洪 茜,劉木華,袁海超,彭義杰,李 耀,趙進(jìn)輝

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的鴨肉中螺旋霉素殘留檢測(cè)

洪 茜,劉木華,袁海超,彭義杰,李 耀,趙進(jìn)輝*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

利用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法結(jié)合自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘法(air-PLS)快速檢測(cè)鴨肉中的螺旋霉素殘留。首先采用OTR202作為SERS活性基底,確定了螺旋霉素的1 622 cm-1峰可以作為其在鴨肉提取液中殘留檢測(cè)的拉曼特征峰;然后,通過單因素分析法確定了實(shí)驗(yàn)的最佳條件,并在該條件下建立了螺旋霉素濃度范圍介于4.0～50.0 mg/L之間的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并獲得了良好的線性關(guān)系且線性回歸方程為y=26.681x+1233.5,決定系數(shù)R2=0.980 2,最低檢測(cè)限為4 mg/L,預(yù)測(cè)樣本的平均回收率為73.38%～105.25%。研究表明,采用SERS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)鴨肉中螺旋霉素殘留的快速檢測(cè)。

螺旋霉素;SERS;air-PLS;鴨肉

1 引 言

螺旋霉素(Spiramycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯類中譜抗生素,此類抗生素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和支原體具有較強(qiáng)的抗菌活性,近年來不僅被廣泛地作為治療藥物使用,而且為了提高經(jīng)濟(jì)效益已被普遍作為飼料添加劑以促進(jìn)禽畜生長(zhǎng)及預(yù)防疾病[1]。由于抗生素的濫用將直接危害人體的健康,因此其殘留問題已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前常用于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測(cè)的傳統(tǒng)方法主要有高效液相色譜法[2-3]、液質(zhì)聯(lián)用法[4-5]、微生物法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]等。這些方法檢測(cè)精度高、靈敏度好,但是樣品前處理復(fù)雜、成本高,不利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術(shù)通過采用特殊制備的表面粗糙金屬或溶膠作為活性基底,將被測(cè)分子吸附到基底表面,從而使其拉曼信號(hào)大幅增強(qiáng)[8]。SERS因其在痕量物質(zhì)檢測(cè)中有很大的優(yōu)勢(shì),近年來已經(jīng)引起廣大研究學(xué)者的關(guān)注。袁鑫等[9]利用SERS技術(shù)建立了辣椒粉中的蘇丹紅Ⅰ號(hào)的快速定量檢測(cè)模型;李言等[10]應(yīng)用SERS快速檢測(cè)赤蘚紅,并通過密度泛函理論計(jì)算了赤蘚紅的理論拉曼光譜,結(jié)果與實(shí)驗(yàn)拉曼光譜具有很好的對(duì)應(yīng)性;李春穎等[11]采用SERS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)水產(chǎn)品中的抗生素(氯霉素和磺胺甲基嘧啶)進(jìn)行了痕量殘留檢測(cè)。但目前還沒有將SERS應(yīng)用于鴨肉中螺旋霉素殘留檢測(cè)的報(bào)道。

本文對(duì)含有螺旋霉素的鴨肉提取液的SERS進(jìn)行了分析,并且研究了樣品加入量和吸附時(shí)間對(duì)其SERS信號(hào)的影響,建立了含有螺旋霉素的鴨肉提取液的標(biāo)準(zhǔn)曲線以實(shí)現(xiàn)鴨肉中螺旋霉素的快速檢測(cè)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

鴨肉(購(gòu)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng));螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度約為96.0%,購(gòu)于中國(guó)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng));OTR202、OTR103(購(gòu)于歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司);乙酸乙酯(分析純);超純水。

RamTracer-200-HS型便攜式激光拉曼光譜儀(歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司);T10型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(湖南科爾頓水務(wù)有限公司);JK-50B型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械有限公司); FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg,上海上平儀器有限公司);VORTEX-5型漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司);JW-1024型低速離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司);T6系列紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司);石英比色皿;石英進(jìn)樣瓶(北京成騰器材有限公司)。

2.2 樣品制備

鴨肉樣品前處理:向50 mL離心管中加入5 g攪碎的鴨肉和20 mL乙酸乙酯,漩渦振蕩2 min,超聲提取10min,4 500 r/min離心15min,取上清液。按上述步驟再重復(fù)提取1次,合并上清液, 4 500 r/min離心15 min,用快速濾紙過濾得實(shí)驗(yàn)用鴨肉提取液。

鴨肉提取液加標(biāo)樣本的配制:稱取10 mg螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品,用鴨肉提取液定容于100 mL棕色容量瓶中,得到濃度為100 mg/L的鴨肉提取液加標(biāo)儲(chǔ)備液。取不同體積的加標(biāo)儲(chǔ)備液用鴨肉提取液稀釋至8個(gè)不同濃度的鴨肉提取液加標(biāo)樣本溶液,其濃度范圍介于4.0～50.0 mg/L之間。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

拉曼光譜儀采用785 nm激光波長(zhǎng)、200 mW激光功率,光譜分析范圍為400～1 800 cm-1,分辨率為6 cm-1,積分時(shí)間為10 s,積分2次求平均。

分別改變待測(cè)樣品的加入量和吸附時(shí)間來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,分別采集含有螺旋霉素的鴨肉提取液、螺旋霉素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鴨肉提取液空白樣的SERS;在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,分別采集配制的8個(gè)鴨肉提取液加標(biāo)溶液樣本的SERS。所有光譜采集5次。

將500μL的OTR202、20μL的待測(cè)液和100 μL的OTR103依次加入至石英進(jìn)樣瓶中,均勻混合,再放至樣品池中采集拉曼光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 增強(qiáng)基底的紫外吸收光譜

金屬溶膠增強(qiáng)基底因制備簡(jiǎn)單、增強(qiáng)效果及穩(wěn)定性較好,已在表面增強(qiáng)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。目前,金溶膠和銀溶膠的研究較為普遍,雖然金的局域表面等離子體共振的能量與銀相比較低,但是金本身具有銀所不具備的優(yōu)勢(shì),即金的良好穩(wěn)定性和生物相容性[12]。因此,本研究選用納米金溶膠OTR202作為增強(qiáng)基底。圖1中曲線(a)所示為納米金溶膠的紫外-可見吸收光譜,其最大吸收峰的位置約位于544 nm處,半峰寬約為56 nm。曲線(b)為增強(qiáng)基底OTR202和活化劑OTR103與螺旋霉素水溶液混合后的紫外-可見吸收光譜,其最大吸收峰的位置約處于552 nm處,相比于OTR202的最大吸收峰位置紅移了8 nm,并且半峰寬變大。這可能是由于螺旋霉素分子吸附在納米金顆粒表面之后,其表面等離子體共振性質(zhì)發(fā)生變化,從而影響了納米金顆粒的尺寸大小或者聚集程度等因素[13]。

圖1 OTR202(a)和OTR202+螺旋霉素+OTR103(b)的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of OTR202(a)and OTR202+spiramycin+OTR103(b)

3.2 鴨肉中螺旋霉素的SERS分析

圖2為鴨肉提取液、螺旋霉素水溶液和含有螺旋霉素的鴨肉提取液的SERS對(duì)比圖。由圖中曲線(a)可知,鴨肉提取液的主要SERS特征峰位于1 208,1 248,1 372,1 556 cm-1處。由曲線(b)可知,螺旋霉素水溶液的主要SERS特征峰位于1 234,1 372,1 556,1 622 cm-1處。而由曲線(c)可知,含有螺旋霉素的鴨肉提取液主要在1 208, 1 248,1 372,1 556,1 622 cm-1處出現(xiàn)了SERS特征峰。經(jīng)對(duì)比不難發(fā)現(xiàn),在含有螺旋霉素的鴨肉提取液的SERS特征峰中,1 208 cm-1和1 248 cm-1兩者為鴨肉提取液的SERS峰,而1 372 cm-1和1 556 cm-1兩個(gè)SERS特征峰在鴨肉提取液和螺旋霉素水溶液中均有體現(xiàn),僅有位于1 622 cm-1處的SERS特征峰是螺旋霉素本身的SERS特征峰且未體現(xiàn)在鴨肉提取液中。因此,本研究將這個(gè)峰作為后續(xù)檢測(cè)螺旋霉素的主要SERS特征峰,這為實(shí)現(xiàn)鴨肉中螺旋霉素殘留的SERS分析提供了良好的依據(jù)。

圖2 鴨肉提取液(a)、螺旋霉素水溶液(b)與含有螺旋霉素的鴨肉提取液(c)的SERSFig.2 SERS of duck meat extract(a),spiramycin solution (b),and duckmeat extract containing spiramycin(c).

3.3 基于air-PLS的熒光背景扣除

為了更加直觀地對(duì)樣本的SERS信號(hào)進(jìn)行對(duì)比與研究,本文采用自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法(air-PLS)來實(shí)現(xiàn)拉曼光譜中的熒光背景扣除。近年來,air-PLS被提出用于校正拉曼光譜的基線漂移,它可全自動(dòng)地進(jìn)行光譜處理,不需要任何初始信息和人為干預(yù),即能有效扣除原始光譜中的熒光背景[14-15]。圖3中曲線(a)為含有螺旋霉素濃度為15.0 mg/L的鴨肉提取液的原始拉曼光譜,曲線(b)為通過air-PLS擬合的熒光背景,曲線(c)為對(duì)曲線(a)進(jìn)行熒光背景扣除后所得光譜。由圖3可知,該算法能在保留拉曼有用峰形的前提下有效扣除其中的熒光背景,減少熒光背景對(duì)光譜信息的影響。

圖3 air-PLS對(duì)熒光背景的扣除。(a)原光譜;(b)擬合熒光背景;(c)背景扣除后光譜。Fig.3 Fluorescence background subtraction by air-PLS.(a) Origin spectrum.(b)Fluorescence background fitted. (c)Spectrum after background subtraction.

3.4 樣品加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

研究發(fā)現(xiàn),待測(cè)樣品的加入體積不同會(huì)對(duì)SERS信號(hào)的強(qiáng)度產(chǎn)生一定的影響。將OTR202和OTR103的加入量固定為500μL和100μL,圖4為含螺旋霉素濃度為15.0 mg/L的鴨肉提取液的加入量為15,20,25,30μL時(shí)的SERS信號(hào)的變化情況。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),當(dāng)樣品加入量由15 μL增加至30μL時(shí),混合物溶液的SERS信號(hào)的1 622 cm-1峰呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),并且當(dāng)加入量為20μL時(shí),該峰的強(qiáng)度值最大。此過程中該峰值增強(qiáng)可能是由于樣品加入量越大,待測(cè)分子的數(shù)目就越多;而減弱則可能是因樣品量的增加導(dǎo)致溶劑乙酸乙酯的量也在增加,從而影響了待測(cè)分子與納米金顆粒的吸附[16]。因此,本研究確定了待測(cè)樣品的最佳加入體積為20μL。

圖4 樣品加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響。(a)15μL;(b) 20μL;(c)25μL;(d)30μL。Fig.4 Effect of the addition amount on SERS intensity.(a) 15μL.(b)20μL.(c)25μL.(d)30μL.

3.5 吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)的影響

實(shí)驗(yàn)采集了同一濃度的待測(cè)樣品與基底的吸附時(shí)間分別為1,5,10,15,20 min時(shí)的SERS。由圖5可知,當(dāng)吸附時(shí)間為1 min時(shí),混合物溶液的SERS信號(hào)在特征峰1 622 cm-1處強(qiáng)度最大,隨后逐漸減弱。這可能是由于當(dāng)納米金膠與待測(cè)樣品混合后會(huì)產(chǎn)生一定程度的聚集,從而產(chǎn)生決定SERS增強(qiáng)效果的活性熱點(diǎn)[14]。在本研究中,當(dāng)金納米顆粒聚集1 min時(shí)產(chǎn)生的活性熱點(diǎn)能與待測(cè)樣品結(jié)合產(chǎn)生最佳的增強(qiáng)效果。因此,實(shí)驗(yàn)確定最佳吸附等待時(shí)間為1 min。

圖5 吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)的影響。(a)1 min;(b)5 min;(c)10 min;(d)15 min;(e)20 min。Fig.5 Effectof adsorption time on SERS intensity.(a)1min. (b)5min.(c)10min.(d)15min.(e)20min.

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及預(yù)測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采集了含螺旋霉素濃度分別為4.0,10.0, 22.0,35.0,50.0 mg/L的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的SERS,我們以這5個(gè)濃度作為橫坐標(biāo),以其SERS的1 622 cm-1處的特征峰強(qiáng)度作為縱坐標(biāo),繪制成如圖6所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖可知,在含螺旋霉素的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的4.0～50.0 mg/L濃度范圍內(nèi),其濃度與SERS的1 622 cm-1峰強(qiáng)度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程和決定系數(shù)(R2)分別為y=26.681x+1233.5和0.980 2,并得到最低檢測(cè)限為4mg/L。應(yīng)用得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)螺旋霉素濃度分別為20.0,30.0, 45.0 mg/L的鴨肉提取液加標(biāo)樣本進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果如表1所示,其平均回收率的范圍為73.38%～105.25%。結(jié)果表明,利用SERS技術(shù)建立鴨肉中螺旋霉素殘留的快速檢測(cè)研究是可行的。

圖6 SERS信號(hào)(1 622 cm-1峰)強(qiáng)度與鴨肉中螺旋霉素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve between SERS(peak of1 622 cm-1) intensity and spiramycin concentration in duck meat

表1 預(yù)測(cè)結(jié)果分析(n=5)Table 1 Analysis of prediction results

4 結(jié) 論

運(yùn)用SERS光譜法可以快速檢測(cè)鴨肉中螺旋霉素的殘留含量。實(shí)驗(yàn)以O(shè)TR202作為表面增強(qiáng)活性基底,確定了1 622 cm-1峰可以作為鴨肉中螺旋霉素殘留檢測(cè)的SERS特征峰。采用air-PLS方法進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理,通過單因素實(shí)驗(yàn)分析法確定了當(dāng)樣品加入量和吸附時(shí)間分別為20μL和1 min時(shí)采集的SERS信號(hào)最佳。最后在該條件下建立了鴨肉提取液中螺旋霉素殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到了在4.0～50.0mg/L濃度范圍內(nèi),其SERS的1 622 cm-1峰強(qiáng)度與螺旋霉素的濃度具有良好的線性關(guān)系,并且結(jié)果具有一定的可靠性。

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Detection of Spiram ycin Residue in Duck M eat Based on SERS

HONG Qian,LIU Mu-hua,YUAN Hai-chao,PENG Yi-jie,LIYao,ZHAO Jin-hui*
(Optics-Electrics Application ofBiomaterials Lab,College of Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)
*Corresponding Author,E-mail:zjhxiaocao@sina.com

The surface enhanced Raman spectroscopy(SERS)method combined with the adaptive iterative re-weighted penalized least squares(air-PLS)method was used for the rapid detection of spiramycin residue in duck meat.Firstly,the OTR202 was used as SERSactive substrate,and the peak 1 622 cm-1was considered as the Raman characteristic peak for spiramycin residue in duck meat extract.Then the optimum experimental conditions were determined by using the single factor experiment.Under these conditions,the duck meat extract spiked samples,in which spiramycin concentration range was 4.0-50.0 mg/L,were analyzed,and the standard curve was established and a good linear relationship was obtained.The linear regression equation was y=26.681x+1233.5, and the coefficient of determination(R2)was 0.980 2.The detection limit was 4 mg/L,and the average recovery rate was 73.38%～105.25%.The research results show that it is feasible to realize the rapid detection of spiramycin residue in duck meat by using SERS.

spiramycin;SERS;air-PLS;duck meat

洪茜(1991-),女,江西九江人,碩士研究生,2012年于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位,主要從事熒光與拉曼光譜分析與檢測(cè)方面的研究。E-mail:hongqian1028@163.com

趙進(jìn)輝(1978-),男,湖南華容人,博士,副教授,2008年于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得博士學(xué)位,主要從事光譜分析與檢測(cè)方面的研究。E-mail:zjhxiaocao@sina.com

O657.37

A

10.3788/fgxb20153612.1464

1000-7032(2015)12-1464-05

2015-06-17;

2015-11-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31101295);江西省科技廳對(duì)外科技合作計(jì)劃(20132BDH80005);江西省科技廳科技支撐項(xiàng)目(2012BBG70058);江西省教育廳科技計(jì)劃(GJJ12244)資助項(xiàng)目