王菊花，解倩倩，范彩云，方富貴，周 杰，曹鴻國(guó)，章孝榮,b

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) a 動(dòng)物科技學(xué)院，b 安徽地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

白消安注射法建立昆明小鼠精原干細(xì)胞移植受體模型

王菊花a，解倩倩a，范彩云a，方富貴a，周 杰a，曹鴻國(guó)a，章孝榮a,b

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) a 動(dòng)物科技學(xué)院，b 安徽地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

【目的】 通過(guò)對(duì)6周齡昆明小鼠腹腔內(nèi)單次注射不同劑量的白消安來(lái)制作精原干細(xì)胞移植受體模型?！痉椒ā?將104只昆明小鼠隨機(jī)分成4組，分別注射0 (對(duì)照組，注射等量的白消安溶解液二甲基亞砜(DMSO))，10，20和30 mg/kg白消安，于注射白消安后5，7，9，11和13周記錄小鼠的死亡數(shù)、小鼠睪丸外觀體積、小鼠睪丸質(zhì)量和小鼠體質(zhì)量，計(jì)算睪丸指數(shù)；通過(guò)組織學(xué)觀察注射不同劑量白消安后小鼠曲細(xì)精管精子的恢復(fù)情況，并檢測(cè)受體小鼠血液中紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量的變化。 【結(jié)果】 注射0(對(duì)照組)，10，20和30 mg/kg白消安13周后，小鼠死亡率分別為0(0/22)，11.54%(3/26)，17.86%(5/28)和89.29%(25/28)。10 mg/kg白消安組小鼠的睪丸指數(shù)在注射后5，7和9周顯著小于對(duì)照組(P<0.05)，而在注射后11和13周，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；在注射后不同時(shí)間，對(duì)照組和10 mg/kg白消安組的睪丸指數(shù)均顯著高于20 mg/kg白消安組(P<0.05)。在注射白消安5，7，9，11和13周后，對(duì)照組曲細(xì)精管上皮無(wú)變化；10和20 mg/kg白消安組有完整精子發(fā)生的曲細(xì)精管占總曲細(xì)精管的百分比分別為(49.56±8.23)%，(66.61±6.13)%，(80.24±10.42)%，(93.87±3.23)%，(92.49±4.58)%；(8.73±9.22)%，(9.89±6.39)%，(29.21±12.31)%，(49.64±3.59)% 和(81.99±4.98)%。受體小鼠紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量均隨著處理時(shí)間及白消安處理劑量的變化而變化?！窘Y(jié)論】 腹腔內(nèi)注射20 mg/kg白消安小鼠的死亡率、睪丸指數(shù)均較低，中空的曲細(xì)精管數(shù)量多，且恢復(fù)較慢，適于做精原干細(xì)胞移植的受體，合適的移植時(shí)間是白消安處理后5～7周。

精原干細(xì)胞；白消安；昆明小鼠；移植受體模型

精原干細(xì)胞(SSCs)是一群具有高度自我更新和分化潛能的細(xì)胞，是雄性成體內(nèi)惟一能向子代傳遞遺傳信息的干細(xì)胞。SSCs移植技術(shù)可為治療雄性不育和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開(kāi)拓新方法[1]。然而，降低或消除受體內(nèi)源性生殖細(xì)胞是SSCs移植成敗的關(guān)鍵步驟之一[2]。目前常采用注射白消安(Busulfan)和輻射處理來(lái)消除或降低受體內(nèi)源性生殖細(xì)胞，其中以注射白消安法應(yīng)用較為普遍[3-4]，這主要是由于白消安不影響細(xì)胞DNA的合成，僅對(duì)細(xì)胞有絲分裂周期中的G1期有毒性作用，抑制G1 期后的有絲分裂。當(dāng)白消安作用于睪丸時(shí)，優(yōu)先作用于SSCs，在有效地去除睪丸中內(nèi)源性SSCs的同時(shí)，又能夠保持支持細(xì)胞的正常功能，不影響睪丸曲細(xì)精管精子發(fā)生的微環(huán)境，且操作方便[3]。而輻射處理不具有此優(yōu)勢(shì)。目前，盡管已建立了多種小鼠、大鼠睪丸生精細(xì)胞移植受體模型[3-5]，但在受體制作過(guò)程中，白消安注射劑量往往會(huì)隨受體動(dòng)物品種不同而發(fā)生變化，昆明鼠是國(guó)內(nèi)廣泛使用的小鼠品種，迄今仍不明確其對(duì)白消安的敏感程度、合適處理劑量和移植時(shí)間。本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)6周齡昆明(KM)小鼠腹腔單次注射不同劑量白消安的方法，建立無(wú)精子癥小鼠受體模型，以期為SSCs移植、治療雄性不育和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

104只6周齡KM小鼠購(gòu)自南京曉莊獸醫(yī)學(xué)院，小鼠平均體質(zhì)量為(17.22±3.41) g/只。白消安(Busulfan)、二甲基亞砜(DMSO)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

將白消安用DMSO生理鹽水配制成20 mg/mL的儲(chǔ)備液，備用。將小鼠隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組及10，20和30 mg/kg白消安組，各組小鼠數(shù)量分別為22，26，28和28只，根據(jù)小鼠體質(zhì)量，各組小鼠分別腹腔注射DMSO生理鹽水及10，20和30 mg/kg白消安。白消安注射液應(yīng)置于37 ℃水浴中，防止凝固。腹腔注射后小鼠按常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)。每天觀察并記錄小鼠的存活情況。

1.3 樣品采集與分析

注射白消安5，7，9，11和13周后分別記錄每組小鼠死亡率，每次每組均通過(guò)眼眶下采血處死3～4只小鼠，分別采集小鼠睪丸，記錄睪丸質(zhì)量及小鼠體質(zhì)量，計(jì)算睪丸指數(shù)=單個(gè)睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量×10 000[6]。之后將采集的小鼠睪丸，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 多聚甲醛溶液固定過(guò)夜，常規(guī)方法制作5 μm厚的石蠟切片，并進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，統(tǒng)計(jì)睪丸中帶有完整精子發(fā)生的生精小管數(shù)量占全部生精小管的百分比[7]。將采集血樣用肝素抗凝處理后，分析血液中白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 白消安處理對(duì)小鼠死亡率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的死亡率與白消安劑量呈依賴性增加關(guān)系，在注射白消安13周后，對(duì)照組和10，20，30 mg/kg 白消安組小鼠的死亡率分別為0(0/22)，11.54%(3/26)，17.86%(5/28)和89.29%(25/28)，以注射30 mg/kg白消安組死亡率最高。可見(jiàn)30 mg/kg白消安對(duì)小鼠的致死作用較強(qiáng)，不適宜作為受體模型。故后續(xù)試驗(yàn)均不分析30 mg/kg 白消安組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化。

2.2 白消安處理對(duì)小鼠睪丸質(zhì)量的影響

白消安對(duì)小鼠睪丸質(zhì)量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 白消安對(duì)小鼠睪丸質(zhì)量的影響圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同組間差異顯著(P<0.05)。下圖同F(xiàn)ig.1 Effect of busulfan on weight of mouse testis Different letters indicate significant difference among different groups at the same time (P<0.05).The same below

由圖1可知，10 mg/kg白消安組小鼠睪丸質(zhì)量在注射5，7和9周后顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在注射后第11和13周睪丸質(zhì)量逐漸恢復(fù)正常，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。20 mg/kg白消安組小鼠在注射5，7，9，11和13周后，睪丸質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組和10 mg/kg白消安組(P<0.05)。10和20 mg/kg白消安組小鼠睪丸質(zhì)量均隨著注射后時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但20 mg/kg白消安組增加緩慢。在注射后5，7，9和11周后，各組小鼠睪丸質(zhì)量均表現(xiàn)為對(duì)照組>10 mg/kg 白消安組>20 mg/kg白消安組，即隨著白消安劑量的增加睪丸質(zhì)量減輕。但在注射后13周10 mg/kg白消安組小鼠睪丸質(zhì)量與對(duì)照組相近，說(shuō)明10 mg/kg 白消安組睪丸質(zhì)量在注射后13周恢復(fù)正常。

2.3 白消安處理對(duì)小鼠睪丸外觀體積的影響

由圖2可知，注射后5周的小鼠睪丸的外觀體積以對(duì)照組最大，10和20 mg/kg白消安組的睪丸外觀體積較小，且兩組差異不明顯；注射后7和9周睪丸的外觀體積表現(xiàn)為對(duì)照組>10 mg/kg白消安組>20 mg/kg白消安組；注射后11和13周，10 mg/kg白消安組小鼠睪丸外觀體積與對(duì)照組的差異減小，但20 mg/kg白消安組小鼠睪丸外觀體積仍明顯小于對(duì)照組和10 mg/kg白消安組。

圖2 白消安對(duì)小鼠睪丸外觀體積的影響 a、b、c、d、e分別為注射白消安5，7，9，11和13周各組小鼠睪丸；1～3分別為對(duì)照組及10和20 mg/kg白消安組Fig.2 Effect of busulfan on shape of mouse testis a,b,c,d, and e are testis of mice 5,7,9,11 and 13 after busulfan treatment;1-3 are control,10 and 20 mg/kg busulfan groups,respectively

2.4 白消安處理對(duì)小鼠睪丸指數(shù)的影響

睪丸指數(shù)可以更加客觀地評(píng)價(jià)白消安處理后小鼠睪丸大小的變化。由表1可知，10 mg/kg白消安組小鼠的睪丸指數(shù)在注射后5，7和9周顯著小于對(duì)照組(P<0.05)，而在注射后11和13周，兩組差異不顯著(P>0.05)；在注射后不同時(shí)間，對(duì)照組和10 mg/kg組的睪丸指數(shù)均顯著高于20 mg/kg白消安組(P<0.05)。

表1 白消安對(duì)小鼠睪丸指數(shù)的影響(n=8)Table 1 Effect of busulfan on mouse testicular index (n=8)

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between the control and experiment groups at the same time (P<0.05).

2.5 白消安處理后小鼠睪丸組織學(xué)變化

有完整精子發(fā)生的曲細(xì)精管占整個(gè)曲細(xì)精管的百分比可以反映白消安處理后睪丸恢復(fù)情況，因此可以通過(guò)計(jì)算每視野下帶有完整精子發(fā)生的生精小管數(shù)量占全部生精小管的百分比，來(lái)評(píng)價(jià)睪丸精子發(fā)生的恢復(fù)情況。如圖3所示，在注射白消安5，7，9，11和13周后，對(duì)照組曲細(xì)精管上皮無(wú)變化，表明精子發(fā)生未受干擾(圖3-A1，B1，C1，D1，E1)。10 mg/kg白消安組在處理后5，7，9，11和13周，帶有完整精子發(fā)生的曲細(xì)精管率分別為(49.56±8.23)%，(66.61±6.13)%，(80.24±10.42)%，(93.87±3.23)%和(92.49±4.58)%(圖3-A2，B2，C2，D2，E2)。而20 mg/kg白消安組在處理后5，7，9，11周，生殖細(xì)胞嚴(yán)重枯竭(圖3-A3，B3，C3，D3)，在處理后13周，生殖細(xì)胞有所恢復(fù) (圖3-E3)；在處理后5，7，9，11和13周，帶有完整精子發(fā)生的曲細(xì)精管率分別為(8.73±9.22)%，(9.89±6.39)%，(29.21±12.31)%，(49.64±3.59)% 和(81.99±4.98)%。

圖3 白消安對(duì)小鼠睪丸曲細(xì)精管的影響A1、B1、C1、D1和E1分別表示注射后5，7，9，11 和 13 周對(duì)照組睪丸組織學(xué)變化；A2、B2、C2、D2和E2分別表示注射5，7，9，11 和 13 周后10 mg/kg白消安組睪丸組織學(xué)變化；A3、B3、C3、D3和E3分別表示注射后5，7，9，11 和 13 周后20 mg/kg白消安組睪丸組織學(xué)變化。Bar=100 nmFig.3 Effects of busulfan on histological appearance of testis tissue in miceA1,B1,C1,D1 and E1 show the testis tissue appearance of the control (0 mg/kg of busulfan) after 5,7,9,11 and 13 weeks, respectively;A2,B2,C2,D2 and E2 show the testis tissue appearance of mice treated with 10 mg/kg of busulfan after 5,7,9, 11 and 13 weeks,respectively;A3,B3,C3,D3 and E3 show the testis tissue appearance of mice treated with 20 mg/kg of busulfan after 5,7,9,11 and 13 weeks,respectively.Bar=100 nm

2.6 白消安處理對(duì)小鼠紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量的影響

由圖4可知，10 mg/kg白消安組紅細(xì)胞數(shù)量在處理后5周與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，而在處理后7，9，11和13周均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；而白細(xì)胞數(shù)在處理后5和9周與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，但在處理后7，11和13周顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。20 mg/kg白消安組紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量在處理后5，7，9，11和13周均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；而在處理后不同時(shí)間紅細(xì)胞數(shù)量均顯著低于10 mg/kg白消安組(P<0.05)，白細(xì)胞數(shù)量?jī)H在處理后5，7和9周與10 mg/kg白消安組差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

SSCs移植技術(shù)是治療雄性不育、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種有效手段[8]。然而，合適受體模型的建立是成功移植的決定性因素。為了提高SSCs的移植成功率，需要清除內(nèi)源性的生殖細(xì)胞，從而使移植的SSCs易遷移到達(dá)生殖上皮的基膜而定居，進(jìn)而啟動(dòng)供體的精子發(fā)生過(guò)程[9]。一些研究表明，注射38～40 mg/kg白消安能完全消除內(nèi)源性精子的發(fā)生過(guò)程[7,10]。在運(yùn)用白消安處理受體時(shí)，同種動(dòng)物的不同品系對(duì)其耐受力不同[11]。Moisan等[12]報(bào)道，對(duì)RAG2小鼠用25 mg/kg白消安處理后，死亡率為12%，用30 mg/kg白消安處理后的死亡率為37%，用40和50 mg/kg白消安處理后的死亡率約為50%。在本研究中，隨著白消安劑量的增大小鼠的死亡率也在增加，在注射30 mg/kg白消安后，KM小鼠死亡率高達(dá)89.29%。說(shuō)明KM小鼠比其他小鼠對(duì)白消安更敏感，這也進(jìn)一步證實(shí)了王永彬等[13]的研究結(jié)果。通過(guò)白消安對(duì)小鼠的致死情況分析可知，10 和20 mg/kg白消安處理的小鼠死亡率較低，可作為KM小鼠的處理劑量。

圖4 白消安對(duì)小鼠紅細(xì)胞(A)和白細(xì)胞數(shù)量(B)的影響Fig.4 Effect of busulfan on number of erythrocytes (A) and leukocyte (B)

在本研究中，注射白消安后睪丸發(fā)育明顯受阻，質(zhì)量減輕，體積變小。但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，睪丸質(zhì)量和體積均有所恢復(fù)，注射低劑量(10 mg/kg)白消安組的恢復(fù)速度快于高劑量組(20 mg/kg)。張偉等[11]研究表明，以30 和40 mg/kg白消安處理ICR小鼠4和8周后，兩組小鼠睪丸質(zhì)量在處理后相同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組，但處理后12周睪丸質(zhì)量逐漸恢復(fù)，與對(duì)照組差異均不顯著，這與本研究結(jié)果相似。

睪丸指數(shù)能夠更準(zhǔn)確地反映不同個(gè)體間睪丸的大小。在本試驗(yàn)中，無(wú)論注射劑量高低，在注射白消安后9周睪丸指數(shù)明顯下降。孫淼[6]研究表明，白消安處理小鼠40 d后睪丸指數(shù)明顯下降，與本研究結(jié)果一致。隨著注射后時(shí)間的延長(zhǎng)，睪丸指數(shù)先下降，然后呈上升趨勢(shì)。而高劑量(20 mg/kg)白消安組睪丸指數(shù)恢復(fù)速度明顯低于低劑量組(10 mg/kg)。由此可說(shuō)明20 mg/kg白消安組可以為外源性SSCs在受體睪丸中遷移提供足夠的時(shí)間。由于10 mg/kg 白消安處理的受體鼠睪丸中帶有完整精子發(fā)生的曲細(xì)精管率較高，會(huì)影響供體生殖細(xì)胞向受體睪丸基膜的遷移效率，從而會(huì)使移植效率明顯降低，故此劑量白消安處理的受體鼠不適宜作為受體模型。Zohni等[14]研究表明，無(wú)論處理劑量如何，受體鼠在白消安處理后，曲細(xì)精管的恢復(fù)隨移植時(shí)間的延長(zhǎng)均表現(xiàn)為先慢后快，最后達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，與本研究結(jié)果相似。盡管在白消安處理后，受體精子發(fā)生恢復(fù)的能力受多重因素的影響[15]，但筆者認(rèn)為，白消安劑量的大小可能是最關(guān)鍵的影響因素。多數(shù)研究認(rèn)為，在白消安處理后至少4周可用來(lái)作為受體鼠[3,5]，本研究結(jié)果表明移植的時(shí)間不應(yīng)超過(guò)處理后9周，最佳移植時(shí)間為處理后5～7周。

白消安能引起骨髓微環(huán)境破壞從而影響造血細(xì)胞的修復(fù)，使造血細(xì)胞再生能力降低。本研究結(jié)果表明，白消安處理后，小鼠血液中白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量均有所減少，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后逐漸恢復(fù)。血細(xì)胞數(shù)量隨著白消安處理劑量的升高呈劑量依從性降低[16]，說(shuō)明白消安對(duì)小鼠的亞致死性可能是由于貧血和抵抗力下降所致。所以，研究適宜的白消安處理劑量和把握合適的移植時(shí)間，在SSCs移植的臨床應(yīng)用上具有重要的意義。本研究結(jié)果表明，注射20 mg/kg白消安小鼠的死亡率較低，且睪丸恢復(fù)較慢，可用于精原干細(xì)胞移植，最佳移植時(shí)間為白消安處理后 5～7 周。

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Establishment of transplantation model for spermatogonial stem cells in Kunming mice with busulfan treatment

WANG Ju-huaa,XIE Qian-qiana,FAN Cai-yuna,FANG Fu-guia,ZHOU Jiea,CAO Hong-guoa,ZHANG Xiao-ronga,b

(aCollegeofAnimalScienceandTechnology,bAnhuiProvincialLaboratoryofLocalLivestockandPoultryGeneticResourceConservation,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 Different doses of busulfan were injected to Kunming (KM) mice at age of 6 weeks by intra-abdominal to produce receptor model for transplantation of spermatogonial stem cells.【Method】 A total of 104 male KM mice were randomly divided into 4 groups and treated with different doses of busulfan (0,10,20 and 30 mg/kg body weight).After 5,7,9,11 and 13 weeks,mortality,body weight,testicle weight,the testicular index,the number of seminiferous tubule with spermatogenesis and blood cells were analyzed.【Result】 The mortalities were 0 (0/22),11.54% (3/26),17.86% (5/28) and 89.29% (25/28) for 0,10,20 and 30 mg/kg groups,respectively.Testicular indexes in control were significantly higher than in 10 mg/kg group 5,7,and 9 weeks after busulfan treatment (P<0.05).However,11 and 13 weeks after busulfan treatment,they were insignificantly different (P>0.05).Regardless of injecting dose,testicular index in 20 mg/kg group were significantly higher than the control and 10 mg/kg group (P<0.05) all the time.Seminiferous epithelia of the control group had no obvious degenerative changes after 5,7,9,11 and 13 weeks.The tubules with complete spermatogenesis were (49.56±8.23)%,(66.61±6.13)%,(80.24±10.42)%,(93.87±3.23)% and (92.49±4.58)% in 10 mg/kg group.(8.73±9.22)%,(9.89±6.39)%,(29.21±12.31)%,(49.64±3.59)% and (81.99±4.98)% of seminiferous tubules showed complete spermatogenesis in 20 mg/kg group after 5,7,9,11 and 13 weeks.The number of blood cells changed along with time and dose of busulfan treatment. 【Conclusion】 The optimal dose of busulfan was 20 mg/kg and the most appropriate time for transplantation was 5-7 weeks after busulfan treatment.

spermatogonial stem cells;busulfan;KM mouse;transplantation model

2014-01-21

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)項(xiàng)目(2011AA100307)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2009ZX08008-007B)

王菊花(1975-)，女，內(nèi)蒙古錫盟人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生殖生理研究。 E-mail：wjhxxh@163.com

章孝榮(1954-)，男，安徽樅陽(yáng)人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物繁育及胚胎生物技術(shù)。

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.028

S865.1+3

A

1671-9387(2015)08-0051-06

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