莫鳳萍，馬 麗，劉雄民

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

HPLC法測定Mucor sp.產(chǎn)肉桂酸降解酶的活性和動力學(xué)分析

莫鳳萍，馬 麗，劉雄民

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

建立了高效液相色譜法測定肉桂酸降解酶活性的方法。以肉桂酸為底物、苯乙酮為探針，通過測定苯乙酮的生成速率來計(jì)算酶活并進(jìn)行酶催化動力學(xué)分析。色譜柱為Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫為30℃，流動相為乙腈∶水∶冰乙酸＝50∶50∶0.5（體積比），流速為1.0mL·min－1，檢測波長為247nm。苯乙酮的線性范圍為1.952～156.2μg·mL－1，回收率為99.46%～101.2%，RSD≤1%，檢出限為0.45μg·mL－1（S/N＝3）。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定可靠，簡便，重復(fù)性好，不受雜質(zhì)干擾，可用于肉桂酸降解酶的活性測定和動力學(xué)分析。粗酶液和不同濃度的肉桂酸在30℃下反應(yīng)2h后，HPLC法測定初反應(yīng)速率，以雙倒數(shù)作圖法計(jì)算酶動力學(xué)參數(shù)，雙倒數(shù)圖呈直線，符合米氏方程規(guī)律，米氏常數(shù)Km＝0.07g·L－1，即0.473μmol·L－1，Vmax＝0.058μmol·min－1·mg－1。

HPLC；酶活；肉桂酸；苯乙酮；動力學(xué)分析

天然的香精香料是高附加值的食品添加劑和精細(xì)化工產(chǎn)品，利用生物催化轉(zhuǎn)化天然前體是一種獲得天然香精香料的有效途徑，目前已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［1］。肉桂酸是廣西特色林產(chǎn)資源，是桂油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物［2］，本課題組在前期研究中首次篩選到的菌株Mucorsp.能將肉桂酸轉(zhuǎn)化為高附加值的天然香料苯乙酮［3－5］。前期的研究重點(diǎn)主要集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化，對催化該反應(yīng)的相關(guān)酶的酶學(xué)性質(zhì)尚未開展研究。微生物細(xì)胞催化作用的實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng)，酶活力（酶活）是衡量酶生物活性及含量的重要指標(biāo)［6］，因此，建立適用于肉桂酸降解酶酶活檢測方法，為進(jìn)一步開展肉桂酸降解酶酶學(xué)性質(zhì)和催化機(jī)理研究奠定分析基礎(chǔ)，是十分迫切和必要的。

目前，用于測定酶活的方法主要有比色法、滴定法、紫外分光光度法、酶偶聯(lián)法、高效液相色譜（HPLC）法［6－8］，其中高效液相色譜法由于具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、抗干擾性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用［912］，適用于酶催化動力學(xué)分析［13－14］。作者以苯乙酮為探針，用高效液相色譜法測定肉桂酸降解酶的酶活，擬為肉桂酸降解酶的深入研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑與儀器

毛霉菌Mucorsp.，自行保存。

乙腈，色譜純，Merck公司；肉桂酸和苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

LC-20AT型泵；SPD-10A型UV-Vis檢測器，日本Shimadzu公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品適量，以乙醇為溶劑，配制成0.3904g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃儲存，備用。

1.3 樣品處理

1.3.1 粗酶液的制備

將菌株接種于200mL液體培養(yǎng)基中，按一定的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，再將發(fā)酵液離心，上清液即為粗酶液。

1.3.2 樣品的制備

將5mL粗酶液加入到2.5mL含有0.6g·L－1肉桂酸的磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7.0）中，于30℃下靜置反應(yīng)2h，取1mL反應(yīng)液加入0.2mL75%乙醇猝滅反應(yīng)，4 200r·min－1離心20min，0.45μm微濾膜過濾，HPLC進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱溫30℃；流動相：乙腈∶水∶冰乙酸＝50∶50∶0.5（體積比）；流速1.0mL·min－1；檢測波長247 nm；進(jìn)樣量5μL。

1.5 酶活定義

酶活定義：每分鐘生成1μmol苯乙酮為一個酶活單位（U）。

1.6 酶催化動力學(xué)分析

圖1 不同樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Chromatograms of different samples

取6份1mL粗酶液，分別加入0.5mL含有肉桂酸的磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7.0），最終底物肉桂酸濃度（g·L－1）分別為0.05、0.08、0.10、0.12、0.15、0.20，于30℃下反應(yīng)2h后取1mL反應(yīng)液加0.2mL 75%乙醇猝滅反應(yīng)，4 200r·min－1離心20min，0.45 μm微濾膜過濾，HPLC進(jìn)樣分析，分別測定30～120 min的初反應(yīng)速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

圖1為選定的色譜條件下粗酶液、肉桂酸和苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品混合液、粗酶液加苯乙酮、粗酶液反應(yīng)樣品的色譜圖。

由圖1可知：在實(shí)驗(yàn)條件下，檢測到粗酶液有大量的小分子物質(zhì)，但都在3.5min前出峰，對產(chǎn)物苯乙酮的測定沒有干擾，表明方法的專屬性好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度稀釋至1.952～156.2μg ·mL－1，按照色譜條件，以苯乙酮峰面積（y）對濃度（x）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，在此濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y＝15017x＋4482.6，相關(guān)系數(shù)R＝0.9997，檢出限為0.45μg· mL－1（S/N＝3），線性關(guān)系滿足定量要求。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取一定濃度的苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到酶反應(yīng)體系后，立即用75%乙醇猝滅反應(yīng)，4 200r·min－1離心20 min，0.45μm微濾膜過濾，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行方法精密度的測定，RSD＝1%，表明方法的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取粗酶液反應(yīng)樣品，室溫下放置，分別于0h、2h、 4h、6h、8h、10h、12h在上述色譜條件下進(jìn)樣5μL，結(jié)果表明在12h內(nèi)比較穩(wěn)定，RSD為1.2%。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取低、中、高濃度的苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到失活的酶反應(yīng)體系，按1.3.2方法處理樣品，在上述色譜條件下測定，并計(jì)算加標(biāo)回收率、RSD，結(jié)果見表1。

2.6 粗酶液酶活的測定

微生物的生長會影響酶的合成和分泌，每一種菌株都有一個最適發(fā)酵時(shí)間，在這個時(shí)間產(chǎn)酶量最高，而后隨著菌株衰亡，產(chǎn)酶量下降。為找到最適發(fā)酵時(shí)間，分別取發(fā)酵48h、60h、72h、96h、108h的粗酶液，按1.3.2方法處理，測定酶活，結(jié)果見表2。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間粗酶液酶活的測定（n＝3）Tab.2 Determination of enzyme activity at different fermentation time（n＝3）

由表2可知，菌株發(fā)酵96h，酶活達(dá)到最大，為0.0070U·mL－1。

2.7 肉桂酸的酶反應(yīng)動力學(xué)

2.7.1 反應(yīng)時(shí)間的確定

取相同體積的粗酶液，按1.3.2方法處理，分別反應(yīng)20min、30min、40min、50min、120min、180min、220min，測定苯乙酮的生成量，結(jié)果見圖2。

圖2 苯乙酮生成量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Plot of acetophenone production vs reaction time

由圖2可知，由于酶和底物需要一個接觸適應(yīng)的過程，在前30min幾乎不生成苯乙酮，在30～220min內(nèi)苯乙酮生成量和時(shí)間呈線性關(guān)系，為了減小測量誤差及節(jié)約時(shí)間，選擇測定初反應(yīng)速率的反應(yīng)時(shí)間為30～120min。

2.7.2 苯乙酮生成量與蛋白濃度的關(guān)系

取不同蛋白濃度的粗酶液，按1.3.2方法處理，苯乙酮生成量與粗酶液蛋白濃度的關(guān)系如圖3所示。

由圖3可知，蛋白濃度在0～0.0396g·L－1的范圍內(nèi)苯乙酮生成量和蛋白濃度呈良好的線性關(guān)系。表明，在0～0.0396g·L－1濃度范圍內(nèi)的粗酶液適合用于酶動力學(xué)分析。

2.7.3 肉桂酸降解酶催化動力學(xué)參數(shù)

圖3 苯乙酮生成量與蛋白濃度的關(guān)系Fig.3 Plot of acetophenone production vs protein concentration

按照1.6方法，在選定的考察條件下，測得各底物濃度下的30～120min的初反應(yīng)速率（V）。底物濃度（［S］）、初反應(yīng)速率及它們的倒數(shù)數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 底物濃度與對應(yīng)的初反應(yīng)速率數(shù)據(jù)Tab.3 The data of substrate concentration and the corresponding initial reaction rate

將濃度和初反應(yīng)速率利用Lineweaver-Burk法雙倒數(shù)作圖求Km和Vmax，見圖4。

圖4 1/V與1/［S］的關(guān)系Fig.4 The relationship between 1/Vand 1/［S］

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法，以肉桂酸為底物、苯乙酮為探針，測定肉桂酸降解酶酶活。色譜柱為Hypersil ODS2柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈∶水∶冰乙酸＝50∶50∶0.5（體積比），流速為1.0mL ·min－1，檢測波長為247nm，柱溫為30℃。苯乙酮的線性范圍為1.952～156.2μg·mL－1，回收率為99.46%～101.2%，RSD＜1%，檢出限為0.45μg· mL－1（S/N＝3）。表明該方法穩(wěn)定可靠，簡便，重復(fù)性好，不受雜質(zhì)干擾，可用于酶活測定和動力學(xué)分析。粗酶液和不同濃度的肉桂酸在30℃下反應(yīng)2h后，HPLC法測定初反應(yīng)速率，以雙倒數(shù)作圖法計(jì)算酶動力學(xué)參數(shù)，雙倒數(shù)圖呈直線，符合米氏方程規(guī)律，米氏常數(shù)Km＝0.07g·L－1，即0.473μmol·L－1，Vmax＝0.058μmol·min－1·mg－1。為進(jìn)一步系統(tǒng)研究肉桂酸降解酶奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

［1］馬麗，劉雄民，龐宗文.Mucorsp.JX23發(fā)酵液生物催化肉桂酸降解生成苯乙酮［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（1）：8-11.

［2］ZHENG L，ZHENG P，SUN Z，et al.Production of vanillin from waste residue of rice bran oil byAspergillusnigerandPycnoporuscinnabarinus［J］.Bioresour Technol，2007，98（5）：1115-1119.

［3］MA L，LIU X，LIANG J，et al.Biotransformations of cinnamaldehyde，cinnamic acid and acetophenone withMucor［J］.World Jour-nal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（9）：2133-2137.

［4］馬麗，劉雄民，暴瑋，等.肉桂酸生物合成苯乙酮微生物的篩選及反應(yīng)條件優(yōu)化［J］.精細(xì)化工，2008，25（8）：755-757.

［5］劉雄民，馬麗，李偉光，等.高大毛霉催化轉(zhuǎn)化肉桂酸生成天然苯乙酮和α-苯乙醇的方法：中國，200910113911.4［P］.2009-11-04.

［6］陳清軒，ROSIK L O.高效液相色譜法測定酶的活性［J］.色譜，1992，10（2）：101-103.

［7］LAHOGUE V，REHEL K，TAUPIN L，et al.A HPLC-UV method for the determination of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory activity［J］.Food Chemistry，2010，118（3）：870-875.

［8］SUCKOCKA Z，SWATOWSKA J，PACHECKA J，et al.RPHPLC determination of paraoxonase 3activity in human blood serum［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，42（1）：113-119.

［9］管玉霞，張洪秀，邢莉麗.反相高效液相色譜法測定磷酸果糖激酶的活性［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（2）：211-213.

［10］朱曄榮，呂憲禹，王秀玲，等.高效液相色譜法測定絲氨酸：乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性［J］.色譜，2003，21（6）：584-586.

［11］陳思，李輝，馬嬌穎，等.HPLC法測定豬尿酸酶活性［J］.化學(xué)與生物工程，2012，29（6）：88-91.

［12］楊麗娜，肖盛元，鄧玉林.RP-HPLC法測定鼠肝組織兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶活性的研究［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2009，（1）：59-61.

［13］郭延壘，于超，楊竹，等.HPLC法測定大鼠UGT1A6的酶活性及體外動力學(xué)分析［J］.藥物分析雜志，2012，32（4）：717-720.

［14］張有金，于超，郭延壘，等.HPLC測定大鼠肝微粒體中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性及體外動力學(xué)研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2012，47（13）：1065-1068.

Activity Determination of Cinnamic Acid Degradation Enzyme Produced by Mucor sp.by HPLC and Study on Its Kinetics

MO Feng－ping，MA Li，LIU Xiong-min
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning530004，China）

A method for determination of cinnamic acid degradation enzyme activity by HPLC was developed.Using cinnamic acid as substrate and acetophenone as probe，the cinnamic acid degradation enzyme activity was calculated and its enzyme kinetics was analysed by determination of the production rate of acetophenone.Hypersil ODS2column（250mm×4.6mm，5μm）was selected at 30℃，with acetonitrile-water-glacial acetic acid（50∶50∶0.5，volume ratio）as mobile phase at flow rate of 1.0mL·min－1，and the detection wavelength was 247nm.The linear range of acetophenone was 1.952～156.2μg·mL－1.The average recovery of acetophenone was 99.46%～101.2%with RSD＜1%.The detection limit was 0.45μg·mL－1（S/N＝3）.This method was proved to be reliable，simple and good reproducible，especially with strong anti-interference，which can be applied to determination of cinnamic acid degradation enzyme activity and kinetic analysis.Different concentrations of cinnamic acid reacted with enzyme at 30℃for 2h，initial reaction rate was determined by HPLC.Enzyme kinetics parameters were calculated by double inverse method，Double inverse graph was a straight line which conformed to the law of Michaelic-Menton equation，Km＝0.07g·L－1（0.473μmol·L－1），Vmax＝0.058 μmol·min－1·mg－1.

HPLC；enzyme activity；cinnamic acid；acetophenone；kinetic analysis

O 657.72

A

1672-5425（2015）03-0062-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.03.016

廣西教育廳資助項(xiàng)目（2013ZL006）

2014-12-16

莫鳳萍（1988－），女，廣西桂林人，碩士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：315214713＠qq.com；通訊作者：馬麗，高級工程師，E-mail：gxumali＠126.com。