劉美麗，宋海旭，邵曉平，趙昕，張效林，田孝祥，閆承慧，韓雅玲

·基礎(chǔ)研究·

趨化因子配體16在高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌重構(gòu)中的作用

劉美麗，宋海旭，邵曉平，趙昕，張效林，田孝祥，閆承慧，韓雅玲

目的探討趨化因子配體16(CXCL16)在高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌重構(gòu)中的作用。方法64只Dahl鹽敏感大鼠按隨機數(shù)字表隨機分為正鹽組及高鹽組，每組32只。正鹽組給予0.3%氯化鈉飲食，高鹽組給予8%氯化鈉飲食；每周監(jiān)測鼠尾血壓。Western blotting檢測正鹽及高鹽飲食2、4、6、8周大鼠心臟組織中CXCL16的表達；免疫熒光雙染法確定CXCL16與心肌細胞及心肌成纖維細胞的共定位；免疫熒光及免疫組化染色觀察6周和8周心臟組織中CXCL16及巨噬細胞標志物的表達變化； HE及Masson三原色法檢測心臟纖維化情況。結(jié)果與正鹽組相比，高鹽組大鼠鹽負荷1周起收縮壓(147.10±3.67mmHgvs128.57±6.32mmHg，P<0.01)、舒張壓(110.86±4.24mmHgvs90.69±4.51mmHg，P<0.01)均有增高趨勢。6周時高鹽組大鼠心臟組織中CXCL16表達明顯上調(diào)(1.18±0.05vs0.58±0.02，P<0.05)，8周時CXCL16的表達進一步增高(1.43±0.06vs0.67±0.03，P<0.05)；8周時高鹽組大鼠心臟出現(xiàn)明顯纖維化重構(gòu)，且巨噬細胞浸潤明顯增多。結(jié)論CXCL16在高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓心肌重構(gòu)中表達增高，可能通過趨化巨噬細胞浸潤參與了心肌纖維化病理過程。

心室重構(gòu)；趨化因子類；鹽敏感性高血壓；巨噬細胞

鹽是高血壓重要的易患因素，但不同個體對鹽負荷或限鹽的血壓反應(yīng)不完全相同。文獻報道，我國的高血壓患者占總?cè)丝诘?0%以上，其中50%以上為鹽敏感性高血壓，且鹽敏感性高血壓是導(dǎo)致心血管疾病的重要獨立危險因素[1-2]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，鹽敏感的原發(fā)性高血壓患者心血管事件發(fā)生率及死亡發(fā)生率均顯著高于鹽不敏感的高血壓患者，進一步提示鹽敏感性是高血壓心血管事件的一個獨立危險因素，但其調(diào)控機制尚未明確[3]。

心肌纖維化是高血壓心肌重構(gòu)的重要病理改變之一，也是高血壓心血管事件發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)。新近研究表明，高血壓心肌纖維化伴隨有冠狀動脈周圍和心肌間質(zhì)的炎癥細胞浸潤，其中趨化因子介導(dǎo)的炎癥細胞浸潤及局部炎癥反應(yīng)在心肌纖維化重構(gòu)中起重要調(diào)控作用，提示趨化因子引起的炎癥反應(yīng)可能是高血壓心血管事件發(fā)生的重要原因之一[4]。但迄今為止，趨化因子在炎癥反應(yīng)和高血壓心肌纖維化中的作用尚未闡明，特別是在鹽敏感性高血壓心肌重構(gòu)中的作用尚未見報道。最近研究發(fā)現(xiàn)，冠心病心肌梗死患者血漿中趨化因子配體16(CXCL16)濃度增高，并與急性冠脈綜合征的嚴重程度呈正相關(guān)，與長期病死率密切相關(guān)，提示CXCL16在心肌梗死后心臟損傷中可能發(fā)揮著重要作用[5-7]。本研究旨在探討CXCL16在鹽敏感性高血壓心肌纖維化過程中的作用及其與炎癥細胞浸潤的關(guān)系，為防治高血壓心肌纖維化和高血壓左室肥厚提供理論依據(jù)和新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 SPF級成年雄性6周齡Dahl鹽敏感大鼠64只，體重150～160g，購于北京維通利華有限公司。將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和實驗組，每組各32只。對照組給予正鹽飲食(0.3%氯化鈉)，實驗組給予高鹽飲食(8%氯化鈉)，正常飲水。

1.2 試劑及儀器 兔單克隆抗CXCL16抗體(貨號ab119350)、兔單克隆抗CD68抗體(貨號ab125212)購于美國Abcam公司；Masson trichrome staining試劑(貨號HT15-1KT)購于美國Sigma公司；DAB試劑盒購于中國邁新生物技術(shù)公司。鼠尾血壓監(jiān)測儀購于北京軟隆生物技術(shù)有限公司。

1.3 血壓測量 正鹽與高鹽組大鼠每組10只，于1～8周每周檢測血壓變化。采用Tail-cuff法測定大鼠尾動脈血壓，平均血壓來自10～20個成功測定的血壓。

1.4 實驗方法

1.4.1 心臟蛋白提取及Western blotting檢測 Dahl鹽敏感大鼠經(jīng)正鹽或高鹽喂養(yǎng)后2、4、6、8周，每組取3只，給予10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，開胸后分離心臟并提取心肌蛋白。采用BCA比色試劑盒測定裂解液中的蛋白質(zhì)濃度，將45μg蛋白加入4×上樣緩沖液，95℃煮沸5min后，經(jīng)10%分離膠行SDSPAGE電泳，判斷電泳終止時間。以350mA電流將樣品轉(zhuǎn)到纖維素膜上，時間80min；在TBST稀釋的5%脫脂奶粉中常溫封閉1.5h后加入一抗(抗CXCL16抗體1:1000，抗β-actin抗體1:2000)，4℃孵育過夜；第2天置搖床上搖晃30min后以TBST洗膜3次，每次15min；加入鼠抗兔二抗(1:1000稀釋)，常溫孵育2h，TBST洗膜4次，每次20min；ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.4.2 免疫組化染色 分別于喂養(yǎng)后6、8周取心臟，每組5只大鼠，然后以4%多聚甲醛溶液固定24h，脫水，石蠟包埋，切片后脫蠟，抗原修復(fù)。滴加過氧化物酶阻斷液，室溫10min，PBS洗3次，滴加非免疫動物血清，室溫20min，除去血清后滴加一抗(1:100)，4℃過夜；第2天常溫放置30min，PBS洗3次；滴加二抗，室溫10min，PBS洗3次；滴加過氧化物酶溶液，室溫10min，PBS洗3次。最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染、返藍、脫水，二甲苯脫洗，封片。

1.4.3 Masson染色 喂養(yǎng)8周后兩組各取5只大鼠，收集整個心臟組織，浸蠟包埋，切片貼片，脫蠟，浸水；Boutins液過夜，流水沖洗2～3h；鐵蘇木素染色15～20min，流水沖洗30s；0.5%鹽酸乙醇分化，氨水返藍；Biebrich Sclarlet-Acid染色12～15min，流水沖洗30s；磷酸溶液2～3min，苯胺藍12～13min，流水沖洗；脫水，透明；中性樹膠封片保存，光鏡下觀察。

1.4.4 HE染色 喂養(yǎng)8周后兩組各取5只大鼠，收集整個心臟組織，浸蠟包埋，切片貼片，脫蠟，浸水；切片放入蘇木精水溶液中染色15min，鹽酸乙醇中分化5s，氨水返藍10min，伊紅染色5min，95%乙醇20s，100%乙醇2min，100%乙醇5min，二甲苯中透明10min，封片，光鏡下觀察。

1.4.5 免疫熒光 染色檢測心肌Ⅰ/Ⅲ型膠原(ColⅠ/Ⅲ)表達情況 分別于高鹽喂養(yǎng)后6、8周收集整個心臟組織，每組5只，包埋心臟，制作冰凍切片。非免疫動物血清室溫封閉切片20min，去除血清后加入待用一抗(1:100)，4℃過夜，次日室溫放置30min后PBS液洗3次，加入二抗(1:100)避光保存2h后PBS液洗3次，DAPI染核后甘油封片，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血壓比較 兩組Dahl鹽敏感大鼠各個時間點血壓值見圖1。喂養(yǎng)1周后，高鹽組大鼠的收縮壓(147.10±3.67mmHg)和舒張壓(110.86±4.24mmHg)即開始高于正鹽組(分別為128.57±6.32mmHg、90.69±4.51mmHg)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。至喂養(yǎng)8周時，高鹽組大鼠收縮壓(241.41±10.41mmHg)和舒張壓(175.18±9.85mmHg)均明顯高于正鹽組(分別為149.50±2.12mmHg、117.33±2.51mmHg，P<0.01)，提示Dahl鹽敏感大鼠高血壓模型建立成功。

2.2 兩組大鼠心肌HE和Masson染色情況 Dahl鹽敏感大鼠經(jīng)給予8%高鹽及0.3%正鹽飲食8周后，心肌HE和Masson染色顯示，與正常鹽負荷組大鼠相比較，高鹽組大鼠心肌間質(zhì)及冠脈管周均出現(xiàn)明顯的纖維化改變，提示Dahl鹽敏感大鼠給予高鹽負荷后出現(xiàn)了較為明顯的心肌纖維化病理損傷(圖2)。

圖1 兩組大鼠不同時間點血壓比較(n=10)Fig.1 Comparison of blood pressure at each time point in two groups (n=10)NS. Normal salt group; HS. High salt group. (1)P<0.01 compared with NS group

圖2 兩組大鼠8周時心肌纖維化情況(×20，n=5)Fig.2 Myocardial fibrosis of rats at the 8th week in two groups (×20,n=5)NS. Normal salt group; HS. High salt group. Arrows point the site of fibrosis

2.3 兩組大鼠膠原蛋白的免疫熒光染色結(jié)果 Dahl鹽敏感大鼠經(jīng)給予8%高鹽及0.3%正鹽飲食8周后，免疫熒光染色結(jié)果顯示，高鹽組大鼠心肌Col Ⅰ及Col Ⅲ熒光染色較正鹽組明顯增強，提示Dahl鹽敏感大鼠高血壓致心肌纖維化重構(gòu)模型構(gòu)建成功(圖3)。

2.4 兩組大鼠心肌CXCL16蛋白的表達情況 Dahl鹽敏感大鼠分別給予8%高鹽及0.3%正鹽飲食后，于2、4、6、8周分別行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，2、4周時兩組大鼠心肌CXCL16表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，6周和8周時高鹽組大鼠心肌組織中CXCL16蛋白表達量(分別為1.18±0.05、1.43±0.06)明顯高于正鹽組(分別為0.58±0.02、0.67±0.03)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。同時，免疫熒光染色顯示，6周時高鹽組心肌CXCL16蛋白熒光染色較正鹽組有所增強，8周時高鹽組心肌CXCL16表達量較正鹽組進一步增強(圖5)。

2.5 CXCL16與心肌細胞及成纖維細胞的共定位情況 鹽負荷8周時將高鹽組大鼠心肌趨化因子CXCL16分別與心肌細胞及心肌成纖維細胞進行免疫熒光雙染色，結(jié)果顯示CXCL16與輔肌動蛋白(α-actinin，為心肌細胞標志物)及波形蛋白(Vimentin，為心肌成纖維細胞標志物)存在共定位關(guān)系(圖6)，提示趨化因子CXCL16可能來源于心肌細胞及心肌成纖維細胞。

圖3 兩組大鼠8周時心肌Col Ⅰ及Col Ⅲ表達情況(免疫熒光染色，×20，n=5)Fig.3 Expression of Col Ⅰ and Col Ⅲ in myocardial tissue at the 8th week in two groups (Immunofluorescence staining, ×20,n=5) NS. Normal salt group; HS. High salt group. Arrows point the expression site of collagen protein

圖4 兩組大鼠不同時間點心肌CXCL16蛋白表達(Western blotting,n=3)Fig.4 Expression of CXCL16 protein in myocardial tissue at each time point (Western blotting,n=3) (1)P<0.05 compared with NS group

圖5 兩組大鼠第6周和第8周心肌CXCL16表達情況(免疫熒光染色，×40，n=5)Fig.5 Expression of CXCL16 in myocardial tissue of rats at the 6th and 8th week in two groups (immunofluorescence staining,×40,n=5)NS. Normal salt group; HS. High salt group; Arrows point the expression site of CXCL16 protein

2.6 兩組大鼠心肌巨噬細胞浸潤情況 Dahl鹽敏感大鼠給予8%高鹽及0.3%正鹽飲食后，CD68免疫組化染色顯示，6周時兩組大鼠心肌CD68浸潤情況無明顯差異，但8周時高鹽組大鼠心肌CD68浸潤明顯較正鹽組加重(圖7)。對以上時間點兩組大鼠心肌進行CD68免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，6周時高鹽組大鼠心肌CD68浸潤尚不明顯，而8周時高鹽組大鼠心肌CD68浸潤與正鹽組比較明顯增加(圖8)，提示心肌巨噬細胞浸潤可能參與了高血壓心肌纖維化這一病理生理過程。

圖6 免疫熒光雙染色檢測CXCL16與心肌細胞及成纖維細胞的共定位關(guān)系(×40，n=5)Fig.6 Co-localization of CXCL16 with both cardiomyocytes and fibroblasts (Immunofluorescence double staining, ×40,n=5)

圖7 CD68免疫組化染色檢測兩組大鼠心肌巨噬細胞浸潤情況(×40，n=5)Fig.7 Comparison of myocardial macrophage infiltration in two groups (CD68 immunohistochemistry staining, ×40,n=5) NS. Normal salt group; HS. High salt group. Arrows point the site of macrophage infiltration

2.7 心肌纖維化部位CXCL16與CD68的共定位關(guān)系

Dahl鹽敏感大鼠給予8%高鹽及0.3%正鹽飲食后，將8周時兩組大鼠的心肌組織進行HE及Massoon染色，可見高鹽組大鼠心肌出現(xiàn)明顯纖維化改變；趨化因子CXCL16及巨噬細胞(CD68)免疫組化染色顯示，在心肌出現(xiàn)纖維化病理改變部位趨化因子CXCL16表達量明顯增加，同時伴有巨噬細胞(CD68)浸潤，且趨化因子CXCL16表達與巨噬細胞(CD68)有較為明顯的共定位關(guān)系(圖9)，提示趨化因子CXCL16可能是通過趨化巨噬細胞參與高血壓心肌纖維化這一病理過程的。

3 討 論

既往研究提示，遺傳性細胞膜離子轉(zhuǎn)運缺陷，鈉離子代謝異常、腎排鈉功能障礙，繼而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷和炎癥是高血壓心肌纖維化重構(gòu)的主要病理機制[8]。其中，高鹽負荷引起心肌細胞氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細胞因子分泌增加，炎癥細胞趨化和浸潤能力增強，可能是鹽敏感性心肌纖維化重構(gòu)的直接分子機制。探討炎癥細胞浸潤的分子機制，可為鹽敏感性心肌纖維化重構(gòu)的治療研究提供新的思路。

趨化因子是一類小分子蛋白，參與各種炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程[9]。目前已明確的趨化因子根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異可分為CXC、CC、C和CX3C 4個亞家族[10-11]。趨化因子SR-PSOX/CXCL16是由Matloubian 等[12]和Wilbanks等[13]同時發(fā)現(xiàn)的一種新的趨化因子，屬于CXC家族。CXCL16由4個結(jié)構(gòu)域組成，分別為趨化結(jié)構(gòu)域、糖基化黏蛋白樣區(qū)域、單螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中趨化結(jié)構(gòu)域錨定于胞膜上、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。CXCL16的結(jié)構(gòu)與跨膜趨化因子CX3C家族中的CX3CL1(Fractalkine)相似，以跨膜蛋白和可溶性蛋白兩種形式存在。

過去幾年的研究發(fā)現(xiàn)，作為一種新的分子，CXCL16可以發(fā)揮黏附分子、趨化因子、清道夫受體三種調(diào)控功能，在動脈粥樣硬化炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。作為黏附分子，CXCL16可以介導(dǎo)T細胞向內(nèi)皮細胞黏附[14]；作為趨化因子，CXCL16的主要功能是促進表達CXCR6的Th1、Tc1及自然殺傷T細胞募集，在平滑肌細胞中促進細胞增殖并引出炎癥性表型[15]；作為清道夫受體，其功能是介導(dǎo)單核巨噬細胞對致動脈粥樣硬化的氧化型低密度脂蛋白的攝取[16]。但目前CXCL16在鹽敏感性高血壓心肌重構(gòu)中的作用尚未見報道。

圖8 CD68免疫熒光染色檢測兩組大鼠心肌巨噬細胞浸潤情況(×40，n=5)Fig.8 Myocardial macrophage infiltration (CD68 immunofluorescence staining, ×40，n=5) NS. Normal salt group; HS. High salt group. Arrows point the site of macrophage infiltration

圖9 心肌纖維化部位CXCL16與巨噬細胞(CD68)的共定位關(guān)系(n=5)Fig.9 Co-localization of CXCL16 and macrophage (CD68) at myocardial fibrosis sites (n=5) HS. High salt group; NS. Normal salt group. Arrows point the expression sites of macrophage or CXCL16 protein

本研究應(yīng)用8%高鹽負荷喂養(yǎng)的方法成功建立了Dahl大鼠高血壓心肌纖維化重構(gòu)模型。Western blotting和免疫熒光染色證實，高鹽負荷6周后大鼠心肌組織中CXCL16表達開始增加，在時相上明顯早于心肌組織中炎癥細胞浸潤和纖維化重構(gòu)的發(fā)生，但晚于高血壓的發(fā)生，該結(jié)果提示CXCL16可能是高鹽誘導(dǎo)心肌損傷后機體生成的重要調(diào)控因子，而鹽負荷8周大鼠心肌纖維化病理損傷部位趨化因子CXCL16與巨噬細胞(CD68)浸潤同時增加，存在著較為明顯的共定位關(guān)系，進一步證實趨化因子CXCL16可能通過趨化巨噬細胞浸潤加重鹽敏感性高血壓心肌纖維化這一病理過程，是鹽敏感性高血壓心肌重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但其在表達時相上明顯晚于高血壓的發(fā)生，因此也提示CXCL16與鹽敏感性高血壓發(fā)生沒有直接相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，本研究通過高鹽負荷的鹽敏感性高血壓大鼠模型證實CXCL16因子表達與心肌炎癥細胞浸潤和心肌重構(gòu)具有明確的相關(guān)性，但具體的調(diào)控機制仍需進一步研究闡明。

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The role of chemokine ligand 16 in high salt induced myocardial remodeling in salt sensitive hypertensive rats

LIU Mei-li1,2, SONG Hai-xu1, SHAO Xiao-ping1, ZHAO Xin1, ZHANG Xiao-lin1, TIAN Xiao-xiang1, YAN Cheng-hui1, HAN Ya-ling1*1Department of Cardiology, General Hospital of Shenyang Command, Shenyang 110016, China
2Department of Vasculocardiology, Clinical Medical College of Dalian Medical University, Dalian, Liaoning 116044, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: hanyaling@gmail.com

, E-mail: hanyaling@gmail.com
This work was supported by the National Key Basic Research and Development Plan (2012CB517804), National Natural Science Foundation of China (81500282), and the Key Project of National “12th Five-Year Plan” Research Program of China (2012ZX09303016-002)

ObjectiveTo investigate the effects of chemokine ligand 16 (CXCL16) in high salt induced myocardial remodeling in salt sensitive hypertensive rats.MethodsSixty-four Dahl salt sensitive (Dahl-SS) rats were randomly divided into normal salt (NS, 0.3% NaCl) and high salt (HS, 8.0% NaCl) group, 32 rats for each group. Blood pressure was measured by tailcuff method every week. Hearts were harvested and the expression of CXCL16 in heart tissues was detected by Western blotting at the 2nd, 4th, 6th and 8th week after NS or HS feeding. Immunofluorescence double staining was used to detect the colocalization of CXCL16 with both cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Immunofluorescence and immunohistochemical staining were used to detect the expression of CXCL16 and the biomarker of macrophage in the myocardial tissue after 6 week and 8 week of NS or HS feeding. Myocardial fibrosis was evaluated by HE and Masson trichrome staining.ResultsCompared with that in NS group, the systolic pressure and diastolic pressure in HS group increased significantly after 1 week of HS feeding (147.10±3.67mmHgvs128.57±6.32mmHg,P<0.01 and 110.86±4.24mmHgvs90.69±4.51mmHg,P<0.01, respectively). HS feeding significantly increased the myocardial CXCL16 expression in rats of HS group at the 6th week (1.18±0.05vs0.58±0.02,P<0.05), and theexpression of CXCL16 was further up-regulated at the 8th week (1.43±0.06vs0.67±0.03,P<0.05). At the 8th week, obvious fibrosis remodeling and macrophage infiltration appeared in the myocardial tissue of the rats in HS group.ConclusionHigh salt intervention could up-regulate the expression of CXCL16 in salt sensitive hypertensive myocardial remodeling, which may promote macrophage infiltration and participate in the pathological process of myocardial fibrosis accordingly.

ventricular remodeling; chemotactic factors; salt sensitive hypertension; macrophages

R544.1；R542.23

A

0577-7402(2015)11-0873-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.04

2015-07-18；

2015-09-05)

(責任編輯：張小利)

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2012CB517804)；國家自然科學(xué)基金青年項目(81500282)；國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制研究項目(2012ZX09303016-002)

劉美麗，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事鹽敏感性高血壓心肌重構(gòu)方面的研究

110016 沈陽 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(劉美麗、宋海旭、邵曉平、趙昕、張效林、田孝祥、閆承慧、韓雅玲)；116044遼寧大連 大連醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科(劉美麗)

韓雅玲，E-mail：hanyaling@gmail.com