馬忠鋒，柴家科，楊紅明，許明火

體外構建組織工程皮膚修復Ⅲ度燙傷切痂創(chuàng)面的實驗研究

馬忠鋒，柴家科，楊紅明，許明火

目的觀察體外構建的組織工程皮膚修復大鼠Ⅲ度燙傷切痂創(chuàng)面的可行性和效果。方法酶消化法獲取SD乳鼠表皮細胞和成纖維細胞(Fb)后進行體外培養(yǎng)，同時用高滲鹽水/氫氧化鈉法制備無細胞毒性豬去細胞真皮基質(PADM)，然后將Fb與Ⅰ型牛膠原混合種植于PADM的表面，以SD乳鼠的第3代表皮細胞種植在真皮基質膠原面獲取組織工程皮膚，以SD乳鼠的第3代表皮細胞制備表皮細胞膜片。對48只SD大鼠Ⅲ度燙傷切痂創(chuàng)面分別行組織工程皮膚移植(實驗組)和單純表皮細胞膜片移植(對照組)，術后行大體觀察和組織學觀察，比較各組創(chuàng)面愈合率、收縮率?？笴D34單克隆抗體免疫組化染色標記血管內(nèi)皮細胞后行創(chuàng)面微血管計數(shù)，抗Laminin免疫組化染色觀察基底膜中層黏連蛋白的表達情況。結果兩組創(chuàng)面術后均未見對移植物的急性期免疫排斥反應，第2、4、6周實驗組移植物成活率分別為75.05%±3.69%、83.12%±3.13%、92.03%±3.87%，與對照組(分別為77.63%±3.23%、83.17%±3.92%、91.09%±3.35%)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后第2、4、6周實驗組移植物收縮率分別為9.13%±2.27%、18.52%±3.40%、23.92%±3.01%，明顯低于對照組(分別為14.21%±3.05%、29.12%±3.02%、39.78%±3.42%，P<0.05)。術后6周實驗組基底膜結構清晰、連續(xù)，對照組基底膜區(qū)模糊、不連續(xù)。第4、6周后實驗組微血管數(shù)目分別為37.5±3.9、46.9±3.5個/HP，明顯高于對照組(分別為23.0±2.0、27.5±2.7個/HP，P<0.05)。結論以Fb-膠原-PADM活性復合真皮基質為載體，與表皮細胞構建的組織工程皮膚，適用于修復Ⅲ度燙傷切痂創(chuàng)面，能改善創(chuàng)面愈合質量。

組織工程；皮膚，人工；燒傷；傷口愈合

在大面積燒傷患者創(chuàng)面修復中常遇到皮源不足的問題，組織工程皮膚的研究為臨床創(chuàng)面修復提供了一條新的途徑。本實驗在我們以往組織工程皮膚研究[1]的基礎上，構建以成纖維細胞(Fb)-膠原-豬去細胞真皮基質(PADM)為載體的乳鼠組織工程皮膚，用其進行大鼠Ⅲ度燙傷切痂創(chuàng)面移植，并與單純體外培養(yǎng)的表皮細胞膜片創(chuàng)面移植效果進行對比，以期為臨床提供一種理想的修復創(chuàng)面及有效改善外觀的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 Dispase-Ⅱ、胰蛋白酶、EDTA、DMEM、胎牛血清、乙酸、Ⅰ型牛膠原、氫氧化鈉、氯化鈉、兔抗Laminin抗體(美國Sigma公司)，兔抗鼠CD34抗體(美國Santa Cruz公司)。無血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，培養(yǎng)板(美國Corning公司)。超凈臺(日本三洋公司，MCO-15AC)、CO2孵箱(日本三洋公司，YD-1320)，離心機(美國SIGMA，1-13)，倒置顯微鏡(日本Olympus，MT-2)，自制絲網(wǎng)架，水浴恒溫振蕩器、鼓式取皮刀(上海醫(yī)療器械廠)，真空冷凍干燥機(德國Christ公司)，超聲波清洗機(瑞典Branson)。

1.2 乳鼠表皮細胞和成纖維細胞的體外培養(yǎng)[2]取SD乳鼠全層皮膚，采用酶消化法獲取表皮細胞和成纖維細胞，以無血清培養(yǎng)基進行體外原代、傳代培養(yǎng)，取第3代表皮細胞及第10代成纖維細胞用于實驗。

1.3 表皮細胞膜片的制備 表皮細胞種植于直徑60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)8d后融合為細胞膜片，應用前吸去培養(yǎng)液，以直徑60mm的凡士林紗布平鋪于細胞融合成片的培養(yǎng)皿底部，加入0.25% Dispase-Ⅱ，在37℃下消化15min后吸去酶液，用PBS洗滌1次，輕輕揭起凡士林紗布，即得到完整的表皮細胞膜片。

1.4 PADM制備 取豬斷層皮片，按照高滲鹽水/氫氧化鈉法制備PADM，具體方法參照文獻[3]。

1.5 乳鼠組織工程皮膚的制備 用手術刀片在組織工程皮膚上刺孔，孔間距約3mm，制備以Fb-膠原-PADM活性真皮基質為載體的乳鼠組織工程皮膚。

1.6 實驗動物及分組 取健康SD大鼠48只，雌雄不限，體重230～250g。3%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，背部去毛，以100℃水浴12s造成背部直徑約3cm大小的Ⅲ度燙傷，切除全層皮膚至深筋膜。創(chuàng)面止血后，將其四角皮膚各縫合一針與肌層固定。隨機分為兩組(n=24)：實驗組采用體外培養(yǎng)的組織工程皮膚植皮，對照組采用單純表皮細胞膜片植皮。創(chuàng)面移植后用鹽水紗布、凡士林紗布及無菌敷料覆蓋，打包固定。術后單籠飼養(yǎng)。

1.7 創(chuàng)面愈合情況的大體觀察 每組分別在術后第2、4、6周各處死8只動物，動態(tài)觀察創(chuàng)面愈合情況。用數(shù)碼相機照相，利用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)分析，計算移植物成活率和收縮率。移植物成活率=移植物成活面積/移植總面積× 100%。移植物收縮率=(移植面積－檢測時面積)/移植面積×100%。

1.8 創(chuàng)面組織學觀察 術后第2、4、6周分別處死的8只動物，取創(chuàng)面組織做以下檢查：①活檢組織常規(guī)制成石蠟切片，HE染色；②兔抗人Laminin抗體免疫組化染色，具體操作按照試劑盒說明進行。

1.9 創(chuàng)面微血管計數(shù) 對各組第2、4、6周的創(chuàng)面組織標本，采用兔抗鼠CD34單克隆抗體免疫組化染色，標記血管內(nèi)皮細胞，具體操作按試劑盒說明進行。石蠟切片常規(guī)脫蠟及梯度水化，用EDTA抗原修復液進行熱修復后，依次加入一抗、二抗進行系列染色。用PBS代替一抗作為陰性對照。染成棕色、孤立的血管內(nèi)皮細胞或細胞簇視作單個微血管。先在低倍鏡下全面觀察切片，以確定組織血管密度最高處，再在高倍鏡(×200)下隨機選擇5個視野，計數(shù)每個視野所含的微血管數(shù)，取其平均值進行統(tǒng)計學處理。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結果以表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 術中情況 體外培養(yǎng)的乳鼠組織工程皮膚質地柔軟，易于塑型，有良好的彈性和抗拉能力，與創(chuàng)面緊密粘貼，便于手術操作，不容易滑動。

2.2 創(chuàng)面大體觀察 各實驗大鼠清醒后精神狀態(tài)及進食正常，均可自由活動。術后2周首次打開敷料，各組創(chuàng)面均未見對移植物的急性排斥反應，創(chuàng)面及周圍炎癥反應不明顯。術后2周，實驗組創(chuàng)面除邊緣有部分裸露，移植的組織工程皮膚大部分質地柔軟、色澤紅潤，創(chuàng)面收縮不明顯，皮下無積血、積液，深層的PADM已與肌肉組織之間建立血運且連接緊密；對照組植皮區(qū)敷料可見較多液體滲出，創(chuàng)面輕度收縮。術后4周實驗組PADM與深層組織結合更加緊密，植皮區(qū)移植物收縮不明顯，創(chuàng)面基本無液體滲出，愈合不佳處可見肉芽組織；對照組植皮區(qū)仍有液體滲出，局部有創(chuàng)面破潰，局部增生明顯，移植物可見收縮。術后6周實驗組與對照組的創(chuàng)面均基本愈合，皮片有脫屑，無毛發(fā)生長，實驗組創(chuàng)面柔韌性較好，很容易提捏，創(chuàng)面較光滑、平整，抗摩擦性強，而對照組創(chuàng)面柔韌性較差，不容易提捏，皮膚彈性差，創(chuàng)面可見瘢痕攣縮。

2.3 移植物成活率和創(chuàng)面移植物收縮率 實驗組術后各時間點移植物成活率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。對照組移植物可見比較明顯的攣縮，皮片薄，抗摩擦性弱，皮膚彈性較差，創(chuàng)面收縮明顯，其術后2、4、6周的移植物收縮率均明顯高于實驗組(P<0.05，表2)。

表1 兩組術后創(chuàng)面移植物成活率比較(%，±s)Tab. 1 Comparison of the survival rate of wound graft healing between two groups after operation (%,±s)

表1 兩組術后創(chuàng)面移植物成活率比較(%，±s)Tab. 1 Comparison of the survival rate of wound graft healing between two groups after operation (%,±s)

Group 2 weeks (n=24) 4 weeks (n=16)6 weeks (n=8) Experiment group 75.05±3.69 83.12±3.13 92.03±3.87 Control group 77.63±3.23 83.17±3.92 91.09±3.35

表2 兩組術后創(chuàng)面移植物收縮率比較(%，±s)Tab. 2 Comparison of the rate of wound graft contraction between two groups after operation (%,±s)

表2 兩組術后創(chuàng)面移植物收縮率比較(%，±s)Tab. 2 Comparison of the rate of wound graft contraction between two groups after operation (%,±s)

(1)P<0.05 compared with control group

Group 2 weeks (n=24) 4 weeks (n=16) 6 weeks (n=8) Experiment group 9.13±2.27(1) 18.52±3.40(1) 23.92±3.01(1)Control group 14.21±3.05 29.12±3.02 39.78±3.42

2.4 組織學檢查 術后2周兩組表皮細胞分化均不明顯，真皮層內(nèi)有大量炎性細胞浸潤。術后4周實驗組可見表皮結構有分層，細胞分化明顯，真皮層內(nèi)有較多的成纖維細胞，間質可見少許炎性細胞浸潤，可見豐富的毛細血管結構垂直于創(chuàng)面生長，而對照組表皮細胞分化仍較差。術后6周實驗組皮膚結構較完整，分層接近正常，真皮層內(nèi)膠原纖維排列規(guī)整，可見豐富的毛細血管結構垂直于創(chuàng)面生長，表皮真皮連接區(qū)的乳頭結構明顯。對照組術后6周表皮層較薄，表皮細胞分化程度較實驗組差，基底細胞平坦(圖1)，真皮內(nèi)膠原纖維排列疏松紊亂，表皮真皮交界區(qū)乳頭結構不明顯。免疫組化抗Laminin染色顯示兩組均在基底膜區(qū)及真皮血管束周圍呈陽性反應，其中實驗組基底膜區(qū)染色較深，基底膜連續(xù)性好，對照組基底膜區(qū)染色較淡，基底膜連續(xù)性較差(圖2)。

2.5 微血管計數(shù) 術后2周兩組微血管計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后4周實驗組微血管生成活躍，術后6周實驗組微血管形態(tài)和形成過程已接近于正常皮膚，微血管計數(shù)數(shù)均明顯高于對照組(P<0.05，表3)。

圖1 兩組術后6周移植物組織學觀察(HE ×200)Fig. 1 Histological characteristic of the graft in two groups at the 6th week (HE×200) A. Experiment group; B. Control group

圖2 兩組術后6周基底膜抗Laminin染色結果(×200) Fig. 2 The anti-laminin staining of basement membrane in two groups at the 6th week (×200)A. Experiment group; B. Control group

表3 兩組術后創(chuàng)面微血管計數(shù)比較(/HP，±s，n=8)Tab. 3 Comparison of the microvessel count between the two groups after operation (/HP,±s,n=8)

表3 兩組術后創(chuàng)面微血管計數(shù)比較(/HP，±s，n=8)Tab. 3 Comparison of the microvessel count between the two groups after operation (/HP,±s,n=8)

(1)P<0.05 compared with control group

Group 2 weeks (n=24) 4 weeks (n=16)6 weeks (n=8) Experiment group 19.1±1.8 37.5±3.9(1) 46.9±3.5(1)Control group 20.4±2.1 23.0±2.0 27.5±2.7

3 討 論

Rheinwald等[4]在1975年報道了較為理想的表皮細胞培養(yǎng)技術，O'Conner等[5]將培養(yǎng)的表皮細胞膜片直接應用于燒傷創(chuàng)面并取得成功。但單純的表皮替代物存在皮片菲薄，操作困難，移植后創(chuàng)面接受率低，愈合后上皮組織彈性不佳，耐磨性差，后期易發(fā)生破潰、瘢痕攣縮嚴重、組織結構不完整等缺點。Apligraft作為商品化的組織工程全層皮膚，為燒傷患者的治療帶來了一種新的手段，但其費用昂貴，抗膠原酶消化能力弱，抗感染能力差，且應用到創(chuàng)面后降解過快。組織學檢測表明，Apligraft應用于人體急性創(chuàng)面后細胞滲透性好，但新生血管形成能力較差，移植4周時創(chuàng)面尚能檢測到異體細胞的染色體，但移植6周后已經(jīng)檢測不到異體細胞，Apligraft已經(jīng)降解。故Apligraft在創(chuàng)面修復過程中僅僅起到臨時性的生物材料覆蓋作用，目前更多地應用于治療糖尿病足等慢性潰瘍創(chuàng)面的治療。

1995年Wainwright[6]首先將異體去細胞真皮應用于臨床，但異體去細胞真皮存在價格較昂貴、異體皮來源有限、存在傳播疾病的風險等缺點。本研究應用組織工程學的方法，在體外培養(yǎng)表皮細胞和成纖維細胞的基礎上，將乳大鼠成纖維細胞與膠原凝膠混懸，與PADM構建活性復合真皮基質，進而與乳大鼠表皮細胞構建組織工程皮膚。從結構角度來說，復合真皮基質克服了細胞與單純PADM黏附性較差的問題，復合真皮基質中的PADM克服了單純膠原凝膠容易出現(xiàn)收縮的不足。從功能角度來說，膠原凝膠除了為細胞生長提供空間結構以外，對于細胞的生長、分化和遷移也起到重要的調(diào)控作用。成纖維細胞分泌的多種生長因子和細胞外基質，可促進表皮細胞的增殖、移動及成熟。

本研究將活性復合真皮基質組織工程皮膚應用到大鼠的深度燒傷創(chuàng)面，經(jīng)過術后動態(tài)觀察，未見對移植物的急性排斥反應，組織工程皮膚移植成活率高，與單純表皮細胞膜片移植比較無顯著差異，同時克服了單純表皮細胞膜片移植后創(chuàng)面收縮嚴重、愈合后皮膚質量差等方面的不足，提示其是修復深度創(chuàng)面的一種實用方法。另外，抗Laminin染色的結果表明，創(chuàng)面移植6周后組織工程皮膚組移植物有連續(xù)、完整的基底膜結構，提示活性復合真皮基質可能有利于基底膜的重建。

在創(chuàng)面愈合過程中，新生血管是創(chuàng)面修復的重要環(huán)節(jié)。移植物創(chuàng)面修復的再血管化機制相當復雜，涉及細胞、基質和生長因子等綜合的調(diào)控作用[7]。微血管的數(shù)量關系到組織修復的血供，如果創(chuàng)面有相對足夠的新生血管形成，創(chuàng)面組織修復能獲得充足的營養(yǎng)物質，使創(chuàng)面愈合速度加快[8]。本研究利用CD34單克隆抗體標記創(chuàng)面組織的毛細血管內(nèi)皮細胞。CD34作為特異性的微血管標記物，其標記顯示血管內(nèi)皮細胞的能力要優(yōu)于其他標記物。本研究結果顯示，組織工程皮膚創(chuàng)面移植后4周微血管計數(shù)達到高峰，微血管較豐富，明顯高于單純細胞膜片移植后，表明體外構建的活性真皮基質大鼠組織工程皮膚移植于創(chuàng)面后能迅速建立血液循環(huán)，加快血管化進程，使移植物更容易成活，考慮與本實驗采用的Fb-膠原-PADM活性復合基質模式有利于細胞因子分泌，具有較高的生物學活性，從而引導各種細胞增殖有關。

本課題組在實驗過程中發(fā)現(xiàn)成年大鼠表皮和真皮連接緊密，很難用酶消化法獲取表皮細胞懸液進行體外培養(yǎng)，故本研究采用乳鼠的表皮細胞進行培養(yǎng)得到組織工程皮膚，整個細胞培養(yǎng)過程的可控性強，但培養(yǎng)過程中要避免成纖維細胞的污染。表皮組織中抗原性較強的細胞是Langhans細胞，而表皮細胞本身的抗原性非常弱，經(jīng)過培養(yǎng)傳代后Langhans細胞可被去除。另外，乳鼠的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，經(jīng)過數(shù)次傳代后表皮細胞得以純化，更進一步降低了其抗原性。本研究過程中術后6周內(nèi)未觀察到受體對移植物的排斥反應。

綜上所述，本研究結果表明，以F b-膠原-PADM活性復合真皮基質為載體，與表皮細胞構建的組織工程皮膚，適用于修復Ⅲ度燙傷切痂創(chuàng)面，能改善創(chuàng)面愈合質量。該結果為來源于異體表皮細胞的組織工程皮膚的臨床應用提供了實驗依據(jù)，但有關組織工程復合皮膚的免疫原性、異體表皮細胞遠期轉歸等還需進一步深入研究。

[1]Ma ZF,Chai JK,Yang HM,et al. Experimental study on preparing tissue-engineered skin with substrate of living composite dermal matrix[J]. Chin J Burns,2008,24(4): 272-274.[馬忠鋒,柴家科,楊紅明,等. 以活性復合真皮基質為載體構建組織工程皮膚的研究[J]. 中華燒傷雜志,2008,24(4): 272-274.]

[2]Ma ZF,Chai JK,Yang HM,et al. Establishment of allogenetic epithelial cells and fibroblasts bank[J]. J Hebei Med Univ,2009,30(3): 273-274.[馬忠鋒,柴家科,楊紅明,等. 異體表皮細胞和成纖維細胞庫的建立[J]. 河北醫(yī)科大學學報,2009,30(3): 273-274.]

[3]Ma ZF,Chai JK,Yang HM,et al. Experimental study on preparing PADM without cytotoxicity and microbiological determination and its outcomein vivo[J]. Med J Chin PLA,2009,34(9): 1079-1081.[馬忠鋒,柴家科,楊紅明,等. 無細胞毒性豬去細胞真皮基質制備及轉歸研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志,2009,34(9): 1079-1081.]

[4]Rheinwald JG,Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells[J]. Cell,1975,6(3): 331-343.

[5]O'Connor NE,Muliken JB,Bank-Schlegel S,et al. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells[J]. Lancet,1981,1(8211): 75-78.

[6]Wainwright DJ. Use of an acellular allograft dermal matrix (Alloderm) in the management of full-thickness burns[J]. Burns,1995,21(4): 243-248.

[7]Li L,Lv KY,Wu GS,et al. Advances in research on mechanisms of the effect of negative pressure wound treatment in wound healing[J]. Med J Chin PLA,2014,39(8): 664-668.[李磊,呂開陽,伍國勝,等. 負壓創(chuàng)傷治療促進創(chuàng)面修復的作用機制研究進展[J]. 解放軍醫(yī)學雜志,2014,39(8): 664-668.]

[8]Sun H,Wang X,Hu X,et al. Promotion of angiogenesis by sustained release of rhGM-CSF from heparinized collagen/ chitosan scaffolds[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2012,100(3): 788-798.

In vitroconstruction of tissue engineered skin for wound repair after escharectomy of third degree scald: An experimental study

MA Zhong-feng1,CHAI Jia-ke2*,YANG Hong-ming2,XU Ming-huo21Department of Surgery,First Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao,HeBei 066000,China
2Department of Burn and Plastic,Burn Institute of PLA,First Affiliated Hospital of General Hospital of PLA,Beijing 100036,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: cjk304@126.com

,E-mail: cjk304@126.com

ObjectiveTo observe the practicability and effect of tissue engineered skin for repairing the wound after escharectomy of third degree scald (TDSE) in rat model.MethodsEpithelial cells and fibroblasts from newborn SD rats were isolated by enzyme digestion method and culturedin vitro,and porcine acellular dermal matrix (PADM) without cytotoxicity was prepared by hyperosmotic saline/sodium hydroxide method. The fibroblasts were mixed with bovine type Ⅰ collagen and inoculated on the surface of PADM. Third passage of cultured epidermal cells from newborn SD rats were inoculated on the collagen surface of the dermal matrix to obtain tissue engineered skin,and it was used to prepare epidermal cell sheet. Forty-eight SD rats with TDSE wound were randomly divided into two groups,then tissue engineered skin (experiment group),and epidermal cell sheet (control group) graftings were performed to cover the wounds respectively. Finally,gross observation and histological changes were observed in grafted area. The wound healing rate and wound contraction rate were compared between the two groups. Microvessel count (MVC) was performed with anti-CD34 monoclonal antibody immunohistochemical staining technique,and vascular endothelial cells were labeled. Basal membrane of the skin was identified by immunohistochemical anti-Laminin staining technique.ResultsThere was no obvious sign of acute rejection of the graft in both groups. The graft survival rate was 75.05%±3.69%,83.12%±3.13% and 92.03%±3.87% at the 2th,4th and 6th week respectively in the experimental group. The graft survival rate was 77.63%±3.23%,83.17%±3.92% and 91.09%±3.35% at the 2th,4th and 6th week in the control group. There was no significant difference between the two groups (P>0.05),but the contraction rate of the grafts was 9.13%±2.27%,18.52%±3.40%,23.92%±3.01% at the 2th,4th,6th week,respectively,in the experimental group,and 14.21%±3.05%,29.12%±3.02% and 39.78%±3.42% at the 2th,4th and 6th week in the control group. It was significantly lower than that of the control group (P<0.05). At the 6th post-grafting,the basement membrane was clear and continuous in the experimental group. In contrast,the basement membrane was blurred and discontinuous in the control group. The microvessel count was 37.5±3.9 and 46.9±3.5 per high-power visual field at the 4th and 6th week in the experimental group,and 23.0±2.0 and 27.5±2.7 per high-power visual field at the 4th and 6th week in the control group,and the count was significantly higher in the experimental group than the control group (P<0.05).ConclusionTissue engineered skin prepared by the dermal matrix containing fibroblasts-collagen-PADM combined with epidermal cells is suitable for repairing TDSE wound,and it improves wound healing quality.

tissue engineering; skin,artificial; burns; wound healing

R644

A

0577-7402(2015)12-0972-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.07

2015-05-11；

2015-11-03)

(責任編輯：胡全兵)

馬忠鋒，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師。主要從事創(chuàng)面修復材料的研制與應用

066000 河北秦皇島 秦皇島市第一醫(yī)院外科(馬忠鋒)；100036 北京 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科、全軍燒傷研究所(柴家科、楊紅明、許明火)

柴家科，E-mail：cjk304@126.com