呂剛，張慶軍，史玉琪，曹志宇

化療聯合CIK細胞和樹突細胞治療對晚期胃癌的療效觀察

呂剛，張慶軍，史玉琪，曹志宇

目的 評估化療與細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)和樹突細胞(DC)聯合治療晚期胃癌的臨床療效。方法 選擇解放軍309醫(yī)院普外科2011年1月－2013年1月收治的無法手術的Ⅳ期胃癌患者72例，隨機分為兩組。單純化療組(n=35)采用FOLFOX4方案，共進行6～10個療程。CIK細胞和DC細胞治療聯合化療組(聯合治療組，n=37)除采用FOLFOX4化療方案外，同時誘導培養(yǎng)患者自身CIK和DC細胞，CIK細胞經靜脈回輸，DC細胞在患者腹股溝、腋下淋巴結附近皮下注射。觀察兩組患者治療前后瘤體大小、細胞免疫指標(外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+、CD3–CD56+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值)、Karnofsky評分變化，并記錄兩組患者的2年生存率。結果 72例患者均獲隨訪，隨訪時間9～30個月，平均22個月。單純化療組患者中無完全緩解(CR)病例，部分緩解(PR)5例，穩(wěn)定(SD)14例，疾病控制率(DCR)為54.3%(19/35)，聯合治療組中CR 1例，PR 9例，SD 16例，DCR為70.3%(26/37)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。聯合治療組治療后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+、CD3–CD56+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯高于治療前，而CD8+T細胞百分比明顯低于治療前，差異均有統計學意義(P<0.05)。單純化療組Karnofsky評分提高–8～13(–5±10)分，聯合治療組提高–6～15(–3±12)分，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。單純化療組2年生存率(57.1%，20/35)與聯合治療組(64.9%，24/37)比較差異亦無統計學意義(P>0.05)。結論 CIK細胞和DC細胞聯合化療可有效提高晚期胃癌的療效，增強患者自身免疫功能，是無手術指征的晚期胃癌患者安全、有效的治療方法。

胃腫瘤；細胞因子誘導殺傷細胞；樹突細胞；抗腫瘤聯合化療方案

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，全國平均年死亡率為25.16/10萬[1]。晚期胃癌由于腫瘤廣泛侵犯或遠處轉移，失去了根治性切除的機會，常采取以化療為主的治療方案，患者生活質量及預后較差，遠期生存率低。近年來研究表明，體內回輸免疫活性細胞可作為傳統放化療之外的一種重要的腫瘤輔助治療方法[2]。細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)能調節(jié)和增強機體的免疫功能，直接殺傷腫瘤細胞并可在體外大量擴增[3]，而樹突細胞(DC)可分泌多種免疫因子，誘導分化T細胞，增強NK細胞殺傷活性，發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。為了進一步提高晚期胃癌的療效，改善患者的生存質量，延長生存期，解放軍309醫(yī)院應用CIK細胞和DC細胞聯合化療治療晚期胃癌，取得了滿意療效，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇解放軍309醫(yī)院普外科2011 年1月－2013年1月經臨床、影像學及病理確診，并根據國際抗癌聯盟(UICC)分期標準診斷為Ⅳ期胃癌的患者72例，隨機分為單純化療組和CIK+DC細胞治療+化療組(聯合治療組)兩組。其中單純化療組35例，男21例，女14例，年齡29～76歲，平均53歲。聯合治療組37例，男22例，女15例，年齡27～74歲，平均54歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經解放軍309醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 CIK及DC的制備

1.2.1 CIK細胞的誘導及制備 抽取患者外周血50～100ml，肝素抗凝，用Ficoll分離并收集單個核細胞；用RPMI 1640洗滌3次，將細胞按2×106/ml懸浮于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，加入IFN-γ (1000U/ml)、IL-2(500U/ml)，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h；1d后加入抗CD3多克隆抗體(100μg/ L)、IL-1(100U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)；每3d更換培養(yǎng)基(不含IFN-γ)并調整細胞濃度為2×106/ml[6]。在第7、14、28天時取培養(yǎng)細胞行CD3+、CD56+流式細胞儀檢測，于CD3+、CD56+陽性率最高時收集細胞，微生物檢查陰性后，用生理鹽水洗3次，加入5×104U rhIL-2后回輸。

1.2.2 DC的制備 抽取患者外周血100ml，先分離出血漿備用，再吸出白細胞層的細胞，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞。單個核細胞洗滌后按常規(guī)方法培養(yǎng)DC，于培養(yǎng)第7天的DC中加入INF-γ (2×106U/L)、LPS(3μg/L)，第10天時即為成熟的DC。收集DC，洗滌后重懸于2ml自身血漿中，供患者淺表淋巴結或皮下注射。

1.3 治療方案 單純化療組采取FOLFOX4方案，具體為：奧沙利鉑85mg/m2，第1天；亞葉酸鈣200mg/(m2.d)，第1～2天；氟尿嘧啶400mg/(m2.d)，靜脈注射，然后再用600mg/(m2.d)，22h持續(xù)靜滴，第1～2天；14d后重復治療，共進行6～10個療程。聯合治療組除采用相同的化療方案外，于化療前及化療第6個療程后各行CIK、DC細胞治療一個療程。CIK細胞治療每次輸注細胞數為1×109個，隔天輸注1次，5次為一個療程，每個療程輸注CIK細胞5×109個。DC行腹股溝、腋下淋巴結附近皮下注射，每個療程3次，每個療程輸注的成熟DC總數為(3～7)×109個。

1.4 觀測指標及療效判定 觀測指標包括瘤體大小、細胞免疫指標(外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+、CD3CD56+T細胞百分比及CD4+/ CD8+比值，采用流式細胞儀分析)、生存質量Karnofsky評分[7]、生存率等。采用螺旋CT雙重對比增強造影測量治療前后病灶大小，參照Recist標準評估治療效果。完全緩解(complete response，CR)：病變完全消失，持續(xù)4周以上；部分緩解(partial response，PR)：病灶縮小≥30.0%，持續(xù)4周以上；疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)：病灶縮小<30%或增大<20%；疾病進展(progressive disease，PD)：病灶增加20.0%以上。CR+PR為化療有效率(response rate，RR)，CR+PR+SD為疾病控制率(disease control rate，DCR)。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料的率表示，兩組間比較采用χ2檢驗；兩組Karnofsky評分的比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 療效評估 單純化療組35例患者中無CR病例，PR 5例，SD 14例，PD 16例，DCR為54.3%(19/35)。聯合治療組的37例患者中，CR 1例，PR 9例，SD 16例，PD 11例，DCR為70.3%(26/37)。兩組療效比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 細胞免疫指標改變 與化療前比較，單純化療組化療后CD8+T細胞百分比明顯降低，而其余細胞免疫指標變化不明顯。與治療前比較，聯合治療組治療后CD3+、CD4+、CD3+CD56+、CD3–CD56+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯升高，CD8+T細胞百分比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，表1)，提示聯合治療可顯著改善晚期胃癌患者的免疫功能。

表1 單純治療組與聯合治療組治療前后免疫指標變化(±s)Tab. 1 Changes of immune indicators before and after treatment in simple and combination treatment group (±s)

表1 單純治療組與聯合治療組治療前后免疫指標變化(±s)Tab. 1 Changes of immune indicators before and after treatment in simple and combination treatment group (±s)

(1)P<0.05 compared with before treatment

2.3 生活質量及生存率比較 采用Karnofsky評分評估兩組患者生活質量的改變，結果顯示，單純化療組化療后Karnofsky評分提高–8～13(–5±10)分，其中提高5例，穩(wěn)定16例，下降14例，聯合治療組治療后Karnofsky評分提高–6～15(–3±12)分，其中提高9例，穩(wěn)定17例，下降11例。聯合治療組患者的生活質量改善稍高于單純化療組，但組間差異無統計學意義(P>0.05)。單純化療組2年生存率為57.1%(20/35)，與聯合治療組(64.9%，24/37)比較差異亦無統計學意義(P>0.05)。

2.4 CIK及DC治療的不良反應 聯合治療組在CIK 及DC治療期間，1例出現寒戰(zhàn)，4例出現中低熱(體溫不超過39℃)，1例出現輕度頭痛，2例有惡心、嘔吐，均經對癥治療后緩解，無休克、死亡等嚴重不良反應。

3 討 論

免疫系統異?；蚴д{可導致機體免疫功能紊亂，特別是惡性腫瘤發(fā)生，因此惡性腫瘤的生物免疫治療成為近年來腫瘤治療的研究熱點。目前已有報道CIK、DC可用于進展期胃癌的臨床治療[8]，但其療效尚缺乏大樣本量病例研究驗證，免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤作用的機制也尚未明確。國內張燕等[9]報道42例中晚期胃癌患者應用化療聯合CIK細胞治療，其總體有效率明顯高于單純化療，3年生存率和生活質量亦有所提高。鞏新建等[10]報道52例進展期胃癌術后患者應用細胞免疫治療聯合化療，3年及5年生存率明顯高于術后單純化療組，并可明顯改善生活質量。本研究選取的病例均為臨床診斷為Ⅳ期的晚期胃癌患者，已喪失手術切除的機會，除按常規(guī)化療外，聯合治療組還給予CIK及DC細胞治療，結果顯示，與單純化療組比較，給予細胞免疫治療的患者減瘤效果明顯。進一步檢測患者外周血免疫指標，聯合CIK、DC細胞治療的患者CD3+、CD4+、CD3+CD56+、CD3–CD56+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯高于治療前，提示細胞免疫治療顯著改善了腫瘤患者的免疫功能。

既往研究發(fā)現，惡性腫瘤患者機體內常存在免疫系統異?；蚴д{，導致機體免疫功能紊亂。淋巴細胞介導的細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中具有重要作用，T細胞亞群分布可以反映機體的抗腫瘤免疫功能狀況。成熟的T淋巴細胞分為CD4+T細胞和CD8+T細胞兩個亞群。CD4+T細胞主要為輔助性T細胞(helper T cells，Th)，在再次免疫應答中發(fā)揮重要作用，能促進B細胞增殖、分化及產生抗體，同時能促進CD8+T細胞活化，產生殺傷性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)。CD8+T細胞包括殺傷性T細胞和抑制性T細胞，而腫瘤患者外周血的CD8+T細胞主要是抑制性T細胞(suppressor T cell，Ts)。因此，CD4+/CD8+比值可直接反映機體的細胞免疫功能狀態(tài)。本研究中，單純化療組和聯合治療組治療前外周血中CD4+/CD8+比值均為0.9左右，處于正常值低限(正常值為0.9～3.6)，提示患者免疫功能低下，不能有效監(jiān)控、殺滅腫瘤。經CIK、DC細胞免疫治療后的患者，CD3+CD56+效應細胞百分比增加，CD4+/CD8+比值明顯升高，說明患者免疫功能得到了有效改善。

CIK是將分離的人外周血單核細胞在體外經多種細胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-1、抗CD3多克隆抗體等)共同誘導培養(yǎng)后獲得的一群異質細胞[11]，是一類非主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)和非T細胞受體(T cell receptor，TCR)限制性的免疫活性細胞[12-13]，其效應細胞主要為CD3+CD56+T細胞。Verneris等[14]研究發(fā)現，CIK對表達FasL的惡性腫瘤細胞仍有殺傷作用。DC是正常人體內存在的一類具有強大的抗原提呈功能的特殊細胞。抗原致敏的人DC可將抗原信息提呈給特異性T細胞并使之活化，從而誘導機體產生大量具有特異性細胞毒性的T淋巴細胞，對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用。CIK、DC細胞聯合治療抗腫瘤的機制可能包括以下幾個方面[15]：①攜帶腫瘤抗原的DC將抗原信息提呈給特異性T細胞并使之活化，產生大量具有特異性細胞毒性的T淋巴細胞，殺滅腫瘤細胞；②成熟的DC在體內起免疫調節(jié)作用，如通過誘導初始T細胞分化和細胞接觸機制，增強NK細胞的殺傷活性；③CIK效應細胞的表型標志主要是CD3+CD56+，具有NK細胞的活性，可通過MHC非限制機制直接殺傷體內腫瘤細胞[16]；④CIK中少部分CD3+CD8+T細胞可能為腫瘤特異性的殺傷性T細胞，能直接殺滅腫瘤。

本研究結果表明，化療聯合CIK、DC細胞免疫治療晚期胃癌安全、有效，細胞免疫治療可改善患者的免疫功能，增強機體自身抗腫瘤免疫效應，同時本研究聯合治療組患者2年生存率和生活質量改善均稍高于單純化療組，但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，可能是由于病例數較少，有待今后擴大樣本量進一步研究。

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Clinical observation of chemotherapy combined with autologous cytokine-induced killer cells and dendritic cells for advanced gastric cancer

LV Gang, ZHANG Qing-jun, SHI Yu-qi, CAO Zhi-yu*
Department of General Surgery, 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China
*

, E-mail: caozhiyu71@sina.com
This work was supported by the Wu Jieping Medical Foundation (320.6750.10001)

ObjectiveTo evaluate the clinical effects of chemotherapy combined with cytokine-induced killer (CIK) cells and dendritic cells (DC) on advanced gastric cancer.MethodsSeventy-two cases with advanced gastric cancer (stage Ⅳ) treated in 309 Hospital of PLA from Jan. 2011 to Jan. 2013 were randomly divided into chemotherapy group and combined therapeutic group. Chemotherapy group consisted of 35 cases,

6 to 10 cycles of chemotherapy with the protocol of FOLFOX 4. Combined therapeutic group consisted of 37 cases, beside receiving the same chemotherapeutical protocol, they were given autologous CIK cells combined with subcutaneous injection of DC near inguinal and axillary lymph nodes. The changes in tumor burden, cellular immune responses (CD3+, CD4+, CD8+, CD3+CD56+, CD3–CD56+and CD4+/CD8+) and the Karnofsky's grade were determined, and the 2-year survival rate of both groups was recorded.ResultsAll patients were followed up for 9～30 months (average 22 months). The disease control rate (DCR) was significantly higher in combined therapeutic group (70.3%, 26/37) than in chemotherapy group (54.3%, 19/35, P<0.05). The proportions of CD3+, CD4+, CD3+CD56+and CD3–CD56+and the ratio of CD4+/CD8+increased significantly after the treatment in the combined therapeutic group, while the proportion of CD8+was lowered (P<0.05). The Karnofsky's grade increased by –8-13(–5±10) in the chemotherapy group, and by –6-15(–3±12) in the combined therapeutic group, but no significant difference was found between the two groups (P>0.05). The 2-year survival rates in the chemotherapy group and the combined therapeutic group were 57.1% and 64.9%, respectively, with no significant difference between two groups (P>0.05).ConclusionChemotherapy combined with autologous CIK cells transfusion and DC injection mayimprove the treatment result in patients with advanced gastric cancer, by enhancing the autoimmune function, thus it improves the life quality, and it is found to be safe in treatment of patients suffering from advanced gastric cancer.

stomach neoplasms; cytokine-induced killer cells; dendritic cells; antineoplastic combined chemotherapy protocols

R735.3

A

0577-7402(2015)06-0475-04

2014-12-08；

2015-04-17)

(責任編輯：胡全兵)

吳階平醫(yī)學基金(320.6750.10001)

呂剛，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師。主要從事胃腸惡性腫瘤的綜合治療工作

100091 北京 解放軍309醫(yī)院普通外科(呂剛、張慶軍、史玉琪、曹志宇)

曹志宇，E-mail：caozhiyu71@sina.com

[中圖分類號]10.11855/j.issn.0577-7402.2015.06.11