40s、72℃延伸50s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 擴(kuò)增得到LiPCS1 基因中間產(chǎn)物并進(jìn)行電泳切膠回收，然后連接到載體上，轉(zhuǎn)化后對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

（3）LiPCS1 基因3′端序列的克隆利用Primer 5和Oligo 7 軟件，根據(jù)測(cè)序獲得的中間序列設(shè)計(jì)3′端特異PCR 引物（表1）。采用Clontech公 司 的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3′端序列。

（4）LiPCS1 基因5′端序列的克隆利用Primer 5和Oligo 7軟件，根據(jù)測(cè)序獲得的中間序列設(shè)計(jì)5′端正向PCR 引物和反向特異PCR 引物（表1）。采用Invitrogen 公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒獲得LiPCS1基因的5′端序列。

表1 基因克隆和qRT－PCR所用引物序列Table1 Primers used for gene cloning and qRT－PCR

（5）序列拼接 采用DNAMAN 軟件對(duì)克隆得到的5′端、3′端和中間序列進(jìn)行首尾拼接，得到LiPCS1基因的全序列。

1.2.3LiPCS1編碼蛋白和生物信息學(xué)分析 使用Oligo 7 軟件分析該基因編碼的氨基酸序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取與LiPCS1基因編碼的氨基酸序列blastp相似度大于80%的植物同源氨基酸序列，通過Clustal W 軟件分析LiPCS1 基因編碼的氨基酸序列的保守性，并基于此基因編碼的氨基酸序列、利用MEGA 6軟件中的泊松分布模式構(gòu)建相似植物的系統(tǒng)樹。采用SOPMA 軟件在線分析LiPCS1基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過TMHMM 2.0軟件在線分析該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。將克隆到的LiPCS1基因序列采用MEGA6軟件比對(duì)其親緣關(guān)系。LiPCS1蛋白保守結(jié)構(gòu)域通過pfam（http：／／pfam.xfam.org）在線分析完成。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在http：／／swissmodel.expasy.org 上進(jìn)行，并通過http：／／www.ebi.ac.uk／Inter－ProScan 尋找該類蛋白在不同物種中的分布。

1.2.4LiPCS1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集路易斯安那鳶尾的根、莖、葉和花等不同組織的新鮮樣品各3份，同時(shí)選取植株大小和長(zhǎng)勢(shì)一致的分株苗進(jìn)行不同時(shí)間長(zhǎng)度（0、1、3、6、12和24h）鉛（濃度為200 mg／L）的處理，重復(fù)3次，處理后收集新鮮的根系和葉片。收集的樣品于液氮中速凍，之后保存于－80 ℃超低溫冰箱備用。使用試劑盒提取上述樣品總RNA，用隨機(jī)引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR GREEN 染料法，以UBC 為內(nèi)參基因，根據(jù)已克隆的基因序列用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物（表1），做相對(duì)定量檢測(cè)。將毛細(xì)管置于定量PCR 儀（Roche公司）中，設(shè)定熒光采集通道以及讀取熒光步驟，按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR 反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性30s；94 ℃變性20s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30s循環(huán)45次，72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)；最后加入溶解曲線程序：95℃0s，60℃15s，95℃0s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平采用2－△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)處理同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 路易斯安那鳶尾對(duì)Pb的吸收

從圖1可以看出，路易斯安那鳶尾根系、根狀莖和葉片Pb 含量隨Pb濃度的增加而增加，并以根系Pb含量最大，葉片最小。根系在低濃度200 mg／L Pb處理時(shí)積累量為33 050 mg／kg，與對(duì)照差異顯著；而在Pb濃度400和600mg／L 時(shí)增加不顯著，600mg／L 時(shí)達(dá)到最大值（36 255.8mg／kg）。根狀莖在200mg／L Pb處理時(shí)與對(duì)照差異顯著，在600 mg／L時(shí)達(dá)到最大（1 665mg／kg），各濃度處理都差異顯著。葉片與根狀莖接近，低濃度時(shí)對(duì)Pb 積累非常小，在Pb 200mg／L 時(shí)僅為64.6mg／kg，沒有顯著差異；在高濃度Pb 600 mg／L 時(shí)達(dá)到最大值（1 249.8mg／kg），與對(duì)照差異顯著。

2.2 LiPCS1基因全長(zhǎng)及生物學(xué)信息分析

2.2.1 基因全長(zhǎng)及編碼蛋白質(zhì) 擴(kuò)增到路易斯安那鳶尾LiPCS1基因的中間片段1 151bp（圖2，a）。根據(jù)獲得的中間片段序列，設(shè)計(jì)特異引物，3′－RACE擴(kuò)增得到343bp 片段（圖2，b）。5′－RACE擴(kuò)增得到335bp片段（圖2，c）。用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列拼接后得到基因完整序列（圖3），其總長(zhǎng)1 683bp，GenBank登錄號(hào)為KT347093，其開放閱讀框（ORF）為1 503bp，5′非編碼區(qū)76bp，3′非編碼區(qū)105bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)含501aa（圖3）。

與其他植物PCS基因類似，路易斯安那鳶尾LiPCS1基因編碼產(chǎn)物由N 端（4 個(gè)氨基酸）、保守區(qū)（208 個(gè)氨基酸）和C 端可變區(qū)（289 個(gè)氨基酸）組成，氨基端高度保守，共含18 個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基，其中含有Cys－56、His－162 和Asp－182等3個(gè)必需的氨基酸活性位點(diǎn)，它們組成催化三聯(lián)體來起活性作用。C末端具有植物絡(luò)合素合酶的重金屬離子傳感器基序C368C369RMTC373VRC376（圖3）。

圖1 Pb脅迫下路易斯安那鳶尾各器官中Pb含量Fig.1 Pb contents in different organs of Louisiana iris with Pb treatment

2.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析 路易斯安那鳶尾LiPCS1基因編碼蛋白pfam 比對(duì)結(jié)果顯示，它具有2 個(gè)典型的植物絡(luò)合素亞家族結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是PCS 蛋白的典型特征結(jié)構(gòu)，表明了克隆的路易斯安那鳶尾LiPCS1所編碼的蛋白為植物絡(luò)合素合酶。通過SOPMA 軟件在線對(duì)路易斯安那鳶尾LiPCS1進(jìn)行分析，路易斯安那鳶尾LiPCS1蛋白是由α螺旋、延伸鏈和不規(guī)則螺旋等結(jié)構(gòu)元件組成，其中α螺旋占49.50%，延伸連占12.18%，不規(guī)則螺旋占38.32%。TMHMM 軟件在線分析LiPCS1蛋白質(zhì)不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不是膜蛋白。在http：／／swissmodel.expasy.org 上利用Automatic Modelling Mode預(yù)測(cè)了路易斯安那鳶尾LiPCS1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)與豆梨PcPCS1、擬南芥AtPCS1 和百脈根LjPCS1蛋白的三維結(jié)構(gòu)［10］進(jìn)行比較，認(rèn)為這4個(gè)蛋白具備類似的空間構(gòu)架。

2.2.3 蛋白質(zhì)保守性及進(jìn)化樹分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫直接搜索相關(guān)PCS1 氨基酸序列及利用LiPCS1序列采用blastp的方法，共從數(shù)據(jù)庫中篩選出10種同源氨基酸序列：油棕Elaeisguineensis（XP＿010935936.1）、海棗Phoenixdactylifera（XP＿008810429.1）、大蒜Alliumsativum（AAO13809.1）、葡萄Vitisvinifera（XP＿002272237.2）、蓮Nelumbonucifera（NP＿001289777.1）、蓖麻Ricinuscommunis（XP＿002529835.1）、小桐子Jatrophacurcas（XP ＿012085275.1）、甜 橙Citrussinensis（KDO60424.1）、擬南芥Arabidopsisthaliana（NP＿199220.1）和節(jié)節(jié)麥Aegilopstauschii（EMT23611.1）。利用Clustalw 軟件分析同源氨基酸序列，其氨基酸相似位點(diǎn)占83.1%（圖5中所有彩色部分字母表示氨基酸相似位點(diǎn)），氨基酸完全相同位點(diǎn)占34.0%（圖5中黃色部分字母表示氨基酸完全相同位點(diǎn)）。分析結(jié)果同時(shí)顯示，PCS1 蛋白N－端氨基酸保守性強(qiáng)，應(yīng)該是功能區(qū)域，C－端氨基酸序列變異性變化較大。PCS普遍存在于微生物、動(dòng)植物等不同物種中，表明不同物種共有PCS催化合成植物絡(luò)合素的這一生物途徑。

圖2 LiPCS1基因PCR 產(chǎn)物凝膠電泳Fig.2 PCR gel electrophoresis of LiPCS1

圖3 LiPCS1基因全長(zhǎng)及編碼氨基酸序列Fig.3 The full length of the LiPCS1gene and amino acid sequence

利用MEGA6分析這10種同源氨基酸序列同LiPCS1的進(jìn)化關(guān)系（圖4），反映了PCS1在植物進(jìn)化方面有一定的親緣關(guān)系一致性，如棕櫚科（油棕和海棗）。路易斯安那鳶尾LiPCS1 與海棗和油棕關(guān)系最近，與其他植物關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 LiPCS1不同組織表達(dá)特性分析

分別提取路易斯安那鳶尾根、莖、葉、外花瓣、內(nèi)花瓣、雄蕊和雌蕊的總RNA，OD260／OD280在1.9～2.0間，表明RNA 純度較好，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。如圖6所示，LiPCS1不同組織表達(dá)量為：內(nèi)花瓣＞雄蕊＞葉＞莖＞外花瓣＞根＞雌蕊，其中內(nèi)花瓣最高，與其他組織有顯著差異，雄蕊、葉和莖在同一表達(dá)水平，外花瓣、根和雌蕊表達(dá)較低，雌蕊最低。

2.4 LiPCS1響應(yīng)Pb脅迫的表達(dá)特性分析

圖4 LiPCS1同其他物種PCS1蛋白的進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic relationships between LiPCS1 and other plant PCS1s

鉛處理0、1、3、6、12和24h后，分別提取路易斯安那鳶尾的根系和葉片的總RNA 后，進(jìn)行熒光定量分析。如圖7所示，路易斯安那鳶尾LiPCS1基因在根系和葉片組織中的轉(zhuǎn)錄水平不同，在葉片中表達(dá)普遍比在根系中表達(dá)高。隨著鉛處理時(shí)間增加，LiPCS1基因在根系和葉片中表達(dá)量都表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，并均在鉛處理3h達(dá)到最大值，產(chǎn)生顯著差異，在24h時(shí)接近對(duì)照。

圖6 LiPCS1在路易斯安那鳶尾各組織中的表達(dá)Fig.6 Different expression of LiPCS1in various tissues of Louisiana iris

圖7 路易斯安那鳶尾LiPCS1受不同時(shí)間鉛脅迫后的表達(dá)模式Fig.7 Different expression patterns of LiPCS1in the leaves and roots of Louisiana iris after different time treatments with Pb

3 討 論

在Pb脅迫條件下，路易斯安那鳶尾‘Professor Neil’的根、根狀莖和葉片，Pb最大吸收量分別達(dá)到36 255.8、1 665.0和1 249.8mg／kg，符合鉛富集植物葉片或地上部（干重）含Pb達(dá)到1 000mg／kg 以上的條件，說明路易斯安那鳶尾具有一定的吸收和忍耐重金屬鉛的能力。路易斯安那鳶尾為成年分株苗，生物量大，特別是具有粗狀的根狀莖，積累了一定的營(yíng)養(yǎng)，可能對(duì)植株逆境抗性等方面起著十分重要的作用。

重金屬脅迫可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PCs并與之結(jié)合形成硫肽復(fù)合物，以降低對(duì)植物毒害。PCs的活性和植物耐重金屬能力與PCs中的Cys殘基的位置和排列方式關(guān)系密切［24－25］。本研究所克隆的路易斯安那鳶尾 LiPCS1 與 AtPCS1［5］、LjPCS1［9］和PcPCS1［10］等編碼蛋白，都含有Cys56、His162和Asp182等3個(gè)必需的氨基酸活性位點(diǎn)，它們組成催化三聯(lián)體起活性作用。其次，C 末端的CCXXXCXXC基序?yàn)橹参锝j(luò)合素合酶的重金屬離子傳感器［26］，也與螯合重金屬離子有關(guān)。AtPCS1、LjPCS1和PcPCS1表達(dá)蛋白分別表現(xiàn)為C358C359XXXC363XXC366、C368C369RETC373MKC376和C369C370QETC374VKC377，路易斯安那鳶尾LiPCS1 蛋白基序與LjPCS1一致的，這4個(gè)蛋白在生物體內(nèi)可能行使類似的功能。Cys358、Cys359、Cys363和Cys366點(diǎn)突變后的AtPCS1蛋白，在Cd2＋或Zn2＋存在條件下，植物絡(luò)合素合成能力下降［26］，從試驗(yàn)上證明了這一可能。

Ha等［5］研究AtPCS1基因在擬南芥中的表達(dá)規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論Cd2＋是否存在，AtPCS1 在根部的表達(dá)豐度均顯著高于葉片組織。與此略有不同的是，路易斯安那鳶尾LiPCS1在根中的表達(dá)豐度低于成熟葉片，表明PCS基因在不同植物之間具有不同的表達(dá)模式，葉片是路易斯安那鳶尾LiPCS1基因的主要合成部位，在開花時(shí)，內(nèi)花瓣和雄蕊表達(dá)特別高。熒光定量PCR 分析表明，路易斯安那鳶尾LiPCS1基因受重金屬鉛脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中在葉中的表達(dá)量顯著增加，大于在根中的增加量，這與豆梨PcPCS1［10］、蘿 卜RsPCS［27］和BnPCS1［28］基因的表達(dá)特征一致，而與小麥TaPCS1［28］的結(jié)果相反，這可能是因?yàn)槁芬姿拱材区S尾屬多年生根莖類水生植物，葉的生命周期只有一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，新葉不斷代替老葉，進(jìn)而保持較高的活力。

以上結(jié)果表明，路易斯安那鳶尾LiPCS1在保護(hù)其免受重金屬鉛毒害的過程中可能起到一定作用，但基因上調(diào)的倍數(shù)較低，還需構(gòu)建該基因的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥等植物對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。

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