張寧坤，陳宇，王志國，李俊風(fēng)，王麗華，朱智明，王力，高連如

華通膠源間充質(zhì)干細胞經(jīng)冠狀動脈移植治療慢性缺血性心肌病的實驗研究

張寧坤，陳宇，王志國，李俊風(fēng)，王麗華，朱智明，王力，高連如

目的探討華通膠源間充質(zhì)干細胞(WJMSCs)經(jīng)冠狀動脈移植治療豬慢性缺血性心肌病(CIMP)的安全性和有效性。方法巴馬小型豬29頭，其中25頭行左冠狀動脈前降支球囊閉塞制作心肌梗死后CIMP模型，以超聲心動圖檢查左室射血分數(shù)(LVEF)≤45%為CIMP成功標準，其余4頭為假手術(shù)(Sham)組。造模成功17頭，3頭未成功，5頭死亡，研究初始6頭CIMP模型豬(3頭成功造模+3頭造模未成功)先行WJMSCs經(jīng)冠狀動脈移植劑量選擇安全性實驗，依次以6×106、1×107、2×107劑量經(jīng)冠狀動脈移植，每劑量組小型豬2頭，造模成功與未成功者各1頭，以TIMI 3級為安全劑量。余14頭CIMP模型豬被隨機分為WJMSCs移植組和對照組(n=7)，分別經(jīng)冠狀動脈移植WJMSCs(2×107)，或注入生理鹽水。在WJMSCs移植8周后，對兩組模型豬進行超聲心動圖、病理組織學(xué)、免疫熒光學(xué)檢測。結(jié)果CIMP小型豬在WJMSCs移植8周后，LVEF較移植前增高11.6%(P<0.01)，左室收縮末容積減少4.1ml(P<0.05)，而對照組心室功能進一步惡化(LVEF從42.8%下降為35.9%，P<0.01)，左室進一步擴張(左室舒張末容積從42.8±1.2ml進展為46.7±1.3ml，P<0.05)。病理組織學(xué)檢查顯示W(wǎng)JMSCs移植組梗死區(qū)心室壁厚度明顯增厚，梗死邊緣區(qū)血管密度明顯增加。免疫熒光檢測可見帶有Myc標志的WJMSCs在梗死心肌內(nèi)存活，且與心肌肌鈣蛋白T、α-actin和Connexin-43共表達。結(jié)論經(jīng)冠狀動脈移植WJMSCs治療豬慢性CIMP是安全、有效的。

華通氏膠；間質(zhì)干細胞移植；冠狀血管；心肌缺血

目前，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)通過直接介入手術(shù)及藥物溶栓等早期血運重建后，死亡率明顯下降，但由于早期血管重建只能挽救頓抑冬眠心肌，而已經(jīng)壞死的心肌必將被纖維結(jié)締組織替代形成瘢痕，經(jīng)歷心室壁變薄、心室腔擴大的心室重構(gòu)過程，部分患者將發(fā)展為慢性缺血性心肌病(chronic ischemia myocardiopathy，CIMP)，以致目前缺血性心力衰竭的發(fā)病率及死亡率逐年升高[1]，然而，迄今為止除心臟移植外，還無有效方法根本改變其預(yù)后[2]。

近年來隨著細胞生物學(xué)的飛速進展，具有多向分化及自我更新能力的干細胞移植修復(fù)心肌的理念正在實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[3-5]。臨床前研究已經(jīng)證實，不同來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植到小鼠、大鼠及小型豬梗死心肌可以分化為心肌樣細胞、內(nèi)皮細胞，并與內(nèi)源心肌細胞整合，明顯縮小心肌梗死范圍[6-9]。臨床證據(jù)也表明，AMI患者經(jīng)冠狀動脈移植MSCs或自體骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BMMCs)可縮小心肌梗死范圍，提高左室射血分數(shù)(LVEF)，有效地預(yù)防心室重構(gòu)[10-14]。然而遺憾的是，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，老年人尤其是冠心病老年患者BMMSCs數(shù)量少，增殖能力低，使臨床應(yīng)用受到了很大限制[15-16]。顯然，這給CIMP再生醫(yī)學(xué)治療帶來了瓶頸式的障礙。

本課題組從新生兒臍帶內(nèi)一種特殊黏液狀組織——華通膠(Wharton's jelly)中提取分離培養(yǎng)了一種遠較成體BMMCs更原始的華通膠源間充質(zhì)干細胞(Wharton's jelly derived mesenchymal stem cell，WJMSCs)[17]。WJMSCs具有獨特的類似胚胎干細胞的原始干細胞生物學(xué)特性，增殖能力遠遠高于BMMSCs，且分泌細胞因子、生長因子的量遠高于BMSCs[18-21]。本課題組對WJMSCs進行全基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，WJMSCs不僅表達多種胚胎干細胞標志基因，如OCT4、SSEA3、SSEA4、Nkx2.5、KLF4、FLK1、SOX2、NANOG、MYC、TERT、REX1、CRIPTO、DAPPA4、TRA-1-8、Isl-1，還可以高表達心肌前體細胞特異轉(zhuǎn)錄因子Isl-1、Nkx2.5、Flk1[17]。體外研究發(fā)現(xiàn)，在5-氮胞苷誘導(dǎo)下WJMSCs可分化為心肌樣細胞[17]。本課題組的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果顯示，異體WJMSCs治療慢性缺血性心力衰竭是安全的，無觸發(fā)免疫反應(yīng)[22]。然而，WJMSCs對慢性CIMP是否有治療效果至今尚不清楚。因此本研究擬在小型豬心肌梗死后誘發(fā)的心力衰竭模型上，經(jīng)冠狀動脈移植WJMSCs，觀察其對心肌修復(fù)、心功能改善的作用，并篩選WJMSCs的有效及安全劑量。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及實驗動物 彩色超聲儀(便攜式，美國Sonosite)，大型X線機(FD20，荷蘭PHILIPS)，動脈鞘管、PTCA球囊導(dǎo)絲(美國Cordis)，培養(yǎng)箱(371型，美國Thermo)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD，中國蘇州凈化)，倒置顯微鏡(CKX-41，日本Olympus)，電子天平(A1-204，瑞士梅特勒)，流式細胞儀(EPICS XL/XL-MCL，美國Beckman Coulter)，共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS SP5，德國Leica Microsystems)。清潔級巴馬小型豬購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，雌雄不限，體重25.7±2.3kg，月齡5.0±0.5個月，清潔環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 小型豬心肌梗死后CIMP模型的建立 參照本課題組既往的方法[23]。巴馬小型豬29頭，其中25頭制作CIMP模型，其余4頭為假手術(shù)(Sham)組。經(jīng)肌內(nèi)注射氯胺酮(5mg/kg)和速眠新(0.08ml/kg)誘導(dǎo)麻醉，將動物平臥于設(shè)有大型X線機的手術(shù)臺上，右腹股溝部備皮，碘伏消毒，鋪無菌巾，右腹股溝韌帶下1cm穿刺股動脈，常規(guī)消毒鋪巾，經(jīng)右側(cè)股動脈穿刺置入6F動脈鞘管，經(jīng)股動脈彈丸式注入肝素鈉2500U，然后每隔1h追加肝素鈉1250U。采用冠脈指引導(dǎo)管行冠脈造影，造影后置入經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)球囊導(dǎo)絲，在導(dǎo)絲指引下置入2.5mm×20.0mm Mewerik球囊至前降支前中段交界處，以2～4atm(1atm=1.01×105Pa)充盈球囊，經(jīng)缺血預(yù)適應(yīng)3～4次，每次球囊充盈20s，間隔3～5min。以6～8atm充盈球囊堵塞冠脈，造影示球囊遠端血流中斷，球囊保持充盈90min，此間持續(xù)監(jiān)測壓力及電活動。術(shù)中根據(jù)肢體運動情況每隔1h左右重復(fù)肌內(nèi)注射氯胺酮2ml+速眠新0.5ml，使豬保持麻醉狀態(tài)，注意豬的呼吸情況，術(shù)后持續(xù)心電監(jiān)測。術(shù)中發(fā)生室顫即予以電除顫，根據(jù)心律失常性質(zhì)，酌情予阿托品或利多卡因等藥物應(yīng)用。術(shù)中至術(shù)后24h共死亡5頭，其中術(shù)中2頭豬因梗死范圍大，發(fā)生泵衰竭死亡，1頭死于頑固室顫；術(shù)后24h內(nèi)死亡2頭，疑死于室顫或心力衰竭。術(shù)后每天肌內(nèi)注射青霉素160萬U，連續(xù)3d。4頭Sham組未進行球囊充盈，均存活。

術(shù)后10～12d行二維超聲心動圖檢查，確定LVEF≤45%，左室腔舒張末直徑(LVEDD)≥40mm 為CIMP模型建立成功。3頭動物L(fēng)VEF未達此標準，故除外，共17頭成功。另4頭小型豬設(shè)為假手術(shù)組即Sham組。

1.3 WJMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定 參照本課題組既往的方法[17]。孕檢指標正常的產(chǎn)婦，剖腹產(chǎn)后無菌取出臍帶，移至無菌培養(yǎng)皿中，用生理鹽水沖洗去除血漬，將臍帶剪成4cm長臍帶段，加入生理鹽水洗滌血凝塊，直至基本去除血漬。剝離靜脈，剔除臍帶的兩條動脈。分離位于羊膜與血管之間的白色結(jié)締組織華通膠，使用眼科剪將華通膠剪成1mm3以下塊狀，移入75cm2培養(yǎng)瓶中，預(yù)先在培養(yǎng)瓶中加入8ml完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶蓋旋松，保證通氣，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細胞組織塊貼壁培養(yǎng)10～14d，WJMSCs從組織塊中爬出，并快速分裂生長，當(dāng)細胞達到80%融合時，棄培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌2次，加入0.125%胰蛋白酶消化1.5min，WJMSCs收縮脫離瓶壁，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，使用移液管輕輕吹打，將WJMSCs懸液移入50ml離心管，再加入PBS洗滌2次，沖洗的細胞懸液均移入50ml離心管，100×g離心10min，棄上清；重新加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，按照0.8×106/75cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。WJMSCs培養(yǎng)2～4d后，細胞融合90%左右時開始傳代培養(yǎng)。取第3代生長良好的WJMSCs，轉(zhuǎn)染c-myc基因作為移植細胞標志。所用細胞外觀、細胞濃度、存活率、細胞形態(tài)、MSCs純度指標、生物學(xué)效力、特殊病毒檢測、無菌實驗檢測、細菌內(nèi)毒素檢測等各項指標達國際細胞學(xué)會臨床應(yīng)用標準。

1.4 WJMSCs經(jīng)冠狀動脈移植術(shù)、劑量梯度研究及實驗分組 動物麻醉同上，胸部及雙側(cè)腹股溝部備皮，術(shù)中根據(jù)肢體運動情況每隔1h左右重復(fù)肌內(nèi)注射氯胺酮2ml+速眠新0.5ml，使豬保持麻醉狀態(tài)，并注意豬的呼吸情況，同時進行心電監(jiān)護，及時處理各種心律失常。6頭小型豬(包括3頭CIMP模型未成功及3頭CIMP模型小型豬)常規(guī)穿刺右側(cè)股動脈，進行冠狀動脈造影、PTCA，在穿刺導(dǎo)絲球囊閉塞前降支條件下拔出導(dǎo)絲，經(jīng)穿導(dǎo)絲球囊導(dǎo)管注入WJMSCs，劑量梯度為6×106、1×107、2×107，每一劑量分4次注入，每次容量1ml，氣囊保持充盈1min，后恢復(fù)灌注2min，重復(fù)冠狀動脈造影觀察前向血流，對照均以生理鹽水注入。經(jīng)以上劑量梯度觀察，各劑量組均無前向血流影響后，本研究決定采用最大劑量2×107個WJMSCs作為冠脈內(nèi)注入劑量。余14頭CIMP模型小型豬隨機分為2組：WJMSCs移植組(CIMP+WJMSCs，n=7)及對照組(CIMP+saline，n=7)。采用本課題組既往研究的方法[16]，經(jīng)穿導(dǎo)絲球囊導(dǎo)管重復(fù)4次注入WJMSCs。對照組動物經(jīng)導(dǎo)管注入同等容量生理鹽水，步驟同WJMSCs移植組。手術(shù)完畢，拔除動脈鞘管，局部壓迫止血，動物放回舍內(nèi)，術(shù)后每天肌內(nèi)注射青霉素160萬U，持續(xù)3d，飼養(yǎng)2個月。

1.5 超聲心動圖檢查 Sham組、WJMSCs移植組、對照組均手術(shù)前及術(shù)后2個月行超聲心動圖檢查。探頭頻率為3.5MHz，可同步進行M型、2D動態(tài)顯示，掃描速度為100mm/s。測量LVEDD、左室舒張末容積(LVEDV)、左室收縮末直徑(LVESD)、左室收縮末容積(LVESV)、左室短軸縮短百分率(LVSF)、LVEF及梗死部位厚度(MIT)。

1.6 病理組織學(xué)檢查 所有動物經(jīng)超聲心動圖檢查后，肌內(nèi)注射氯胺酮(5mg/kg)和速眠新(0.08ml/kg)，使豬處于麻醉狀態(tài)，切開頸動脈抽血處死，取心臟左室，按WJMSCs移植組、對照組、Sham組及檢測目的，分別置于10%甲醛固定，或立即置入液氮中保存，病理檢查標本行常規(guī)行石蠟切片，HE染色，光鏡檢查。

1.7 免疫熒光染色 參照本課題既往的研究方法[24]，WJMSCs移植組、對照組取左室以梗死部為核心、連續(xù)10μm厚度冰凍切片，分別應(yīng)用心肌細胞特異標志TnT、α-actin、connexin-43單克隆抗體(1:200，Beijing Boisynthesis Biotechnology Co.，LTD)及WJMSCs標志Myc單克隆抗體(1:200，北京傲銳公司)染色，然后與熒光標記二抗(1:100，Beijing Boisynthesis Biotechnology Co.，LTD)染色。應(yīng)用Leica Microsystems共聚焦顯微鏡攝取圖像，獲取圖像后應(yīng)用Leica共聚焦圖像數(shù)字處理軟件進行分析。

1.8 免疫功能檢測 兩組動物分別于治療前及治療后2個月處死前，靜脈抽取6ml全血，其中3ml置于生化采血管中，3000r/min離心20min，取上清置于新離心管中，采用ELISA法進行IgG、IgM檢測，另外3ml全血置于EDTA抗凝采血管中，混勻，采用流式細胞儀進行CD3、CD4、CD8檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有資料均以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內(nèi)移植前后比較進行配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 WJMSCs表型鑒定 WJMSCs呈梭形貼壁生長，表達CD44、CD73、CD90、CD105、HLAABC，不表達CD34、CD45及HLA-DR，可向脂肪、骨、軟骨分化，符合國際干細胞學(xué)會MSCs標準(圖1)。

2.2 經(jīng)冠狀動脈WJMSCs移植劑量安全性觀察WJMSCs經(jīng)冠狀動脈注入劑量呈梯度增加(6×106、1×107、2×107)，注入的相關(guān)冠狀動脈前向血流TIMI均在3級，表明WJMSCs經(jīng)冠狀動脈注入最高劑量(2×107)未影響冠狀動脈前向血流，未發(fā)生相關(guān)冠狀動脈導(dǎo)流血管及微血管栓塞征象。2×107個WJMSCs經(jīng)冠狀動脈注入移植是安全的。

圖1 WJMSCs表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of WJMSCsWJMSCs showed a homogeneous spindle-shaped morphology. A. Spindle-shaped WJMSCs adherent growth (×40); B. Spindle-shaped WJMSCs-transfected green fluorescent protein adherent growth (×40); C. Spindle-shaped WJMSCs-transfected green fluorescent protein adherent growth (×100); D. Immunophenotype of WJMSCs detected by flow cytometry. The WJ-MSCs positively expressed CD44, CD73, CD90, CD105, and human leukocyte antigen (HLA)-A, -B and -C, but not for CD34, CD45 and HLA-DR

2.3 WJMSCs移植對CIMP動物生存的影響 本研究在CIMP動物模型建立期，29頭小型豬死亡5頭，死亡發(fā)生率17.2%。治療干預(yù)后，WJMSCs移植組7 頭CIMP小型豬全部存活。對照組7頭CIMP小型豬術(shù)后1個月內(nèi)死亡1頭，2個月內(nèi)死亡1頭，余5頭存活，對照組2個月生存率為71.4%，與WJMSCs移植組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 WJMSCs移植對左心室組織結(jié)構(gòu)的影響 大體觀察見對照組左室前壁塌陷，呈灰白色，全部為纖維瘢痕，而WJMSCs移植組左室前壁增厚，梗死部位室壁厚度較移植前增加，肉眼可見新生的紅色血管。HE染色結(jié)果顯示，WJMSCs移植組在梗死邊緣區(qū)可見新生的心肌細胞(圖2)。

2.5 WJMSCs移植再生心肌效應(yīng) 攜帶Myc基因的WJMSCs經(jīng)冠狀動脈注入后2個月，經(jīng)免疫熒光共聚焦檢測，心肌內(nèi)可見表達Myc標志的WJMSCs生長，并與心肌細胞特異標志TnT、α-actin、Connexin-43共表達，提示其特征性向心肌細胞分化(圖3)。

2.6 WJMSCs移植對心功能的影響 如圖4、表1所示，WJMSCs移植組治療前后對比觀察，左室腔直徑明顯縮小，左室壁運動明顯改善，左室收縮速率明顯增加(P<0.05)，且LVEF明顯增加(P<0.01)，而LVESV、LVEDV均較治療前明顯縮小(P<0.05)。對照組左室腔進一步擴大，收縮功能進一步減低，LVESV、LVEDV進一步增加。兩組間比較顯示，WJMSCs移植組的左室腔大小、收縮功能、LVESV 及LVEDV均明顯優(yōu)于對照組。

2.7 WJMSCs移植對免疫功能的影響 WJMSCs移植組及對照組治療前后對比，IgG、IgM、CD3、CD4、CD8差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。WJMSCs移植組、對照組及Sham組比較，IgG、IgM、CD3、CD4、CD8差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

3 討 論

圖2 WJMSCs移植對左心室組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of WJMSCs transplantation on left ventricular structureA. Wall scar in control group; B. Wall thickening in WJMSCs group; C. Small blood vessels increased after WJMSCs transplantation; D. Fibrous tissue formation in control group; E. WJMSCs transplantation instead of scar; F. New cardiac myocytes

圖3 免疫熒光共聚焦檢測WJMSCs移植后的再生心肌效應(yīng)Fig.3 Effect of WJMSCs transplantation on myocardium regeneration (Immunofluorescence)A. Coexpression of Myc, Connexin-43 and TnT in myocardium after Myc-WJMSCs coronary artery transplantation (×200); B. Coexpression of Myc and α-actin in myocardium after Myc-WJMSCs coronary artery transplantation (×100)

圖4 WJMSCs移植前(A)后(B)的心肌室壁運動Fig.4 Ventricular wall movement before (A) and after (B) WJMSCs transplantation

表1 WJMSCs移植對CIMP動物心功能的影響(±s)Tab.1 Effect of WJMSCs transplantation on cardiac function of CIMP animals (±s)

表1 WJMSCs移植對CIMP動物心功能的影響(±s)Tab.1 Effect of WJMSCs transplantation on cardiac function of CIMP animals (±s)

(1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with before treatment; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with CIMP+saline group

Parameter CIMP+saline group (n=7) CIMP+WJMSCs group (n=7) Sham group (n=4) Before treatment Two months after treatment Before treatment Two months after treatment LVEDD (mm) 42.8±1.2 46.7±1.3(1) 43.2±0.3 42.0±0.1 41.6±1.7 LVESD (mm) 33.7±3.3 38.3±1.3(1) 34.1±0.3 30.0±0.1(1)(3) 27.6±1.2 LVEDV (ml) 84.3±8.3 99.9±4.6(1) 83.4±2.3 80.4±11.3(1)(3) 77.1±7.2 LVESV (ml) 47.3±2.6 63.2±5.1(1) 48.0±4.1 35.8±4.6(1)(3) 28.7±3.6 LVEF (%) 42.8±1.7 35.9±3.2(1) 42.4±3.9 54.0±10.0(2)(4) 62.7±2.3 FS (%) 21.2±6.9 18.2±4.3(1) 20.6±2.3 28.0±6.3(1)(3) 33.6±1.6 MIT (mm) 5.9±0.9 4.8±1.3(1) 6.0±0.4 6.5±0.2(1)(3) 6.7±0.3

表2 WJMSCs移植對CIMP動物免疫功能影響(±s)Tab.2 Effect of WJMSCs transplantation on the immune function of CIMP animals (±s)

表2 WJMSCs移植對CIMP動物免疫功能影響(±s)Tab.2 Effect of WJMSCs transplantation on the immune function of CIMP animals (±s)

Parameter CIMP+saline group (n=7) CIMP+WJMSCs group (n=7) Sham group (n=4) Before treatment Two months after treatment Before treatment Two months after treatment IgG(g/L) 11.3±0.8 10.6±0.9 11.0±0.7 10.7±0.6 10.8±0.4 IgM(g/L) 1.13±0.08 1.14±0.11 1.07±0.12 1.15±0.14 1.08±0.07 CD3(%) 65.8±3.1 64.6±2.2 66.1±3.4 67.2±4.7 66.3±3.9 CD4(%) 39.2±1.3 38.1±1.7 38.9±1.1 37.8±1.6 39.3±1.5 CD8(%) 22.9±0.9 23.4±1.2 22.4±0.8 23.1±1.4 22.7±0.7

本研究在大動物CIMP模型上觀察了WJMSCs經(jīng)冠狀動脈移植對其心肌再生及心功能改善的作用，結(jié)果顯示2×107個WJMSCs經(jīng)冠狀動脈分4次灌注是安全的，無冠狀動脈栓塞征象。在大動物CIMP模型上，應(yīng)用Myc標記的WJMSCs在心肌內(nèi)存活，并分化為表達心肌細胞特異標志TnT、α-actin、connexin-43陽性的心肌樣細胞。與此一致的是，在心臟結(jié)構(gòu)上可見梗死室壁增厚，形成新生小血管。在整體心功能上，WJMSCs移植后2個月，LVEF增加11.6%(54.0±10.0%)，與移植前(42.4±3.9%，P<0.01)及對照組(35.9±3.2，P<0.01)比較均呈顯著差異，而LVESV、LVEDV明顯減低。WJMSCs治療有效地逆轉(zhuǎn)了心肌梗死后CIMP的心功能惡化及心室擴張。

目前，除了心臟移植外，尚無有效的治療方法能從根本上改善CIMP的預(yù)后，而細胞生物學(xué)技術(shù)給CIMP的治療帶來了新的希望。近年來大量基礎(chǔ)研究證據(jù)，以及臨床研究的薈萃分析表明，骨髓單個核細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞治療心肌梗死或慢性缺血性心力衰竭患者，可改善心功能，LVEF平均提高3.66%，顯著改善了存活情況[3,6-9,14]。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)老年人及冠心病患者骨髓干細胞數(shù)量少，增殖能力低[15-16]。雖然晚近研究發(fā)現(xiàn)Lin-c-kit+或Sca-1+自體心肌源干細胞可在體外誘導(dǎo)分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞[25]，但Ⅰ期臨床研究尚無一致性結(jié)綸。Makkar等[26]在17例陳舊性心肌梗死患者中經(jīng)心肌活檢取得心肌組織，經(jīng)膠原酶消化后獲得心肌球(98%表達CD105)，經(jīng)冠狀動脈移植后6個月，LVEF、LVESV、LVEDV與對照組(8例)比較均無顯著差異。Bolli等[27]取患者自體心肌組織，分離純化c-kit陽性心肌干細胞治療CIMP患者9例，4個月后LVEF提高8.2%(P=0.001)。然而，心肌源干細胞來源于自體，需有創(chuàng)性心肌活檢獲取少量心肌組織，而成年殘存的心肌源干細胞數(shù)目很少，僅萬分之一，需要體外較長期擴增，使其臨床應(yīng)用受到限制[26-27]。

因此，本研究從胚外組織——臍帶華通膠中提取間充質(zhì)干細胞作為治療CIMP的種子細胞。本課題組既往研究及其他大量基礎(chǔ)研究證實，WJMSCs較自體成體干細胞更原始，其細胞生物學(xué)特性更接近胚胎干細胞，理論上是良好的種子細胞。然而，WJMSCs是異基因干細胞，雖然本課題組既往研究已證實WJMSCs具有低免疫原性的特征[22]，但此次在體內(nèi)研究中再一次進行了免疫源性觀察，結(jié)果顯示W(wǎng)JMSCs移植后2個月細胞及體液免疫均未受到激活，未產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，血CD3、CD4、CD8及IgG、IgM未見異常變化。

WJMSCs移植后能否在梗死心肌內(nèi)存活是心臟再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵，本研究應(yīng)用Myc標記WJMSCs，經(jīng)免疫熒光抗體檢測，在梗死心肌邊緣可見Myc-WJMSCs陽性細胞生長，并與心肌細胞特異標志TnT、α-actin、Connexin-43共表達，表明WJMSCs在移植術(shù)后2個月仍存活，并可分化為心肌樣細胞。與之一致的是，左室病理組織學(xué)觀察顯示在梗死纖維組織邊緣區(qū)可見新生心肌細胞及小血管，梗死部位室壁較對照組明顯增厚。以上發(fā)現(xiàn)與Lupu等[28]報道的WJMSCs可整合到小鼠心肌中，成功再生心肌組織是一致。也與Zhang等[29]在小型豬MI模型上發(fā)現(xiàn)的WJMSCs可分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞，在梗死心肌內(nèi)再生心肌組織相一致。

本研究雖未深入探討WJMSCs的作用機制，但結(jié)果已再次證實WJMSCs治療確實能顯著改善心功能。其作用機制除上述WJMSCs再生心肌血管的效應(yīng)外，考慮還與WJMSCs表達大量細胞因子、生長因子、生物活性肽有關(guān)[17]。近來較多研究發(fā)現(xiàn)這些生物因子在WJMSCs培養(yǎng)液及整體循環(huán)中均呈高水平表達，提示W(wǎng)JMSCs具有良好的旁/自分泌功能，可產(chǎn)生大量生物因子，動員及激活心臟本身干細胞及前體細胞的分裂增殖，替代壞死心肌，協(xié)同促進心臟功能的恢復(fù)。尤其突出的是，WJMSCs移植不僅可再生冠狀小血管，而且釋放大量血管內(nèi)皮生長因子、肝細胞生長因子、成纖維生長因子等，直接促進冠狀動脈小血管的新生[30-31]。

總之，本臨床前研究證實，在機體心臟慢性缺血及功能衰竭狀態(tài)下，移植WJMSCs修復(fù)心肌及改善心功能是安全和有效的。WJMSCs獨特的優(yōu)點，如遠較自體間充質(zhì)干細胞具有更原始的生物學(xué)特性，良好的再生潛能及旁/自分泌效應(yīng)，特有的免疫調(diào)節(jié)功能，低免疫原性，無創(chuàng)性取材，統(tǒng)一制備標準，產(chǎn)品化備用，選用標準劑量等，可為CIMP治療提供良好的種子細胞，值得進一步進行臨床試驗以證實以上發(fā)現(xiàn)。

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Intracoronary infusion of Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells in the treatment of chronic ischemia cardiomyopathy in porcine model

ZHANG Ning-kun, CHEN Yu, WANG Zhi-guo, LI Jun-feng, WANG Li-hua, ZHU Zhi-ming, WANG Li, GAO Lian-ru*
Department of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: lianru666@163.com

, E-mail: lianru666@163.com
This work was supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2013AA020101) and the National Natural Science Foundation of China (81170094)

ObjectiveTo investigate the safety and efficacy of transplantation of allogeneic Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells (WJMSCs) in a porcine model of chronic ischemia cardiomyopathy.MethodsCardiomyopathy models (CIMP) were reproduced in 25 minipigs out of 29 by left anterior descending coronary artery balloon occlusion, and the 4 remains served as sham group. The left ventricular ejection fraction (LVEF) was detected by echocardiography, and the value ≤45% was defined as successful modeling. Of that 25 minipigs, 5 died, 3 failed of modeling and 17 remains were successfully modelled. The dose safety experiment of WJMSCs transplantation was firstly performed in 3 successful models and 3 failed models. Three doses were tested in turn at 6×106, 1×107and 2×107with 1 successful and 1 failed model for each dose, and TIMI 3 was considered safety dosage. The remainder 14 CIMP models were randomly assigned to transplantation group and control group (7 each), and given 2×107WJMSCs intracoronary infusion or equal amounts of normal saline respectively. Echocardiography, histopathology and immunofluorescence tests were performed 8 weeks after WJMSCs transplantation.ResultsLVEF increased by 11.6% (P<0.01) and the left ventricular end systolic volume decreased by 4.1ml (P<0.05) in CIMP models 8 weeks after WJMSCs transplantation, while in control group the ventricular function further deteriorated (LVEF decreased from 42.8% to 35.9%,P<0.01) and the left ventricular further expanded [left ventricular end diastolic volume (LVEDV) increased from 42.8±1.2ml to 46.7±1.3ml (P<0.05)].Histopathological assessment showed that the ventricular wall in the infarction area was significantly thickening and the vascular density in the border zone was obviously increased in transplantation group. Immunofluorescence test revealed that the injected Myc-WJMSCs survived in the immunocompetent host heart, and colocalized with cardiac troponin T, α-actin and connexin-43.ConclusionIntracoronary infusion of WJMSCs is safe and effective in treatment of ischemia cardiomyopathy in a porcine model.

Wharton jelly; mesenchymal stem cell transplantation; coronary vessels; myocardial ischemia

R542.2

A

0577-7402(2015)11-0885-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.06

2015-08-31；

2015-10-08)

(責(zé)任編輯：張小利)

國家863計劃項目(2013AA020101)，國家自然科學(xué)基金(81170094)

張寧坤，主管技師。主要從事干細胞的基礎(chǔ)與臨床研究

100048 北京 海軍總醫(yī)院心臟中心(張寧坤、陳宇、王志國、李俊風(fēng)、王麗華、朱智明、王力、高連如)

高連如，E-mail：lianru666@163.com