于洋，徐冶，劉師兵，李松巖，曾林川

論 著

大蒜素對D-半乳糖致衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

于洋，徐冶，劉師兵，李松巖，曾林川

目的觀察大蒜素對D-半乳糖致衰老大鼠腦部衰老的影響，并從氧化應(yīng)激通路入手探討其中可能的機(jī)制。方法取50只雄性SD大鼠作為研究對象，隨機(jī)分為5組(n=10)：正常組(C組)、D-半乳糖組(D組)和大蒜素組，其中大蒜素組按劑量分為低劑量組(L組)、中劑量組(M組)和高劑量組(H組)。D、L、M、H組按大鼠體重以125mg/kg的劑量皮下注射D-半乳糖生理鹽水溶液，C組皮下注射同體積生理鹽水對照，每日8:00注射1次。同時，L、M和H組分別腹腔注射10、20和40mg/kg大蒜素注射液，C組和D組以同體積生理鹽水作對照處理，每日20:00注射1次，所有大鼠均持續(xù)注射6周。通過行為學(xué)實驗，觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。處死后取各組大鼠腦組織：檢測丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及總抗氧化力(T-AOC)；另取部分腦組織：固定包埋后石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)法觀察海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，與C組比較，D組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，而大蒜素干預(yù)的各組大鼠記憶能力有所增強(qiáng)。與C組比較，D組大鼠腦組織勻漿中MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性下降(P<0.05)，T-AOC下降(P<0.05)，大蒜素干預(yù)的各組大鼠較D組MDA含量下降(P<0.05)，SOD活性增強(qiáng)(P<0.05)，T-AOC上升(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。免疫組化結(jié)果顯示，與C組比較，D組Bax表達(dá)明顯增加(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)明顯減弱(P<0.05)，大蒜素干預(yù)的L、M、H組大鼠Bax表達(dá)較D組呈減弱趨勢，Bcl-2表達(dá)較D組呈增強(qiáng)趨勢，但結(jié)果并無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論大蒜素可改善D-半乳糖致衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高腦組織勻漿中SOD活性，降低MDA含量，增強(qiáng)腦組織總抗氧化力，并減輕衰老大鼠腦海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。

大蒜素；衰老；腦；氧化應(yīng)激；凋亡

隨著我國人口老齡化形勢日趨嚴(yán)峻，由衰老所致腦功能性記憶減退甚至阿爾茨海默病等疾病發(fā)病率逐年上升[1]。如何對抗腦部功能衰老成為各國科學(xué)家們關(guān)心的課題[2-3]。目前，體內(nèi)高氧化應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致衰老的觀點得到較為廣泛的認(rèn)同[4-5]。當(dāng)生物體處于過氧化狀態(tài)時，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬，進(jìn)而導(dǎo)致系統(tǒng)功能失調(diào)甚至喪失[6-8]。糾正這種過氧化狀態(tài)，有利于保護(hù)衰老機(jī)體器官的結(jié)構(gòu)和功能。大量研究表明，大蒜素具有較好抗菌、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等多種功能[9-12]。但有關(guān)其對衰老大腦作用的研究尚不充分。本實驗以D-半乳糖復(fù)制經(jīng)典大鼠衰老模型，用不同劑量的大蒜素注射液腹腔注射，以行為學(xué)實驗判斷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并檢測各組大鼠腦組織勻漿內(nèi)丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及總抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)，免疫組化法檢測大鼠大腦海馬區(qū)凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)，觀察大蒜素對大鼠腦部衰老的影響并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠50只，體重200～220g，購于吉林大學(xué)實驗動物中心。D-半乳糖(Sigma，美國)，大蒜素注射液(廣東羅浮山國藥股份有限公司)，生理鹽水(吉林省康乃爾藥業(yè)有限公司)，MDA檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒及T-AOC檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。一抗、二抗均購自Santa Cruz公司產(chǎn)品(美國)；二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋)。Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都儀器廠)。大鼠避暗儀及大鼠跳臺測試儀(成都泰盟軟件技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗動物分組與衰老模型建立 雄性SD大鼠50只，按體重隨機(jī)均分為5組(n=10)：即正常組(C 組)和D-半乳糖組(D組)、低劑量大蒜素組(L組)、中劑量大蒜素組(M組)、高劑量大蒜素組(H組)。D、L、M、H組按大鼠體重以125mg/kg的劑量皮下注射D-半乳糖生理鹽水溶液，C組皮下注射同體積生理鹽水作為對照，每日8:00注射1次，持續(xù)6周，各組均以普通飼料喂養(yǎng)，建立衰老模型[13]。注射D-半乳糖的同時，L、M和H組分別以10、20mg/kg 和40mg/kg劑量腹腔注射大蒜素注射液，C組和D組腹腔注射同體積生理鹽水作對照處理，每日20:00注射1次，持續(xù)6周。

1.3 Morris水迷宮實驗 在Morris水迷宮水池裝置中加入適量豆?jié){，使水池呈現(xiàn)不透明的乳白色，控制水溫30±2℃，實驗過程中保持環(huán)境安靜，避免移動迷宮周圍的物品及改變室內(nèi)燈光亮度。將平臺放置于離迷宮正中心15cm的預(yù)定位置，作為大鼠入水后的搜索目標(biāo)。實驗共進(jìn)行7d，前6d為定位航行實驗，考察大鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶功能。主要方法是：在水池邊選取與平臺等距的3個入水點。將大鼠從入水點輕輕放入水中，由自動攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找平臺的時間(即逃避潛伏期)，設(shè)定60s為最長逃避潛伏期[14]，如果60s內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，記錄該次逃避潛伏期為60s，每次測試結(jié)束后，讓大鼠在平臺上停留30s，再次進(jìn)行測試，每只大鼠共測試6d，3次/d，記錄并計算每只大鼠每天3次潛伏期的平均值，主要考察其在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶功能。實驗第7天為空間探索實驗，撤去平臺，選取任一入水點，將大鼠從入水點輕輕地放入水中，記錄大鼠入水后60s內(nèi)的游泳路徑，分析游泳軌跡及經(jīng)過原平臺區(qū)域次數(shù)，主要用于觀察大鼠記憶保持能力[15]。

1.4 避暗反應(yīng)實驗 實驗前先將大鼠放入避暗儀反應(yīng)箱中訓(xùn)練5min，正式測試開始時將大鼠背對洞口放入明室，大鼠進(jìn)入暗室則受到交流電電擊，避暗儀自動記錄5min內(nèi)大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(即錯誤次數(shù))和首次進(jìn)入暗室前在明室的停留時間(即避暗潛伏期)。共測試7d，記錄5min內(nèi)錯誤次數(shù)和避暗潛伏期，將每只大鼠7次結(jié)果的均值進(jìn)行統(tǒng)計分析[16]。

1.5 跳臺實驗 將大鼠放入大鼠跳臺反應(yīng)箱的臺上、臺下適應(yīng)3min后，將其放置在反應(yīng)箱內(nèi)的銅柵上，立即通以交流電，其正常反應(yīng)是跳回平臺(絕緣體)以躲避傷害性刺激。多數(shù)大鼠會再次或多次跳回至銅柵上，受到電擊又迅速跳回平臺上。訓(xùn)練一次后，將大鼠放在反應(yīng)箱內(nèi)的平臺上，記錄3min內(nèi)各鼠跳下平臺的錯誤次數(shù)和第一次跳下平臺前的停留時間(即逃避潛伏期)，以此作為評價其學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)，共測試7d。如果大鼠在3min內(nèi)未跳下平臺，則其潛伏期以180s記，將每只大鼠7次結(jié)果的均值進(jìn)行統(tǒng)計分析[17]。

1.6 大鼠腦組織勻漿相關(guān)氧化指標(biāo)的測定 處死大鼠后迅速剝離其腦組織，取大腦左半球準(zhǔn)確稱重，按重量體積比1:10加入4℃預(yù)冷的生理鹽水制成組織勻漿液，進(jìn)行蛋白標(biāo)定后，嚴(yán)格按照南京建成公司相應(yīng)試劑盒操作步驟測定MDA含量、SOD活性和T-AOC。大腦右半球多聚甲醛固定后石蠟包埋，常規(guī)制備石蠟切片，嚴(yán)格按照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司免疫組化試劑盒步驟檢測大鼠腦海馬區(qū)凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)。對圖像進(jìn)行灰度分析并隨機(jī)取10個視野灰度值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實驗 定位航行實驗結(jié)果顯示，與C組比較，D組大鼠潛伏期明顯延長(P<0.05)，大蒜素各組潛伏期較D組明顯縮短(P<0.05)?？臻g探索實驗發(fā)現(xiàn)，與C組比較，D組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)，而大蒜素各組與D組比較，經(jīng)過平臺次數(shù)增多(P<0.05，表1)。

表1 大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果(±s,n=10)Tab. 1 Results of Morris Water Maze test in rats (±s,n=10)

表1 大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果(±s,n=10)Tab. 1 Results of Morris Water Maze test in rats (±s,n=10)

(1)P<0.05 compared with group C; (2)P<0.05 compared with group D

Group Latent period (s) Times of passing the flat C 37.35±3.61 5.80±1.07 D 53.36±7.87(1) 3.10±0.91(1)L 48.82±9.65(1)(2) 3.76±0.72(1)(2)M 45.57±5.51(1)(2) 3.83±0.86(1)(2)H 44.64±9.80(1)(2) 4.90±0.46(2)

2.2 避暗反應(yīng)實驗 D組較C組大鼠避暗潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增加(P<0.05)。與D組比較，大蒜素干預(yù)各組潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少(P<0.05，表2)。

表2 大鼠避暗反應(yīng)實驗結(jié)果(±s，n=10)Tab. 2 Results of step-through Avoiding Dark Reaction test in rats (±s,n=10)

表2 大鼠避暗反應(yīng)實驗結(jié)果(±s，n=10)Tab. 2 Results of step-through Avoiding Dark Reaction test in rats (±s,n=10)

(1)P<0.05 compared with group C; (2)P<0.05 compared with group D

Group Latent period(s) Times of choosing wrong C 164.25±16.18 0.83±0.15 D 86.47±12.88(1) 2.83±0.32(1)L 106.25±12.88(1) 1.33±0.03(1)(2)M 138.47±11.72(1)(2) 1.53±0.75(1)(2)H 150.83±14.32(2) 1.16±0.41(1)(2)

2.3 跳臺實驗 跳臺實驗結(jié)果顯示，與C組比較，D組大鼠的潛伏期縮短且錯誤次數(shù)明顯增加(P<0.05)。與D組比較，大蒜素干預(yù)各組大鼠的潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少(P<0.05，表3)。

表3 大鼠跳臺實驗結(jié)果(±s，n=10)Tab. 3 The results of step down tests in rats (±s,n=10)

表3 大鼠跳臺實驗結(jié)果(±s，n=10)Tab. 3 The results of step down tests in rats (±s,n=10)

(1)P<0.05 compared with group C; (2)P<0.05 compared with group D

Group Latent period(s) Times of choosing wrong C 33.14±4.99 1.07±0.35 D 15.72±1.65(1) 3.17±0.86(1)L 18.36±3.36(1)(2) 3.00±0.981(1)M 20.52±2.42(1)(2) 2.00±0.89(1)(2)H 24.35±2.58(1)(2) 1.16±0.75(2)

2.4 MDA含量、SOD活性及T-AOC測定 與C組比較，D組大鼠腦組織勻漿中MDA含量明顯升高(P＜0.05)，SOD活性明顯下降(P＜0.05)，T-AOC明顯降低(P＜0.05)。與D組比較，大蒜素組腦組織勻漿中MDA含量減少(P＜0.05)，SOD活性明顯升高(P＜0.05)，T-AOC有所提升(表4)。

表4 大鼠腦組織中MDA含量以及SOD和T-AOC的活性(±s，n=10)Tab. 4 Content of MDA, activity of SOD and T-AOC in brain tissue of rats (±s,n=10)

表4 大鼠腦組織中MDA含量以及SOD和T-AOC的活性(±s，n=10)Tab. 4 Content of MDA, activity of SOD and T-AOC in brain tissue of rats (±s,n=10)

(1)P<0.05 compared with group C; (2)P<0.05 compared with group D; (3)P<0.05 compared with group L

Group MDA(mmol/g·protein)SOD(U/g·protein)T-AOC(U/g·protein) C 10.78±1.25 63.76±9.89 32.56±7.32 D 15.05±3.22(1) 32.9±8.51(1) 20.41±5.57(1)L 15.17±1.30(1) 46.0±13.61(1)(2) 21.45±6.22(1)M 13.20±3.35(1)(2) 50.9±10.16(1)(2) 28.67±3.18(1)(2)(3)H 11.58±2.27(2) 57.4±9.27(1)(2)(3)29.83±8.11(1)(2)(3)

2.5 大鼠海馬區(qū)Bax及Bcl-2的表達(dá) 由圖1可見，D組大鼠海馬區(qū)Bax表達(dá)較C組增強(qiáng)，各大蒜素干預(yù)組中，Bax表達(dá)比D組有所減弱。Bcl-2表達(dá)則與之相反，在C組表達(dá)最強(qiáng)，D組最弱，大蒜素干預(yù)組表達(dá)強(qiáng)于D組而弱于C組。D組大鼠腦部海馬區(qū)Bax表達(dá)明顯強(qiáng)于C組(P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)較C組明顯減弱(P<0.05)，給藥后中、高劑量大蒜素組Bax表達(dá)弱于D組(P<0.05)，而低、中和高劑量組大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)均較D組增強(qiáng)(P<0.05，圖2)。

圖1 大鼠海馬區(qū)Bax和Bcl-2表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果(DAB×200)Fig. 1 Expressions of Bax and Bcl-2 in hippocampus of rats (Immunohistochemistry staining, DAB×200)

圖2 大鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2表達(dá)情況Fig. 2 Expressions of Bax and Bcl-2 in hippocampus of rats(1)P<0.05 compared with group C; (2)P<0.05 compared with group D; (3)P<0.05 compared with group L

3 討 論

通過Morris水迷宮、避暗反應(yīng)實驗和鼠跳臺實驗系列行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠增強(qiáng)衰老大鼠記憶及學(xué)習(xí)能力，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。目前，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的大量具有強(qiáng)氧化性的自由基是引起機(jī)體衰老的主要因素之一[18]，正常情況下，體內(nèi)的抗氧化能力與氧化能力保持動態(tài)平衡[19]，本實驗通過對MDA、SOD及T-AOC系列氧化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)D-半乳糖致衰老大鼠腦部處于過氧化狀態(tài)，大蒜素干預(yù)后，情況有所糾正。過氧化狀態(tài)帶來氧化指標(biāo)改變的同時，也會導(dǎo)致相應(yīng)組織器官細(xì)胞凋亡、壞死、自噬等方面的變化[20]，本實驗通過觀察各組大鼠腦海馬區(qū)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)D組大鼠相較于C組Bcl-2表達(dá)減弱，Bax表達(dá)增強(qiáng)，大蒜素干預(yù)組相較于D組則Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax表達(dá)減少，一般認(rèn)為Bcl-2可以通過結(jié)合并失活促凋亡家族成員中具有破壞線粒體膜完整性功能的Bax蛋白來調(diào)控凋亡，當(dāng)Bcl-2磷酸化或受凋亡因素刺激時，Bcl-2與Bax蛋白結(jié)合的親和力改變，Bax可從其與Bcl-2的結(jié)合體中釋放出來，異位到線粒體，發(fā)揮其促凋亡的功能[21]，實驗結(jié)果提示D-半乳糖致衰老大鼠Bcl-2蛋白家族介導(dǎo)的線粒體凋亡通路激活，導(dǎo)致衰老組大鼠腦海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，而大蒜素有效改變了該通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而抑制衰老大鼠海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡，減緩衰老腦部功能的下降。綜合上述三方面指標(biāo)我們可以得出結(jié)論：D-半乳糖致衰老大鼠的腦部學(xué)習(xí)記憶能力有明顯下降，腦組織處于過氧化應(yīng)激狀態(tài)，海馬區(qū)細(xì)胞線粒體凋亡途徑激活，大蒜素的干預(yù)能明顯降低腦部過氧化水平，減輕海馬區(qū)腦細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，說明大蒜素能夠較好地緩解衰老大鼠腦部功能的減退，且這種作用很有可能是通過降低衰老大鼠腦部氧化應(yīng)激水平并減少大腦主要記憶功能區(qū)——海馬區(qū)腦細(xì)胞的凋亡得以最終實現(xiàn)的。

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Effects of allicin on the capacity for learning and the expression of oxidative stress related proteins in D-galactose induced aging rats

YU Yang1, XU Ye1*, LIU Shi-bing1, LI Song-yan1, ZENG Lin-chuan21Medical Research Laboratory,2Preventive Medicine Undergraduate Class of 2011, Jilin Medical College, Jilin, Jilin 132013, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: xuye_9707@163.com

, E-mail: xuye_9707@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81372793), and the Key Project of "Twelfth Five-year Plan" Science and Technology of Jilin Province (2014552)

ObjectiveTo investigate the effects of allicin on the brain of D-galactose induced aging rats, and explore the possible mechanism of the effect through studying oxidative stress pathway.MethodsFifty male SD rats were randomly divided into 5 groups (10 each): control group (Group C), D-galactose group (Group D), and allicin groups with different allicin dosage, i.e. low-dose allicin group (Group L), medium-dose allicin group (Group M) and high-dose allicin group (Group H). Rats in group C

subcutaneous injection of 0.5ml normal saline, and those in groups D, L, M and H were given injection of 125mg/kg D-galactose for 6 weeks (one time every day at 8:00 am). Meanwhile, rats in groups L, M and H were intraperitoneally injected with allicin in the doses of 10, 20 and 40mg/kg, respectively, while those in groups C and D were injected with the same volume of normal saline as control for 6 weeks (one time every day at 8:00 pm). The learning and memory ability of the rats were observed by ethological examination, and animals were then sacrificed and the brain tissues were acquired. The malondialdehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) activity, and the total antioxidant capacity (T-AOC) in the homogenate of brain tissue weremeasured. Another part of brain tissue was examined under the microscope, and the expression of the apoptosis related proteins in hippocampus was examined. Bax and Bcl-2 expressions were also determined by immunohistochemistry.ResultsEthological examination indicated that, compared with that in group C, the learning and memory ability were attenuated obviously in group D (P<0.05), while the memory ability increased in the 3 allicin groups (P<0.05). Compared with that in group C, the MDA content increased (P<0.05), SOD activity lowered (P<0.05), and T-AOC decreased (P<0.05) in group D. Compared with that in group D, the MDA content decreased (P<0.05), and SOD activity and A-TOC increased in the 3 allicin groups (P<0.05) with a certain dose-effect relationship. Immunohistochemical assay showed that, compared with that in group C, the expression of Bax upregulated significantly (P<0.05), and that of Bcl-2 down-regulated obviously (P<0.05) in group D. Compared with that in group D, the expression of Bax lowered and of Bcl-2 elevated in Groups L, M and H, but the differences showed no statistical significance.ConclusionAllicin may improve the learning and memory ability of aging rats induced by D-galactose, and if may increase the SOD activity, decrease the MDA content, and increase the T-AOC in brain tissue, thus it may attenuate the apoptosis of brain cells in hippocampus of aging rats.

allicin; aging; brain; oxidative stress; apoptosis

R592

A

0577-7402(2015)11-0880-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.05

2015-04-07；

2015-09-22)

(責(zé)任編輯：李恩江)

國家自然科學(xué)基金面上項目(81372793)；吉林省“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(2014552)

于洋，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事衛(wèi)生毒理學(xué)方面的研究

132013 吉林省吉林市 吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實驗室(于洋、徐冶、劉師兵、李松巖)，2011級預(yù)防醫(yī)學(xué)本科班 (曾林川)

徐冶，E-mail：xuye_9707@163.com