金子夜，王心淼，郜青葉，閆莉麗，王英洲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院眼科,呼和浩特 010010)

·論著·

老年性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)改變及凋亡相關(guān)基因的表達

金子夜，王心淼，郜青葉，閆莉麗，王英洲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院眼科,呼和浩特 010010)

目的 研究晶狀體上皮細胞凋亡對白內(nèi)障發(fā)展所起的作用。方法 收集老年性及糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜送電鏡掃描，取老年性及糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜各5例，用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢測法，檢測凋亡相關(guān)基因的表達。結(jié)果 老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞形態(tài)大小不一,多扁平細胞，細胞間隙增大,胞漿內(nèi)可見空泡變性,部分細胞溶解壞死,部分細胞皺縮,呈早期細胞調(diào)亡改變；糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞的胞漿空泡變性更加嚴重，兩種白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中均可見凋亡細胞。糖尿病患者白內(nèi)障晶狀體前囊膜樣本中Fas、p53與Bax基因的表達顯著高于老年性患者。結(jié)論 老年性和糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體上皮細胞的凋亡密切相關(guān)。

白內(nèi)障; 晶體;上皮細胞; 細胞凋亡

白內(nèi)障是一種常見的致盲眼病，對于其發(fā)病機制，有研究[1-3]發(fā)現(xiàn)外線、過氧化氫和鈣離子均可誘發(fā)晶狀體上皮細胞(LEC)凋亡，認為晶狀體上皮細胞凋亡是非先天性白內(nèi)障共同的細胞學基礎(chǔ)。Fas、Bax和P53基因是調(diào)控細胞凋亡的重要因子。本研究對15例老年性白內(nèi)障和15例糖尿病性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜進行了細胞凋亡特征的檢測，通過反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢測法對調(diào)控細胞凋亡的基因Fas、Bax和P53在老年性和糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中的表達差異進行檢測，并對兩種白內(nèi)障的晶狀體上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)進行了觀察，旨在探討老年性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生與細胞凋亡的關(guān)系及兩者間凋亡相關(guān)基因的表達差異。

1 材料和方法

1.1 標本收集 從2012年至2014年在我院眼科住院并進行白內(nèi)障超聲乳化摘除術(shù)的60～80歲老年性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障患者中各隨機挑選出15例15眼，白內(nèi)障組平均年齡為(67.3±5.7)歲，其中男9例,女6例；糖尿病組平均年齡為(63.3±4.2)歲，其中男8例女7例。在手術(shù)中用撕囊鑷撕取直徑約為6 mm的晶狀體前囊膜并進行保存。兩組中各隨機取10例進行晶狀體上皮細胞的電鏡觀察，各取5例進行RT-PCR檢測相關(guān)凋亡基因。

1.2 主要儀器 AEM-1200 型透射電子顯微鏡；渦旋振蕩儀QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機Centrifuge 5415D，Eppendorf；分光光度計NANODROP 2000，Therno scientific；熒光定量PCR儀ABI7500，Applied Biosystems。

1.3 主要試劑 TRNzol總RNA提取試劑，天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa(寶生物)；SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus，TaKaRa(寶生物)；DL2,000 DNA Marker，TaKaRa(寶生物)；引物合成，Invitrogen。

1.4 實驗方法

1.4.1 電鏡 手術(shù)顯微鏡下用撕囊鑷撕取直徑約6 mm 的晶狀體前囊膜。用0.9%氯化鈉溶液沖洗后使用2.5%戊二醛在4 ℃冰箱中固定2 h以上，再使用0.1 M磷酸鹽緩沖液沖洗3次，1%鋨酸固定1 h左右，再用0.1 M磷酸鹽緩沖液沖洗3次，用乙醇進行梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后經(jīng)飽和醋酸鈾染色30 min，檸檬酸鉛染色8 min，采用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)并照相。

1.4.2 RT-PCR (1)采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，把組織放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨,待組織樣本成粉末狀后，加入Trizol，加氯仿0.2 mL，離心后吸取上層水相(吸70%)到另一新離心管管中，加入等體積的-20 ℃預(yù)冷異丙醇,充分顛倒混勻，置于冰上10 min；按1 mL/mL Trizol的比例加入75%DEPC乙醇懸浮沉淀 (4 ℃保存)，高速離心5 min；棄去乙醇液體，室溫下放置5 min以充分晾干沉淀,加入DEPC處理過的水溶解沉淀； 采用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度,凍存于-80 ℃。(2)采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，去除基因組DNA反應(yīng)，取隨機引物5×gDNA Eraser Buffer2.0 μL、gDNA Eraser 1.0μL和RNase Free H2O Up to 10μL于42℃孵育2 min。再將上一步驟的反應(yīng)液 10.0μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μL、RNase Free H2O 4.0 μL 37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s，cDNA保存放-20 ℃冰箱備用。(3)用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。用SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus), ROX plus進行擴增，引物篩選：將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。

2 結(jié)果

2.1 實驗結(jié)果

2.1.1 電鏡結(jié)果 老年性白內(nèi)障組：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞形態(tài)大小不一,細胞排列紊亂，大多呈扁平狀,扁平狀細胞細胞核是橢圓形或不規(guī)則形,核縮小,核內(nèi)染色質(zhì)不均勻,邊聚或者濃縮。核膜皺折,核周間隙增寬。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性,胞漿有濃縮。

糖尿病性白內(nèi)障組：糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞大多呈扁平狀,細胞核、細胞膜的變化與老年性白內(nèi)障患者基本相同。胞質(zhì)內(nèi)很少有細胞器,胞質(zhì)大部分呈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性,空泡變性比老年性白內(nèi)障患者嚴重,胞質(zhì)也有濃縮。

2.1.2 RT-PCR結(jié)果

2.1.2.1 RNA電泳圖 取5 μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳, 見圖1。

2.1.2.2 各樣品相對定量分析結(jié)果 根據(jù)RealTimePCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計算公式，即

2.2 各樣品的目的基因相對定量結(jié)果 即其他各個樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。由表1可見，糖尿病患者白內(nèi)障晶狀體前囊膜樣本中Fas、p53與Bax基因的表達顯著高于老年性患者，由于個體差異原因，在同一種疾病的患者群體里，F(xiàn)as、p53與Bax基因分別表達的量并不一致，但從群體角度分析，糖尿病患者的表達量顯著高于老年性患者。

3 討論

晶狀體上皮細胞凋亡與白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系已引起人們關(guān)注[2]。有研究[4]比較了年齡相關(guān)性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞的凋亡情況，免疫組織化學及RT-PCR表明糖尿病組比白內(nèi)障組Fas及其mRNA 的表達增高，說明凋亡在白內(nèi)障中發(fā)揮重要的作用, 并且可能是通過Fas介導的途徑。 P53是一種典型的抑癌基因，是重要的腫瘤抑制基因，能促進細胞凋亡,通過bax/bcl2, Fas/Apol，IGF-BP3 等蛋白，p53可完成對細胞凋亡的調(diào)控作用。Bel-2是一個家族基因，bel-2、bel-XL、bax和bel-XS是該家族的重要成員，它們主要通過線粒體途徑參與凋亡調(diào)控Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用，而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C 的釋放，具有凋亡作用，p53可以上調(diào)Bax的表達水平并下調(diào)Bcl-2的表達，從而完成促進細胞凋亡作用。國內(nèi)已有文獻報道[5-7]，老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細胞Bax基因蛋白表達呈陽性，而健康成年人晶狀體上皮細胞幾乎未見Bax基因蛋白的表達。這提示我們，白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體上皮細胞的凋亡關(guān)系密切，而Bax在高表達又與白內(nèi)障晶狀體上皮細胞凋亡有著密切的關(guān)系。

表1 Real Time PCR檢測相對定量結(jié)果

注：以糖1 樣本為對照樣本

在本研究中，老年性及糖尿病性白內(nèi)障的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果顯示晶狀體上皮細胞內(nèi)可見空泡變性，部分細胞的細胞器腫脹，細胞皺縮，細胞核中染色質(zhì)固縮周邊化，呈早期凋亡改變，糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中的空泡變性較老年性白內(nèi)障患者嚴重，胞質(zhì)也有濃縮。通過RT-PCR進行檢測，結(jié)果顯示，在糖尿病性白內(nèi)障組晶狀體上皮細胞中的Fas、Bax和P53的表達比老年性白內(nèi)障組高，說明糖尿病患者白內(nèi)障晶狀體前囊膜的細胞凋亡程度相比老年性患者更加嚴重。

(本文圖1見插圖5-1)

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Expression of apoptosis related factors and ultrastruetural changes in the lens epithelial cells of senile and diabetic cataract

JinZiye,WangXinmiao,GaoQingye，YanLili，WangYinzhou

(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010010，China)

WangXinmiao,Email:1977king@163.com

Objective To study the effect of lens epithelial cell apoptosis in cataract development.Methods Five cases anterior lens capsules of senile and diabetic cataract respectively were collected.Transmission electron microscope was used to observe the anterior lens capsules.The apoptosis-related genes were detected by Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction. Results The epithelial cell of senile cataract lens differed in size, usually as flat epithelial cells, intercellular space dilatation, vacuoles degeneration can be seen in the cytoplasm,dissolve putrescence of part cytolysis necrosis,show the change of early cell apoptosis.The vacuoles degeneration of cytoplasm in diabetic cataract was more serious than senile.The apoptotic cell were seen in two cataract lens.The expression of Fas,p53 and Bax of diabetic cataract were higher than those in senile.Conclusions Epithelial cell apoptosis is closely related to the development of senile and diabetic cataract.

Cataract; Lens,crystalline;Epithelial cells;Apoptosis

內(nèi)蒙古科技廳基金資助(20110501)

金子夜，醫(yī)師，Email: jinziye1987@126.com

王心淼，主治醫(yī)師， Email：1977king@163.com

R776.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.011

2015-06-10)

ExpressionofapoptosisrelatedfactorsandultrastrueturalchangesinthelensepithelialcellsofsenileanddiabeticcataractJinZiye,WangXinmiao,GaoQingye，YanLili，WangYinzhou