張騰國，聶亭亭，陳瓊瓊，毛玉珊

（西北師范大學生命科學學院，蘭州730070）

白菜型油菜CBF基因克隆及功能分析

張騰國，聶亭亭，陳瓊瓊，毛玉珊

（西北師范大學生命科學學院，蘭州730070）

利用RACE技術從‘隴油6號'油菜中克隆得到1個新的CBF（C-repeat binding factor）基因（GenBank登錄號為KP974691），全長1 000 bp，其中包括5＇-UTR 114 bp，3＇-UTR 241 bp，開放閱讀框645 bp，編碼215個氨基酸，推測的蛋白質分子量23.8 kD，理論等電點為4.86。在氨基酸序列水平上，該基因與多種植物具有較高的一致性，其中與蘿卜、紫莖澤蘭、卷果澀薺和擬南芥的一致性分別為93.5%、83.7%、81.0%、79.0%。實時熒光定量PCR分析表明，CBF基因在油菜的莖、葉和下胚軸中均有表達，沒有組織特異性；該基因表達受低溫、ABA、H2O2誘導，MAPKK抑制劑U0126預處理12 h再經低溫、ABA、H2O2誘導，與單獨處理結果相比，CBF基因表達明顯降低，表明該基因在油菜適應低溫、ABA、H2O2脅迫過程中發(fā)揮作用。

油菜；CBF基因；分子克??；表達分析

植物為了維持正常的生長和發(fā)育，需要不斷地感知和適應外界環(huán)境的變化。低溫是主要的環(huán)境脅迫因素之一，當受到低溫脅迫時，絕大多數植物需要經過一段低溫馴化過程以獲得對低溫的耐受能力。在植物響應低溫脅迫的馴化過程中，可引起自身生理生化和分子水平上的變化［1］，包括細胞和組織結構的改變、新陳代謝過程以及基因表達水平的變化等［2］，其中以低溫激活或抑制基因的轉錄最為重要。擬南芥中受低溫調節(jié)的基因占基因組的4%～20%［3］，其中有一類低溫脅迫響應基因COR（cold responsive），其啟動子區(qū)有干旱反應元件DRE/ CRT，擁有共同的核心基序（CCGAC）。Stockinger等［4］從擬南芥中分離得到了能夠結合干旱反應元件DRE/CRT的轉錄因子DREB1/CBF。CBF是一類AP2/EREBP（Apetala2/ethylene-responsive element binding protein）類DNA結合蛋白，其一級結構含有AP2/EREBP的DNA結合域，可以和COR基因啟動子中順式作用元件CRT/DRE（C-repeat/ Dehydration Responsive Element）相互識別并特異性結合。CBF基因家族的3個成員可以被低溫脅迫短暫而迅速地誘導［5-6］，誘導的CBF轉錄因子可以結合到COR基因啟動子順式作用元件上，激活COR基因的表達。異位表達CBF1/3可以激活含有DRE/CRT啟動子元件的基因在常溫下表達，導致組成型低溫耐受［7-8］。

Chinnusamy等［9］從擬南芥中分離得到一個組成型表達的轉錄因子ICE1（inducer of CBF expression 1），ICE1基因編碼類似MYC的b HLH轉錄因子，在低溫脅迫響應途徑中，ICE1作為CBFs的上游因子，可特異地結合到CBF3啟動子的MYC作用元件，激活CBF3的表達并誘導CBF/DREB1下游基因的轉錄表達。組成型過量表達ICE1可增強低溫馴化過程中CBF3、CBF2以及COR基因的表達，提高轉基因植株的低溫耐受能力。ice1突變體可以減弱低溫對CBF3及受CBFs轉錄因子控制的COR基因的誘導表達。在ice1突變體中，大約40%受低溫調節(jié)的基因和46%受低溫調節(jié)的轉錄因子的表達受到了抑制［3］。以上研究表明，由ICE1→CBF→COR組成的低溫響應轉錄網絡在植物低溫馴化過程中發(fā)揮著重要的作用。ICE1轉錄因子在植物體內是組成型表達，并定位于細胞核中，但只有在低溫脅迫過程中，ICE1才能誘導CBFs的表達，說明ICE1要激活下游基因的表達，其本身的活性還受到低溫脅迫誘導的轉錄后調控［9］。有研究表明，低溫脅迫可以誘導ICE1的磷酸化［10］。然而能使ICE1磷酸化激活的上游激酶是什么，目前并沒有明確的研究結果。和ICE1→CBF→COR低溫響應轉錄網絡一樣，植物體內存在的MAP激酶級聯(lián)途徑在響應逆境脅迫過程中同樣發(fā)揮著重要的作用［11］。擬南芥中的研究表明，轉錄因子WRKY53在體外可以被MKK1激活［12］。MPK3/6通過磷酸化轉錄因子EIN3（ethylene-insensitive3）實現(xiàn)對乙烯信號的調解［13］。Popescu等［14］用擬南芥中被特定MKKs激活的10種MPK激酶作為探針，與包含有2 158種蛋白的微陣列芯片雜交，共鑒定出570種MPK磷酸化底物，包括MYB、b ZIPs、AP2/ EREBP、WRKY轉錄因子家族在內的大部分轉錄因子均受到MPK激酶的磷酸化調節(jié)。水稻MAP激酶BWMK1通過磷酸化激活轉錄因子Os-EREBP1，從而增強OsEREBP1與PR基因啟動子GCC元件的結合活性［15］。BWMK1還可以通過磷酸化激活轉錄因子OsWRKY33，增強OsWRKY33與PR基因啟動子W-box元件的結合活性［16］。組成型表達的ICE1轉錄因子是否受MAP激酶的磷酸化激活，進而調控CBF、COR的表達，目前還沒有相關報道。

油菜是重要的油料作物，白菜型冬油菜新品種‘隴油6號'是一種超強抗寒性品種，適應于極端低溫為—20℃～—30℃的中國北方旱區(qū)、寒區(qū)種植，是目前唯一能在甘肅省中北部與河西地區(qū)安全越冬的冬油菜品種。本研究以‘隴油6號'為研究材料，克隆CBF基因，在低溫、ABA、H2O2單獨處理，以及結合MAPKK專一性抑制劑U0126預處理情況下，對該基因的表達進行分析，以期對CBF基因在植物抗逆脅迫中的作用機制提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油菜‘隴油6號'和‘天油2號'種子由甘肅農業(yè)大學提供。選取飽滿均勻的‘隴油6號'和‘天油2號'油菜種子，用水浸泡15 min后，種于含有混合營養(yǎng)土的小塑料盆內，每盆約6～8粒種子，培養(yǎng)條件為25℃/18℃（晝/夜）、光周期為10 h/14 h（光/暗）、光照強度為130μmol·m—2·s—1。培養(yǎng)4周左右后挑選長勢相同的幼苗用于后續(xù)實驗。

1.2 方 法

1.2.1 油菜CBF基因的克隆 選取生長良好的‘隴油6號'油菜幼嫩葉片，按照Trizol試劑說明書進行總RNA提取，提取的RNA用TAKARA公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒進行反轉錄得到相應的c DNA，放置于—20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從GenBank下載已克隆的植物CBF基因序列，用DNAstar軟件Editseq模塊對其編碼區(qū)進行序列編輯，Meg Align模塊進行序列比對，根據比對結果，設計簡并性引物CBF-U（5＇-ATGAMCTCATTTTCWRCYTTYTC-3＇）和CBF-D（5＇-CTARTAACTCCAWAGSGAYAC-3＇，W＝T＋A，R＝A＋G，Y＝C＋T，S＝G＋C）。以反轉錄所得的‘隴油6號'油菜c DNA為模板，按照Premix Ex TaqDNA Polymerase操作說明書（寶生物工程公司）進行PCR擴增。PCR反應體系為：預混酶12.5μL，CBF-U 1μL，CBF-D 1μL，模板1μL，加滅菌去離子水至總體積25μL。擴增條件為：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產物按照Easy Pure Quick Gel Extraction Kit回收試劑盒（離心柱型，購自全式金公司）回收，連入p TG19-T載體。反應體系與反應條件為：緩沖液0.5μL、p TG19-T載體0.5μL、T4DNA連接酶0.5μL、回收產物3.5μL。4℃過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細胞，37℃過夜培養(yǎng)，藍白斑篩選后挑取白斑，經菌液PCR檢測后，挑選陽性克隆，送華大基因公司測序。

將Trizol法提取的‘隴油6號'油菜總RNA按MARTerTMRACE cDNA Amplification Kit方法修飾后用試劑盒內特異性引物反轉錄，再分別進行3＇-RACE和5＇-RACE擴增。根據擴增到的油菜CBF基因中間片段序列，設計3＇-RACE上游特異性引物CBF3＇U1（5＇-CGCCATAGCCCTCCGTGGCAAATC-3＇），試劑盒中自帶的short primer作為匹配的下游引物，以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到預期大小的片段，切膠回收，連接p TG19-T載體，轉化大腸桿菌Trans 5α，藍白斑篩選陽性克隆、測序。根據擴增到的油菜CBF基因中間片段序列，設計5＇-RACE下游特異性引物CBF5＇D1（5＇-AACAAGGTCGGCATCCCGAACATGGAC-3＇），試劑盒自帶的short primer作為匹配的上游引物，以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到預期大小的片段切膠回收，連接p TG19-T載體，轉化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，藍白斑篩選陽性克隆、測序。根據3＇-RACE和5＇-RACE測序結果，設計1對引物擴增CBF全長基因。PCR產物純化回收后，連接p TG19-T載體，轉化大腸桿菌Trans 5α，37℃過夜培養(yǎng)。藍白斑鑒定篩選陽性克隆測序。

1.2.2 油菜CBF預測蛋白的生物信息學分析 應用DNAstar軟件Protean模塊進行氨基酸組成成分、蛋白基本特征分析，Clustal方法進行以氨基酸序列為基礎的序列比對。用在線工具SOPMA預測蛋白質的二級結構；根據生物信息學軟件Top-Pred（http：//services.cbib.U-bordeaux2.fr/pise/ Toppred.htm1）在線分析蛋白的親水/疏水性。

1.2.3 油菜CBF基因實時熒光定量PCR 用 Ta KaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM定量分析不同組織和不同處理條件下CBF基因表達水平的變化。從‘隴油6號'油菜的莖、葉、下胚軸提取總RNA，反轉錄后用實時熒光定量PCR檢測CBF基因組織特異表達。

低溫處理：選取培養(yǎng)4周，長勢良好的‘隴油6號'和‘天油2號'油菜幼苗，4℃低溫誘導，分別在處理0、12、36和48 h后提取幼嫩葉片總RNA。ABA處理：培養(yǎng)4周的油菜幼苗噴灑100μmol/L ABA溶液于植株葉面，噴到葉片滴水為止，分別在處理0、1、8和12 h后提取幼嫩葉片總RNA。H2O2處理：用Hoagland營養(yǎng)液配制的不同濃度H2O2溶液（0、5、10和15 mmol/L），浸泡培養(yǎng)4周的油菜幼苗24 h，剪取幼嫩葉片直接用于RNA提取。MAPKK抑制劑U0126預處理后再逆境處理：將培養(yǎng)4周的油菜幼苗用蒸餾水清洗，放入水中2 h以抵消損傷脅迫，然后放入10μmol/L MAPKK專一抑制劑U0126溶液中預處理12 h，再轉入上述各種逆境處理，提取不同處理條件下幼嫩葉片總RNA。以上不同處理后提取的總RNA，經反轉錄得到cDNA作為實時熒光定量PCR模板。分別以Actin F（5＇-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3＇）和ActinR（5＇-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3＇）為管家基因引物，CBFDL-U1（5'-TAAGTGGGTGTGTGAGGTGAGG-3＇）和CBFDL-D1（5＇-TGAGGCAGGCGGATTTG-3＇）為CBF引物，進行熒光定量PCR擴增，每個樣品做3個重復。擴增體系為：SYBR Premix Ex TaqTM12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA 2μL，dd H2O 9.5 μL。擴增程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)；55～95℃每30 s漸進升高0.5℃，81個循環(huán)。采用2—ΔΔCt方法分析數據，確定基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 油菜CBF基因的克隆

根據GenBank上已知的植物CBF基因序列，設計簡并引物，以‘隴油6號'油菜中提取的總RNA反轉錄產物為模板，擴增得到約650 bp大小的單一條帶（圖1），此條帶和預期大小相符，將其測序結果與其他植物的CBF基因進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtCBF1基因具有較高的一致性，為84.0%。因此，初步判斷擴增產物為油菜CBF基因片段。

3＇-RACE擴增產物大小在500～750 bp之間（圖2，A），與預期擴增片段大小相符。測序結果與前面擴增得到的油菜CBF基因片段進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)重疊部分核苷酸序列完全相同，說明3＇-RACE得到片段與克隆得到的CBF基因片段屬于同一條基因。5＇-RACE擴增產物大小在500～750 bp之間（圖2，B），與預期擴增片段大小相符，測序結果經序列比對，與前面擴增得到的基因片段中重疊部分核苷酸序列完全相同，說明5＇-RACE獲得的片段與前面克隆得到的中間片段屬于同一條基因。

將簡并引物擴增得到的中間片段序列和RACE擴增得到的5＇和3＇端序列進行拼接，得到一條1 000 bp基因序列，包含1個645 bp開放閱讀框（ORF），起始密碼子ATG前5＇-UTR 114 bp，終止密碼子TAG后3＇-UTR 241 bp，包含30 bp的poly A。該基因編碼215個氨基酸（圖3），分子量為23.8 k D，等電點為4.86。為了進一步確認油菜CBF基因拼接序列，根據3＇-RACE和5＇-RACE擴增序列設計引物進行PCR擴增，獲得的片段與拼接序列的核苷酸組成完全相同。

2.2 油菜CBF推導氨基酸序列與其他植物氨基酸序列比對分析

從GenBank中下載已知植物CBF基因序列，利用DNAStar軟件，將所有基因的CDS區(qū)導入Megalign模塊，用Clustal W方法進行氨基酸序列的比對（圖4）。結果表明，油菜CBF預測蛋白符合CBF家族蛋白的特征，含有CBF家族蛋白特征序列‘PKK/RPAGR×KF×ETRHP'和‘DSAWR'（圖4）。與多種植物的CBF蛋白有較高的一致性，其中與蘿卜RsCBF1（GQ866977）、紫莖澤蘭AaCBF3（KF804148）、卷果澀薺MsCBF3（JQ687138）和擬南芥AtCBF1（ATU77378）的一致性分別為93.5%、83.7%、81.0%和79.0%。

圖1 油菜CBF基因片段RT-PCR擴增M.DL2000；1.CBFFig.1 RT-PCR amplification of CBF fragment in B.campestris

圖2 CBF基因3＇-RACE和5＇-RACE PCR擴增結果M.DL2000；A.3＇-RACE；B.5＇-RACEFig.2 3＇-RACE and 5＇-RACE PCR product of CBF

圖3 CBF基因cDNA序列及預測氨基酸序列Fig.3 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of B.campestris CBF gene

圖4 油菜CBF與部分植物CBF氨基酸序列比對下劃線序列為CBF家族蛋白特征序列CBF.油菜；AaCBF3（KF804148）.紫莖澤蘭；HrCBF（EF502044）.沙棘；AtCBF1（ATU77378）、AtCBF2（AF074601）、AtCBF3（AF062925）.擬南芥；OpCBF1（FJ491244）.無苞芥；CsCBF1（DQ776899）.黃瓜；CbCBF（AY994127）.高山離子芥；LpCBF3（KF283992）.抱莖獨行菜；MsCBF3（JQ687138）.卷果澀薺；RsCBF1（GQ866977）.蘿卜Fig.4 Alignment of the B.campestris CBF with CBF from other plant species The underlined sequences are CBF family protein character sequences CBF.Brassica campestris；AaCBF3（KF804148）.Ageratina adenophora；HrCBF（EF502044）.Hippophae rhamnoides；AtCBF1（ATU77378），AtCBF2（AF074601），AtCBF3（AF062925）.Arabidopsis thaliana；OpCBF1（FJ491244）.Olimarabidopsis pumila；CsCBF1（DQ776899）.Cucumis sativus；CbCBF（AY994127）.Chorispora bungeana；LpCBF3（KF283992）.Lepidium perfoliatum；MsCBF3（JQ687138）.Malcolmia scorpioides；RsCBF1（GQ866977）.Raphanus sativus

油菜CBF預測蛋白的疏水性在線分析表明，CBF為親水性蛋白。油菜CBF蛋白二級結構在線預測結果顯示，油菜CBF蛋白包含30.84%α-螺旋、10.75%延伸鏈、3.27%β-轉角和55.14%不規(guī)則卷曲。由預測結果知油菜CBF蛋白主要以不規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，這種均衡的α-螺旋和無規(guī)則卷曲二級結構的存在是AP2類轉錄因子的基本特征。

2.3 油菜CBF基因表達分析

提取‘隴油6號'油菜莖、葉和下胚軸m RNA反轉錄得到的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR，分析CBF基因在油菜不同組織的表達。結果表明，CBF基因在油菜莖、葉和下胚軸中均有表達，沒有組織特異性。在下胚軸中相對表達量最為豐富，其次是莖，葉中最弱（圖5）。

4℃低溫處理結果表明，2種油菜中CBF基因表達受4℃低溫脅迫誘導，隨著處理時間的增加，CBF基因表達整體上呈先升高后降低趨勢。在‘隴油6號'中，其增長幅度比‘天油2號'更明顯，表明CBF基因在‘隴油6號'中受低溫脅迫誘導程度更強，與‘隴油6號'比‘天油2號'抗寒性更強的生理特性一致。MAPKK抑制劑U0126預處理12 h后再4℃低溫處理，結果顯示，與各自單獨4℃低溫處理相比，2種油菜中CBF基因轉錄水平整體變化趨勢一致，但表達量均有不同程度下降（圖6，A）。說明MAPKK抑制劑U0126預處理抑制了4℃低溫脅迫對油菜CBF基因的誘導，造成其轉錄水平降低。

外源ABA處理結果表明，‘隴油6號'中，噴灑100μmol/L ABA溶液處理1 h和8 h時，與0 h相比，CBF基因表達沒有明顯變化，處理12 h時，表達量為對照的9倍。‘天油2號'中，CBF基因表達各處理與0 h沒有明顯變化（圖6，B）。MAPKK抑制劑U0126預處理12 h后ABA處理結果顯示，與各自單獨ABA處理結果相比，2種油菜中CBF基因轉錄水平整體變化趨勢一致，但表達量均有不同程度下降。

H2O2處理結果表明，2種油菜同時在不同濃度H2O2溶液（0、5、10和15 mmol/L）處理24 h，‘隴油6號'CBF基因表達呈先升高后下降趨勢，相對于0 mmol/L，整體呈現(xiàn)上升趨勢，在5 mmol/L處理條件下達到最大?！煊?號'中，CBF基因表達也較0 mmol/L有不同程度增強，呈先升高后降低趨勢，在10 mmol/L達到最大。MAPKK抑制劑U0126預處理12 h后H2O2處理結果顯示，與各自單獨H2O2處理結果相比，2種油菜中CBF基因整體變化趨勢基本一致，但表達量均有不同程度下降（圖6，C）。說明MAPKK抑制劑U0126預處理抑制了H2O2對油菜CBF基因轉錄的誘導，造成其轉錄水平的降低。

圖5 CBF基因不同組織中的表達Fig.5 The expression of CBF gene in different tissues

圖6 不同處理下2種油菜中CBF基因的表達Fig.6 The expression of CBF gene of B.campestris under different treatments

3 討 論

本研究從‘隴油6號'油菜中克隆得到了含完整編碼序列的CBF基因，序列分析表明油菜CBF基因和其他植物中已克隆得到的CBF基因同源性很高。CBF是植物所特有的轉錄因子，由低溫、干旱及高鹽等逆境脅迫誘導表達后，可激活依賴DRE/ CRT順式作元件的抗逆功能基因的表達，從而增強植物對干旱、低溫及高鹽等逆境的抗性。擬南芥中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達受到低溫脅迫短暫而強烈的誘導［17］。大豆中Gm DREB3/CBF3基因的表達受低溫脅迫的誘導，過表達Gm DREB3/ CBF3可以提高轉基因植物對低溫、干旱和高鹽脅迫的耐受性［18］。本研究表明，CBF基因在油菜莖、葉和下胚軸中均有表達，但沒有組織特異性。另外，CBF的表達受低溫脅迫的誘導，‘隴油6號'中CBF基因受低溫誘導程度比‘天油2號'強，這與‘隴油6號'比‘天油2號'更具抗寒性的生理特性相符。CBF基因的表達除了受到低溫、干旱、高鹽脅迫的誘導，ABA對CBF轉錄水平也有一定影響。如擬南芥CBF4的表達受干旱和ABA處理的誘導，但不受低溫脅迫的影響［19］。大豆中Gm DREBc的表達受ABA、干旱和高鹽脅迫的誘導［20］。葡萄Vv CBF 1、Vv CBF 2［21］，大麥Hv CBF3的表達也可受到ABA的誘導［22］。本研究表明，‘隴油6號'在ABA處理12 h后CBF基因表達量有明顯的升高，而‘天油2號'油菜中ABA處理下CBF基因表達量與0 h相比沒有明顯變化。Maruta等［23］的研究結果表明，植物葉綠體中清除H2O2的關鍵酶APX活性被抑制后，CBF1基因的轉錄水平會受到抑制，而外源H2O2處理對CBF表達的影響目前還沒有相關報道。本研究結果表明，外源H2O2處理下，油菜CBF基因的轉錄水平與對照相比有不同程度的提高，其調控機理還需要進一步研究。ICE1是CBF基因的正調控因子，能直接作用于CBF基因的啟動子上，ICE1轉錄因子在植物體內是組成型表達，在低溫脅迫誘導下ICE1被磷酸化激活后才能誘導CBFs的表達［9］，本研究用MAPKK抑制劑U0126預處理后再進行低溫、ABA、H2O2脅迫時，發(fā)現(xiàn)油菜CBF基因的轉錄水平與單獨脅迫處理相比明顯降低，說明MAPKK抑制劑U0126預處理抑制了逆境脅迫對油菜CBF基因轉錄的表達，表明由MAPKKK、MAPKK、MAPK構成的MAP激酶信號傳導途徑與CBF的表達有相關性。推測MAPK有可能是ICE1轉錄因子的上游磷酸化激酶。關于MAP激酶信號傳導途徑與ICE1、CBF、COR構成的低溫響應轉錄網絡是否關聯(lián)，需要進一步的研究。

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（編輯：宋亞珍）

Isolation and Characterization of a CBF Gene from Brassica campestris

ZHANG Tengguo，NIE Tingting，CHEN Qiongqiong，MAO Yushan
（School of Life Sciences，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

A novel CBF gene was isolated from Brassica campestris L.Longyou 6 by RACE.The full-length c DNA of CBF（GenBank No.KP974691）was 1 000 bp，contained a 5＇-UTR of 114 bp，a 3＇-UTR of 241 bp，and a 645 bp opening reading frame.The deduced protein was 215 amino acids with molecular weight 23.8 k Da and isoelectric point 4.86.On the amino acid sequence level，this gene showed high identities with Raphanus sativus，Ageratina adenophora，Malcolmia scorpioides and Arabidopsis thaliana（93.5%，83. 7%，81.0%and 79.0%）.RT-PCR analysis revealed that CBF were expressed in the stems，leaves，and hypocotyls with almost no tissue specificity.The transcript level of CBF was increased in response to cold，ABA and H2O2stress.However，MAPKK inhibitor U0126 pretreatment 12 h before cold，ABA and H2O2stress，the expression level of CBF was significantly decreased compared with the single stress.The results suggested that CBF played an important role during cold，ABA and H2O2stress in B.campestris.

Brassica campestris；CBF gene；molecular cloning；expression analysis

Q785；Q786

A

1000-4025（2015）10-1964-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.10.1964

2015-06-18；修改稿收到日期：2015-08-22

國家自然科學基金（31460099，31160089）；甘肅省自然科學基金（1208RJZA268）

張騰國（1971—），男，博士，教授，主要從事抗逆生理及分子生物學研究。E-mail：zhangtengguo@163.com