呂颯美，吳友偉，周健，史麗萍

(陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)2科，西安 710068)

·基礎(chǔ)研究·

血紅素氧合酶-1對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注NF-κB p65和細(xì)胞凋亡的影響

呂颯美，吳友偉，周健，史麗萍

(陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)2科，西安 710068)

目的 探討血紅素氧合酶-1(HO-1)對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注NF-κB P65、細(xì)胞凋亡的影響。方法 SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成5組：正常組(N)，假手術(shù)組(S)，手術(shù)組(I/R建立肝臟缺血再灌注損傷模型)，手術(shù)給藥Ⅰ組(I/R+hemin)，手術(shù)給藥Ⅱ組(I/R+ZnPP)，手術(shù)后6 h、 12 h下腔靜脈取血分離血清檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。Western blot方法測(cè)定肝臟NF-κB p65的表達(dá)，免疫組化方法測(cè)定肝臟Fas蛋白的表達(dá)。結(jié)果 ①hemin組 ALT、AST較I/R組及ZnPP組明顯降低(P<0.01)；②肝組織NF-κB p65的表達(dá)：hemin組NF-κB p65表達(dá)比同期I/R組減少(P<0.01)；ZnPP組NF-κB p65表達(dá)比同期I/R組增多(P<0.01)； ③肝組織Fas：hemin組Fas表達(dá)減少(P<0.05)，ZnPP組Fas表達(dá)明顯增多(P<0.01)。結(jié)論 HO-1對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用與NF-κBP65密切相關(guān)，可能通過(guò)抑制NF-κB p65的活性來(lái)減少細(xì)胞凋亡。

肝疾病；再灌注損傷 ;p65亞基NF-κB;氧合酶類;大鼠,sprague-dawley

血紅素氧合酶-1(HO-1)是生物體內(nèi)催化血紅素分解過(guò)程中一種關(guān)鍵的限速酶，具有重要的生物作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，其在細(xì)胞應(yīng)激、組織損傷及細(xì)胞凋亡的防治中發(fā)揮著一定的作用[1]。核因子NF-KB能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。國(guó)外研究表明[2-3]：NF-κB在某些環(huán)境下可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，探討血紅素氧合酶-1對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注NF-κBP65、細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的SD雄性大鼠54只，體重200～275 g，合格證號(hào)：SCXK(陜)2007-002。主要試劑：Hemin Znpp均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體及DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 缺血再灌注模型建立 大鼠禁食12 h后，氯胺酮80 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。

建立原位肝I/R模型：取上腹正中切口，入腹后分離肝十二指腸韌帶，充分顯露第一肝門部， 用無(wú)損傷血管夾夾閉肝中葉和左外側(cè)葉的肝動(dòng)脈、門靜脈， 以造成70%的肝臟缺血模型，但不阻斷肝右葉、尾狀葉血流，以防胃腸道淤血及再灌注后腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素回流入肝臟對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的不良影響。當(dāng)缺血30 min后，松開(kāi)血管夾，恢復(fù)缺血肝葉的入肝血流。N組僅剖腹取血及肝組織，S組入腹后只游離肝門血管，不阻斷肝門血供，于術(shù)后第6、12 小時(shí)取血及肝組織；I/R組及I/R+hemin組、I/R+ZnPP組均進(jìn)行I/R手術(shù)，并分別再灌注后第6、12小時(shí)處死動(dòng)物，取血、切取肝左葉組織，分別用于各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定、組織學(xué)檢查。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組。⑴正常組(N)6只；⑵假手術(shù)組(S)12只；⑶手術(shù)組(I/R)：12只，游離肝門血管，分清供應(yīng)肝左葉和中葉的肝動(dòng)脈和門靜脈，肝臟缺血30 min，再灌注6 h和12 h；⑷手術(shù)給藥Ⅰ組(I/R+hemin)：12只，術(shù)前24 h、12 h大鼠腹腔注射hemin(氯鐵血紅素)，每次30 μmol/kg體重，余同手術(shù)組；⑸手術(shù)給藥Ⅱ組(I/R+ZnPP)：12只術(shù)前24 h、12 h大鼠腹腔注射ZAPP，每次10 μmol/kg體重；其余各組予等量生理鹽水腹腔注射。其中S組、I/R組、I/R+hemin組和I/R+ZnPP組再各分為缺血再灌注后6 h及12 h兩個(gè)亞組。

1．4 觀察項(xiàng)目 ①血清肝臟酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：手術(shù)后6 h、 12 h下腔靜脈取血分離血清用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。②Western Blot方法測(cè)定肝臟NF-κBp65的表達(dá)。③免疫組化染色檢測(cè)肝組織Fas蛋白的表達(dá)，以細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，用Motic Med 6.0醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖象進(jìn)行采集和分析?；叶戎禂?shù)值越小，表明陽(yáng)性表達(dá)越多。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間比較進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 血清ALT、AST檢測(cè)結(jié)果 肝臟缺血再灌注后I/R組與S組相比，術(shù)后6 h和12 h時(shí)血清ALT、AST明顯增高(P<0.01)，術(shù)前給予hemin，則在再灌注6 h、12 h時(shí)，血清ALT、AST均比同期I/R組血清ALT、AST水平降低(P<0.01)，術(shù)前給予ZnPP，則在再灌注6 h、12 h時(shí)，血清ALT、AST均比同期I/R組血清ALT、AST水平增高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肝組織Fas蛋白免疫組化染色結(jié)果 肝臟缺血再灌注后6 h、12 h時(shí)，I/R+hemin組與同期I/R組比較，發(fā)現(xiàn)I/R+hemin組Fas表達(dá)減少(P<0.01)，I/R+ZnPP組與同期I/R組比較，發(fā)現(xiàn)I/R+ ZnPP組Fas表達(dá)增多(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組6 h、12 h測(cè)定結(jié)果對(duì)比

注：與正常組比較，aP<0.01；與假手術(shù)組比較，bP<0.01；與I/R比較，cP<0.01,dP<0.05

2．3 各組大鼠肝組織NF-κB P65 Western plot測(cè)定結(jié)果 I/R組和S組、N組比較，在再灌注6 h、12 h時(shí)，肝組織NF-κB p65表達(dá)明顯增高(P<0.01)；與I/R+hemin組比較，發(fā)現(xiàn)再灌注6 h、12 h時(shí)，I/R+hemin組的NF-κB p65的表達(dá)明顯低于同期I/R組(P<0.01)，I/R+ZnPP組的NF-κB p65的表達(dá)明顯高于同期I/R組(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖2。

3 討論

HO-1作為亞鐵血紅素代謝的關(guān)鍵酶，不僅能催化血紅素生成一氧化碳、自由鐵和膽綠素，而且具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用，抗凋亡的作用也成為研究熱點(diǎn)[4]。血清ALT、AST是反應(yīng)肝臟損傷的重要酶學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，I/R組血清ALT、AST活性顯著升高，提示缺血再灌注后肝臟發(fā)生明顯組織病理?yè)p傷，hemin組，在再灌注6 h、12 h時(shí)，血清ALT、AST均比同期I/R組水平降低(P<0.01)，ZnPP組，則在再灌注6 h、12 h時(shí)，血清ALT、AST均比同期I/R組血清ALT、AST水平增高(P<0.01)，說(shuō)明HO-l對(duì)缺血再灌注后肝組織損傷具有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用究竟通過(guò)什么機(jī)制而來(lái)，很多學(xué)者認(rèn)為NF-κB起了關(guān)鍵作用。NF-κB可能是啟動(dòng)Fas及Fas配體等促凋亡基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，肝臟缺血再灌注過(guò)程中NF-κB活化可以調(diào)節(jié)凋亡最重要相關(guān)基因的表達(dá)，可能引起凋亡基因表達(dá)上升、抑凋亡基因表達(dá)下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。

Ben-Ari等[6]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HO-1，對(duì)肝臟I/R有保護(hù)作用，NF-κB的抑制蛋白IκBa增多，NF-κB表達(dá)減少，肝細(xì)胞凋亡減少。本研究通過(guò)建立肝臟I/R模型觀察NF-κB變化，也取得相類似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在再灌注6 h、12 h時(shí)，I/R組肝組織NF-κB p65的表達(dá)較N組、S組明顯增高，說(shuō)明肝臟缺血再灌注時(shí)NF-κB的活性增高，通過(guò)NF-κB的活化上調(diào)致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致肝臟的損害，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HO-1高表達(dá)時(shí)NF-κB p65表達(dá)減少，F(xiàn)as蛋白表達(dá)降低，而抑制HO-1表達(dá)時(shí)NF-κB p65表達(dá)增高，F(xiàn)as蛋白表達(dá)增高，推測(cè)HO-1可以減少細(xì)胞凋亡，可能通過(guò)抑制NF-κB p65的活性，減少細(xì)胞通過(guò)Fas/FasL通路發(fā)生凋亡，從而達(dá)到減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用。

HO-1的肝臟保護(hù)作用可能與抑制NF-κB p65的活性有關(guān)，但HO-1通過(guò)何種途徑抑制NF-κB p65的活性，是否是因?yàn)镹F-κB的抑制蛋白IκBa的增加，還是通過(guò)其他的機(jī)制，并不十分清楚，尚有待于進(jìn)一步研究。

(本文圖1,2見(jiàn)插圖5-2)

[1] Wu BJ,Chen K,Barter PJ,et al.Niacin inhibits vascular inflammation via the induction of heme Oxygenase-1[J].Circulation,2012,125(1):150-158.

[2] Sass G,Barikbin R,Tiegs G.The multiple functions of heme oxygenase-1 in the liver[J].Z Gastroenterol,2012，50(1):34-40.

[3] Karin M.NF-kappaB and cancer: mechanisms and targets[J].Mol Carcinog，2006.45(6): 355-361.

[4] Choi BM,Lim DW，Lee JA，et al.Luteolin suppresses cisplatin induced apoptosis in auditory cells：possible mediation through induction of heme oxygenase-1 expression[J].J Med Food，2008,11(2)：230-236.

[5] Gutierrez SH,Kuri MR,del CER.Cardiac role of the transcription factor NF-kappaB[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2008,8(2): 153-160.

[6] Ben-Ari Z,Issan Y,Katz Y，et al.Induction of heme oxygenase-1 protects mouse liver from apoptotic ischemia/reperfusion injury[J].Apoptosis,2013,18(5):547-555.

Effects of heme oxygenase-1 on NF-κB p65 and apoptosis in rats during the liver ischemia /reperfusiondamage

LvSaimei，WuYouwei，ZhouJian，ShiLiping

(DepartmentofDigestionⅡ，ShanxiProvincialPeople′sHospital，Xi′an710068，China)

Objective To explore the effects of Heme Oxygenase-1 on NF-κB P65 and apoptosis in rats during the liver ischemia/eperfusion damage.Methods SD rats were randomly divided into five groups：normal control group，sham group，I/R group， I/R+hemin group，and I/R+ZnPP group.Blood samples were collected from the postcava at 6h and12h after the operation，and the serum was isolated to measure alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST).The expressions of NF-κBp65 and Fas protein in livers of rats were examined by western blot and immunohistochemistry.Results ①The levels of ALT and AST were significantly lower in hemin group than those in I/R group and ZnPP group(P<0.01).②The expression of NF-κB p65 was lower in hemin group than those in I/R group(P<0.01);the expression of NF-κB p65 was higher in ZnPP group than those in I/R group (P<0.05).③The expression of Fas protein was markedly increased in ZnPP group than those in hemin group(P<0.01).Conclusion Protective effects of HO-1 against hepatic ischemia/reperfusion damage were closely related to the reduced NF-κB P65 expression,which maybe decreased the apoptosis via inhibit activity of NF-κBp65.

Liver diseases;Reperfusion injury;NF-kappa B p65 subunit;Oxygenases;Rats,sprague-dawley

呂颯美，副主任醫(yī)師,Email：daodao2002@126.com

R575

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.018

2015-05-07)