王菊花，解倩倩，范彩云，方富貴，周 杰，曹鴻國，章孝榮,b

(安徽農業(yè)大學 a 動物科技學院，b 安徽地方畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，安徽 合肥 230036)

白消安注射法建立昆明小鼠精原干細胞移植受體模型

王菊花a，解倩倩a，范彩云a，方富貴a，周 杰a，曹鴻國a，章孝榮a,b

(安徽農業(yè)大學 a 動物科技學院，b 安徽地方畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，安徽 合肥 230036)

【目的】 通過對6周齡昆明小鼠腹腔內單次注射不同劑量的白消安來制作精原干細胞移植受體模型?！痉椒ā?將104只昆明小鼠隨機分成4組，分別注射0 (對照組，注射等量的白消安溶解液二甲基亞砜(DMSO))，10，20和30 mg/kg白消安，于注射白消安后5，7，9，11和13周記錄小鼠的死亡數、小鼠睪丸外觀體積、小鼠睪丸質量和小鼠體質量，計算睪丸指數；通過組織學觀察注射不同劑量白消安后小鼠曲細精管精子的恢復情況，并檢測受體小鼠血液中紅細胞和白細胞數量的變化。 【結果】 注射0(對照組)，10，20和30 mg/kg白消安13周后，小鼠死亡率分別為0(0/22)，11.54%(3/26)，17.86%(5/28)和89.29%(25/28)。10 mg/kg白消安組小鼠的睪丸指數在注射后5，7和9周顯著小于對照組(P<0.05)，而在注射后11和13周，與對照組差異不顯著(P>0.05)；在注射后不同時間，對照組和10 mg/kg白消安組的睪丸指數均顯著高于20 mg/kg白消安組(P<0.05)。在注射白消安5，7，9，11和13周后，對照組曲細精管上皮無變化；10和20 mg/kg白消安組有完整精子發(fā)生的曲細精管占總曲細精管的百分比分別為(49.56±8.23)%，(66.61±6.13)%，(80.24±10.42)%，(93.87±3.23)%，(92.49±4.58)%；(8.73±9.22)%，(9.89±6.39)%，(29.21±12.31)%，(49.64±3.59)% 和(81.99±4.98)%。受體小鼠紅細胞和白細胞數量均隨著處理時間及白消安處理劑量的變化而變化?！窘Y論】 腹腔內注射20 mg/kg白消安小鼠的死亡率、睪丸指數均較低，中空的曲細精管數量多，且恢復較慢，適于做精原干細胞移植的受體，合適的移植時間是白消安處理后5～7周。

精原干細胞；白消安；昆明小鼠；移植受體模型

精原干細胞(SSCs)是一群具有高度自我更新和分化潛能的細胞，是雄性成體內惟一能向子代傳遞遺傳信息的干細胞。SSCs移植技術可為治療雄性不育和生產轉基因動物開拓新方法[1]。然而，降低或消除受體內源性生殖細胞是SSCs移植成敗的關鍵步驟之一[2]。目前常采用注射白消安(Busulfan)和輻射處理來消除或降低受體內源性生殖細胞，其中以注射白消安法應用較為普遍[3-4]，這主要是由于白消安不影響細胞DNA的合成，僅對細胞有絲分裂周期中的G1期有毒性作用，抑制G1 期后的有絲分裂。當白消安作用于睪丸時，優(yōu)先作用于SSCs，在有效地去除睪丸中內源性SSCs的同時，又能夠保持支持細胞的正常功能，不影響睪丸曲細精管精子發(fā)生的微環(huán)境，且操作方便[3]。而輻射處理不具有此優(yōu)勢。目前，盡管已建立了多種小鼠、大鼠睪丸生精細胞移植受體模型[3-5]，但在受體制作過程中，白消安注射劑量往往會隨受體動物品種不同而發(fā)生變化，昆明鼠是國內廣泛使用的小鼠品種，迄今仍不明確其對白消安的敏感程度、合適處理劑量和移植時間。本試驗擬通過對6周齡昆明(KM)小鼠腹腔單次注射不同劑量白消安的方法，建立無精子癥小鼠受體模型，以期為SSCs移植、治療雄性不育和生產轉基因動物提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

104只6周齡KM小鼠購自南京曉莊獸醫(yī)學院，小鼠平均體質量為(17.22±3.41) g/只。白消安(Busulfan)、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司產品。

1.2 試驗方法

將白消安用DMSO生理鹽水配制成20 mg/mL的儲備液，備用。將小鼠隨機分成4組，即對照組及10，20和30 mg/kg白消安組，各組小鼠數量分別為22，26，28和28只，根據小鼠體質量，各組小鼠分別腹腔注射DMSO生理鹽水及10，20和30 mg/kg白消安。白消安注射液應置于37 ℃水浴中，防止凝固。腹腔注射后小鼠按常規(guī)進行飼養(yǎng)。每天觀察并記錄小鼠的存活情況。

1.3 樣品采集與分析

注射白消安5，7，9，11和13周后分別記錄每組小鼠死亡率，每次每組均通過眼眶下采血處死3～4只小鼠，分別采集小鼠睪丸，記錄睪丸質量及小鼠體質量，計算睪丸指數=單個睪丸質量/體質量×10 000[6]。之后將采集的小鼠睪丸，用質量分數4% 多聚甲醛溶液固定過夜，常規(guī)方法制作5 μm厚的石蠟切片，并進行蘇木素-伊紅染色，統(tǒng)計睪丸中帶有完整精子發(fā)生的生精小管數量占全部生精小管的百分比[7]。將采集血樣用肝素抗凝處理后，分析血液中白細胞和紅細胞數量。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 白消安處理對小鼠死亡率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的死亡率與白消安劑量呈依賴性增加關系，在注射白消安13周后，對照組和10，20，30 mg/kg 白消安組小鼠的死亡率分別為0(0/22)，11.54%(3/26)，17.86%(5/28)和89.29%(25/28)，以注射30 mg/kg白消安組死亡率最高?？梢?0 mg/kg白消安對小鼠的致死作用較強，不適宜作為受體模型。故后續(xù)試驗均不分析30 mg/kg 白消安組小鼠各項指標的變化。

2.2 白消安處理對小鼠睪丸質量的影響

白消安對小鼠睪丸質量的影響見圖1。

圖1 白消安對小鼠睪丸質量的影響圖柱上標不同小寫字母表示同一時間不同組間差異顯著(P<0.05)。下圖同F(xiàn)ig.1 Effect of busulfan on weight of mouse testis Different letters indicate significant difference among different groups at the same time (P<0.05).The same below

由圖1可知，10 mg/kg白消安組小鼠睪丸質量在注射5，7和9周后顯著低于對照組(P<0.05)；在注射后第11和13周睪丸質量逐漸恢復正常，與對照組差異不顯著(P>0.05)。20 mg/kg白消安組小鼠在注射5，7，9，11和13周后，睪丸質量均顯著低于對照組和10 mg/kg白消安組(P<0.05)。10和20 mg/kg白消安組小鼠睪丸質量均隨著注射后時間的延長而增加，但20 mg/kg白消安組增加緩慢。在注射后5，7，9和11周后，各組小鼠睪丸質量均表現(xiàn)為對照組>10 mg/kg 白消安組>20 mg/kg白消安組，即隨著白消安劑量的增加睪丸質量減輕。但在注射后13周10 mg/kg白消安組小鼠睪丸質量與對照組相近，說明10 mg/kg 白消安組睪丸質量在注射后13周恢復正常。

2.3 白消安處理對小鼠睪丸外觀體積的影響

由圖2可知，注射后5周的小鼠睪丸的外觀體積以對照組最大，10和20 mg/kg白消安組的睪丸外觀體積較小，且兩組差異不明顯；注射后7和9周睪丸的外觀體積表現(xiàn)為對照組>10 mg/kg白消安組>20 mg/kg白消安組；注射后11和13周，10 mg/kg白消安組小鼠睪丸外觀體積與對照組的差異減小，但20 mg/kg白消安組小鼠睪丸外觀體積仍明顯小于對照組和10 mg/kg白消安組。

圖2 白消安對小鼠睪丸外觀體積的影響 a、b、c、d、e分別為注射白消安5，7，9，11和13周各組小鼠睪丸；1～3分別為對照組及10和20 mg/kg白消安組Fig.2 Effect of busulfan on shape of mouse testis a,b,c,d, and e are testis of mice 5,7,9,11 and 13 after busulfan treatment;1-3 are control,10 and 20 mg/kg busulfan groups,respectively

2.4 白消安處理對小鼠睪丸指數的影響

睪丸指數可以更加客觀地評價白消安處理后小鼠睪丸大小的變化。由表1可知，10 mg/kg白消安組小鼠的睪丸指數在注射后5，7和9周顯著小于對照組(P<0.05)，而在注射后11和13周，兩組差異不顯著(P>0.05)；在注射后不同時間，對照組和10 mg/kg組的睪丸指數均顯著高于20 mg/kg白消安組(P<0.05)。

表1 白消安對小鼠睪丸指數的影響(n=8)Table 1 Effect of busulfan on mouse testicular index (n=8)

注：同列數據后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between the control and experiment groups at the same time (P<0.05).

2.5 白消安處理后小鼠睪丸組織學變化

有完整精子發(fā)生的曲細精管占整個曲細精管的百分比可以反映白消安處理后睪丸恢復情況，因此可以通過計算每視野下帶有完整精子發(fā)生的生精小管數量占全部生精小管的百分比，來評價睪丸精子發(fā)生的恢復情況。如圖3所示，在注射白消安5，7，9，11和13周后，對照組曲細精管上皮無變化，表明精子發(fā)生未受干擾(圖3-A1，B1，C1，D1，E1)。10 mg/kg白消安組在處理后5，7，9，11和13周，帶有完整精子發(fā)生的曲細精管率分別為(49.56±8.23)%，(66.61±6.13)%，(80.24±10.42)%，(93.87±3.23)%和(92.49±4.58)%(圖3-A2，B2，C2，D2，E2)。而20 mg/kg白消安組在處理后5，7，9，11周，生殖細胞嚴重枯竭(圖3-A3，B3，C3，D3)，在處理后13周，生殖細胞有所恢復 (圖3-E3)；在處理后5，7，9，11和13周，帶有完整精子發(fā)生的曲細精管率分別為(8.73±9.22)%，(9.89±6.39)%，(29.21±12.31)%，(49.64±3.59)% 和(81.99±4.98)%。

圖3 白消安對小鼠睪丸曲細精管的影響A1、B1、C1、D1和E1分別表示注射后5，7，9，11 和 13 周對照組睪丸組織學變化；A2、B2、C2、D2和E2分別表示注射5，7，9，11 和 13 周后10 mg/kg白消安組睪丸組織學變化；A3、B3、C3、D3和E3分別表示注射后5，7，9，11 和 13 周后20 mg/kg白消安組睪丸組織學變化。Bar=100 nmFig.3 Effects of busulfan on histological appearance of testis tissue in miceA1,B1,C1,D1 and E1 show the testis tissue appearance of the control (0 mg/kg of busulfan) after 5,7,9,11 and 13 weeks, respectively;A2,B2,C2,D2 and E2 show the testis tissue appearance of mice treated with 10 mg/kg of busulfan after 5,7,9, 11 and 13 weeks,respectively;A3,B3,C3,D3 and E3 show the testis tissue appearance of mice treated with 20 mg/kg of busulfan after 5,7,9,11 and 13 weeks,respectively.Bar=100 nm

2.6 白消安處理對小鼠紅細胞和白細胞數量的影響

由圖4可知，10 mg/kg白消安組紅細胞數量在處理后5周與對照組差異不顯著(P>0.05)，而在處理后7，9，11和13周均顯著低于對照組(P<0.05)；而白細胞數在處理后5和9周與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)，但在處理后7，11和13周顯著低于對照組(P<0.05)。20 mg/kg白消安組紅細胞和白細胞數量在處理后5，7，9，11和13周均顯著低于對照組(P<0.05)；而在處理后不同時間紅細胞數量均顯著低于10 mg/kg白消安組(P<0.05)，白細胞數量僅在處理后5，7和9周與10 mg/kg白消安組差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

SSCs移植技術是治療雄性不育、生產轉基因動物的一種有效手段[8]。然而，合適受體模型的建立是成功移植的決定性因素。為了提高SSCs的移植成功率，需要清除內源性的生殖細胞，從而使移植的SSCs易遷移到達生殖上皮的基膜而定居，進而啟動供體的精子發(fā)生過程[9]。一些研究表明，注射38～40 mg/kg白消安能完全消除內源性精子的發(fā)生過程[7,10]。在運用白消安處理受體時，同種動物的不同品系對其耐受力不同[11]。Moisan等[12]報道，對RAG2小鼠用25 mg/kg白消安處理后，死亡率為12%，用30 mg/kg白消安處理后的死亡率為37%，用40和50 mg/kg白消安處理后的死亡率約為50%。在本研究中，隨著白消安劑量的增大小鼠的死亡率也在增加，在注射30 mg/kg白消安后，KM小鼠死亡率高達89.29%。說明KM小鼠比其他小鼠對白消安更敏感，這也進一步證實了王永彬等[13]的研究結果。通過白消安對小鼠的致死情況分析可知，10 和20 mg/kg白消安處理的小鼠死亡率較低，可作為KM小鼠的處理劑量。

圖4 白消安對小鼠紅細胞(A)和白細胞數量(B)的影響Fig.4 Effect of busulfan on number of erythrocytes (A) and leukocyte (B)

在本研究中，注射白消安后睪丸發(fā)育明顯受阻，質量減輕，體積變小。但經過一段時間后，睪丸質量和體積均有所恢復，注射低劑量(10 mg/kg)白消安組的恢復速度快于高劑量組(20 mg/kg)。張偉等[11]研究表明，以30 和40 mg/kg白消安處理ICR小鼠4和8周后，兩組小鼠睪丸質量在處理后相同時間點均顯著低于對照組，但處理后12周睪丸質量逐漸恢復，與對照組差異均不顯著，這與本研究結果相似。

睪丸指數能夠更準確地反映不同個體間睪丸的大小。在本試驗中，無論注射劑量高低，在注射白消安后9周睪丸指數明顯下降。孫淼[6]研究表明，白消安處理小鼠40 d后睪丸指數明顯下降，與本研究結果一致。隨著注射后時間的延長，睪丸指數先下降，然后呈上升趨勢。而高劑量(20 mg/kg)白消安組睪丸指數恢復速度明顯低于低劑量組(10 mg/kg)。由此可說明20 mg/kg白消安組可以為外源性SSCs在受體睪丸中遷移提供足夠的時間。由于10 mg/kg 白消安處理的受體鼠睪丸中帶有完整精子發(fā)生的曲細精管率較高，會影響供體生殖細胞向受體睪丸基膜的遷移效率，從而會使移植效率明顯降低，故此劑量白消安處理的受體鼠不適宜作為受體模型。Zohni等[14]研究表明，無論處理劑量如何，受體鼠在白消安處理后，曲細精管的恢復隨移植時間的延長均表現(xiàn)為先慢后快，最后達到一個平臺期，與本研究結果相似。盡管在白消安處理后，受體精子發(fā)生恢復的能力受多重因素的影響[15]，但筆者認為，白消安劑量的大小可能是最關鍵的影響因素。多數研究認為，在白消安處理后至少4周可用來作為受體鼠[3,5]，本研究結果表明移植的時間不應超過處理后9周，最佳移植時間為處理后5～7周。

白消安能引起骨髓微環(huán)境破壞從而影響造血細胞的修復，使造血細胞再生能力降低。本研究結果表明，白消安處理后，小鼠血液中白細胞和紅細胞數量均有所減少，但經過一段時間后逐漸恢復。血細胞數量隨著白消安處理劑量的升高呈劑量依從性降低[16]，說明白消安對小鼠的亞致死性可能是由于貧血和抵抗力下降所致。所以，研究適宜的白消安處理劑量和把握合適的移植時間，在SSCs移植的臨床應用上具有重要的意義。本研究結果表明，注射20 mg/kg白消安小鼠的死亡率較低，且睪丸恢復較慢，可用于精原干細胞移植，最佳移植時間為白消安處理后 5～7 周。

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Establishment of transplantation model for spermatogonial stem cells in Kunming mice with busulfan treatment

WANG Ju-huaa,XIE Qian-qiana,FAN Cai-yuna,FANG Fu-guia,ZHOU Jiea,CAO Hong-guoa,ZHANG Xiao-ronga,b

(aCollegeofAnimalScienceandTechnology,bAnhuiProvincialLaboratoryofLocalLivestockandPoultryGeneticResourceConservation,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 Different doses of busulfan were injected to Kunming (KM) mice at age of 6 weeks by intra-abdominal to produce receptor model for transplantation of spermatogonial stem cells.【Method】 A total of 104 male KM mice were randomly divided into 4 groups and treated with different doses of busulfan (0,10,20 and 30 mg/kg body weight).After 5,7,9,11 and 13 weeks,mortality,body weight,testicle weight,the testicular index,the number of seminiferous tubule with spermatogenesis and blood cells were analyzed.【Result】 The mortalities were 0 (0/22),11.54% (3/26),17.86% (5/28) and 89.29% (25/28) for 0,10,20 and 30 mg/kg groups,respectively.Testicular indexes in control were significantly higher than in 10 mg/kg group 5,7,and 9 weeks after busulfan treatment (P<0.05).However,11 and 13 weeks after busulfan treatment,they were insignificantly different (P>0.05).Regardless of injecting dose,testicular index in 20 mg/kg group were significantly higher than the control and 10 mg/kg group (P<0.05) all the time.Seminiferous epithelia of the control group had no obvious degenerative changes after 5,7,9,11 and 13 weeks.The tubules with complete spermatogenesis were (49.56±8.23)%,(66.61±6.13)%,(80.24±10.42)%,(93.87±3.23)% and (92.49±4.58)% in 10 mg/kg group.(8.73±9.22)%,(9.89±6.39)%,(29.21±12.31)%,(49.64±3.59)% and (81.99±4.98)% of seminiferous tubules showed complete spermatogenesis in 20 mg/kg group after 5,7,9,11 and 13 weeks.The number of blood cells changed along with time and dose of busulfan treatment. 【Conclusion】 The optimal dose of busulfan was 20 mg/kg and the most appropriate time for transplantation was 5-7 weeks after busulfan treatment.

spermatogonial stem cells;busulfan;KM mouse;transplantation model

2014-01-21

國家高技術研究發(fā)展計劃(“863”計劃)項目(2011AA100307)；國家轉基因生物新品種培育重大專項(2009ZX08008-007B)

王菊花(1975-)，女，內蒙古錫盟人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事動物營養(yǎng)生殖生理研究。 E-mail：wjhxxh@163.com

章孝榮(1954-)，男，安徽樅陽人，教授，博士生導師，主要從事動物繁育及胚胎生物技術。

時間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.028

S865.1+3

A

1671-9387(2015)08-0051-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.028.html