崔 波,劉 佳，王潔瓊，蔣素華，武振江，葉永忠

(1.鄭州師范學(xué)院，河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系研究

崔 波1,2,劉 佳2，王潔瓊2，蔣素華1，武振江2，葉永忠2

(1.鄭州師范學(xué)院，河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以鐵皮石斛原球莖為受體，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化中的草甘膦篩選壓力，菌液濃度，乙酰丁香酮濃度，預(yù)處理方法，侵染時(shí)間，美羅培南濃度等轉(zhuǎn)化影響因子進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，摁壓處理下的原球莖在添加濃度為200 μmol·L-1乙酰丁香酮的菌液中侵染30 min, 菌液濃度OD600為1.0，共培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)入添加質(zhì)量濃度為50 mg·L-1美羅培南和質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1的草甘膦篩選培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化效率最高。經(jīng)GUS組織化學(xué)染色及PCR分析鑒定，初步證明ACC合成酶反義基因已整合到鐵皮石斛的基因組中。

鐵皮石斛；原球莖；ACC合成酶；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物，有多方面的應(yīng)用價(jià)值[1,2]。蘭科快繁技術(shù)已較為成熟，在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用，但改良品種，開發(fā)新產(chǎn)品，滿足人們對(duì)新、奇、特花卉種類的需求等尚有很多工作要做[3]。傳統(tǒng)雜交育種是培育新品種的主要途徑，但雜交育種受種質(zhì)資源、生長緩慢、發(fā)育周期長[4,5]等因素的限制，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)可對(duì)鐵皮石斛品種進(jìn)行定向、快速改良植物的性狀，是培育植物新品種的重要方法之一，也為蘭科品種改良提供了廣闊的前景[6]。蘭科植物轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，目前尚處于初始階段[7]。相對(duì)于傳統(tǒng)的雜交育種手段，轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有目的性強(qiáng)，不受季節(jié)控制等諸多優(yōu)點(diǎn)。其中根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是應(yīng)用最廣最成功的手段[8]，其高效植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法不受基因型限制，便于操作，更利于獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。本研究以鐵皮石斛的原球莖為試驗(yàn)材料，建立了鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為鐵皮石斛的分子育種研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與菌株質(zhì)粒 受體材料為鐵皮石斛種子經(jīng)無菌萌發(fā)產(chǎn)生的原球莖，農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為 EHA105(鄭州師范學(xué)院生物工程研究所實(shí)驗(yàn)室保存)[9]，質(zhì)粒為pCAMBIA3301-RTACS (含有ACC合成酶反義基因片段、GUS基因和PPT抗性基因，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 PPT(Glyphosate，草甘膦)，Mer(Meropenem，美羅培南)，AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)，Kana(Kanamycin,卡那霉素)，Rif(Rifampicin,利福平)，種子萌發(fā)培養(yǎng)基：1/4 MS+蛋白胨1 g·L-1+椰乳15%+KT 0.5 mg·L-1+糖15 g·L-1+AC 1 g·L-1+瓊脂10 g·L-1；稀釋培養(yǎng)基：1/2 MS液體培養(yǎng)基；共培養(yǎng)基：1/2 MS固體培養(yǎng)基；分化培養(yǎng)基：花寶1號(hào)3 g·L-1+1/2 MS +6-BA 10 mg·L-1+椰乳20 g·L-1+瓊脂10 g·L-1+糖20 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 PPT壓力篩選 將生長緊實(shí)、顏色濃綠的鐵皮石斛原球莖進(jìn)行PPT壓力篩選，PPT質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，培養(yǎng)2個(gè)月并定期觀察原球莖的生長狀況。

1.2.2 受體材料的預(yù)處理 挑取生長期一致、優(yōu)良的鐵皮石斛原球莖25 ℃暗培養(yǎng)3 d后，進(jìn)行刀切、摁壓、針刺3種方式的預(yù)處理，使其產(chǎn)生傷口，利于農(nóng)桿菌侵入原球莖組織內(nèi)。

1.2.3 菌液活化 -80 ℃保存的帶有pCAMBIA3301-RACS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，取出冰融，平板培養(yǎng)，隨機(jī)挑選單菌落，接種到1 mL附加100 mg·L-1Kan和50 mg·L-1Rif的YEB液體培養(yǎng)基(pH值7.0)中，在恒溫?fù)u床上，28 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜，將菌液按1∶500的體積比轉(zhuǎn)入50 mL新配制的含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約16 h，測(cè)其 OD600為0.6、0.8、1.0、1.2，4 ℃下5 000 r·min-1離心8 min后收集菌體，用1/2 MS液體培養(yǎng)液洗菌體1次(低溫下進(jìn)行)，棄上清液，收集菌體，再次加入1 /2 MS液體培養(yǎng)液，使其稀釋倍數(shù)為原菌液體積的1.0×作為侵染菌液的濃度，在28 ℃ 75 r·min-1條件下加入濃度為0、100、200、300 μmol·L-1乙酰丁香酮活化菌液2 h。

1.2.4 受體材料侵染 在超凈工作臺(tái)上，將預(yù)處理過的鐵皮石斛原球莖放入已活化的菌液中，在28 ℃ 75 r·min-1下橫搖10、20、30 min。倒掉菌液，濾出原球莖，轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基上28 ℃暗培養(yǎng)48 h，至原球莖下長出農(nóng)桿菌菌絲。

挑取帶有菌絲的原球莖置于無菌三角瓶中，無菌水沖洗至肉眼看不到菌絲，再用25 mg·L-1Mer沖洗3次，除去剩余農(nóng)桿菌，期間不斷振蕩，最后1次沖洗后靜止30 min，讓粘附于原球莖的農(nóng)桿菌擴(kuò)散到水里，最后用50 mg·L-1Mer浸泡30 min，期間不斷震蕩，然后將原球莖挑出至無菌濾紙上吸干多余水分，再將原球莖分別接種于含有質(zhì)量濃度為20、30、50 mg·L-1Mer和PPT的分化培養(yǎng)基中，置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其分化，產(chǎn)生不定芽，定期觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 GUS染色檢測(cè) 取共培養(yǎng)3 d后的原球莖與未轉(zhuǎn)基因原球莖分別放到Eppendorf管中，加入5 mL反應(yīng)液(0.025 mg·L-1X-gluc 200 μL，0.1 mg·L-1鐵氰化鉀2.5 μL，0.1 mg·L-1亞鐵氰化鉀2.5 μL，0.1 mg·L-1磷酸鹽緩沖液4.79 mL，TritonX-100 5 μL)，在37 ℃下過夜，用無水乙醇脫色，觀察并統(tǒng)計(jì)染色情況。

1.2.6 PCR檢測(cè) 取100 mg對(duì)照植株及轉(zhuǎn)基因植株葉片，經(jīng)液氮冷凍充分研磨后用快速植物基因組試劑盒提取DNA，根據(jù)GUS基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，上游5’-GGTCACTCATTACGCAAAGT-3’，下游5’-ACTCCACATCACCACGCTT-3’，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總長為989 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛原球莖PPT篩選壓力的確定

將鐵皮石斛原球莖放入含有不同質(zhì)量濃度的PPT培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，2個(gè)月后觀察原球莖的生長情況并計(jì)算死亡率。結(jié)果顯示，在0.5 mg·L-1PPT的培養(yǎng)基上，原球莖能夠保持綠色，正常生長；PPT質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)對(duì)鐵皮石斛原球莖的增殖和分化有抑制作用，原球莖PLBs存活率為56.76%，一部分PLBs表現(xiàn)出發(fā)白或黃化，不能繼續(xù)生長；當(dāng)PPT質(zhì)量濃度在2.0 mg·L-1以上，PLBs全部死亡。由圖1可知，PPT質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí)對(duì)鐵皮石斛原球莖篩選效果最好，可明顯區(qū)分轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化鐵皮石斛原球莖的有效篩選壓。

圖1 不同PPT質(zhì)量濃度對(duì)鐵皮石斛原球莖死亡率的影響Fig.1 Effect of PPT concentration on the death rate of Dendrobium officinale protocorms

2.2 原球莖預(yù)處理方法的選擇

在超凈工作臺(tái)上，分別使用刀切、針刺、摁壓3種方法對(duì)播種30 d后又經(jīng)過暗培養(yǎng)3 d的鐵皮石斛原球莖作預(yù)處理，然后放入質(zhì)量濃度為1.0的菌液中侵染30 min，共培養(yǎng)2 d后去除多余農(nóng)桿菌菌絲并轉(zhuǎn)移到含Mer和PPT的分化培養(yǎng)基上，30 d后觀察原球莖生長情況。結(jié)果如表1所示，摁壓法處理的原球莖存活率最高，達(dá)86.27%，適合鐵皮石斛原球莖的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

表1 預(yù)處理方法對(duì)原球莖存活率的影響 Table 1 Effects of different treatments on the survival of Dendrobium officinale protocorms

2.3 菌液濃度對(duì)原球莖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

將原球莖分別放入濃度為0.6、0.8、1.0、1.2 μmol·L-1的菌液中進(jìn)行侵染，結(jié)果如表2所示。農(nóng)桿菌菌液OD600值在0.6～1.0時(shí)，隨OD600值的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，菌液濃度OD600為1.0時(shí)，GUS的瞬時(shí)表達(dá)率最高，可達(dá)22.22%。但OD600值超過1.0時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率下降明顯， OD600值為1.2時(shí)表達(dá)率是OD600為1.0時(shí)的0.45倍。

表2 不同菌液濃度對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響Table 2 Effects of bacterial concentration on transient expression of GUS

2.4 乙酰丁香酮對(duì)鐵皮石斛原球莖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

在活化菌液時(shí)，AS濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果如表3所示。在不添加AS的情況下，轉(zhuǎn)化率只有12.50%，添加AS后轉(zhuǎn)化率明顯比不添加AS要高，說明添加AS在一定范圍內(nèi)可提高鐵皮石斛農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化率，當(dāng)添加濃度為200 μmol·L-1效果最佳，轉(zhuǎn)化率為58.82%，當(dāng)AS濃度達(dá)到300 μmol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)化率是濃度為200 μmol·L-1的0.32倍。因此，200 μmol·L-1為最適宜濃度。

表3 鐵皮石斛預(yù)培養(yǎng)不同濃度AS對(duì)GUS染色效率的影響 Table 3 Effect of preculture with different concentration of AS on GUS histochemical staining of protocorms of Dendrobium officinale

2.5 不同侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

將原球莖放入菌液中后，農(nóng)桿菌需要經(jīng)過一段時(shí)間才能附著，而侵染時(shí)間的長短會(huì)直接影響轉(zhuǎn)化效率。由試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著浸泡時(shí)間的延長，GUS瞬時(shí)表達(dá)率隨之增大，在30 min時(shí)最高，達(dá)到9.84%；當(dāng)時(shí)間延長到60 min時(shí),表達(dá)率低于10 min的表達(dá)率，且外植體褐化死亡增多。

2.6 美羅培南抑菌劑質(zhì)量濃度的選擇

美羅培南可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長，為原球莖的生長提供良好壞境。將與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的鐵皮石斛原球莖放入含有質(zhì)量濃度20、30、50 mg·L-1美羅培南的培養(yǎng)基中，結(jié)果如表4所示。美羅培南質(zhì)量濃度為30 mg·L-1時(shí)，農(nóng)桿菌除菌率高，分化率也最高，達(dá)76﹪； 在美羅培南質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時(shí)，農(nóng)桿菌菌落數(shù)為0，但是原球莖分化率降低，說明高質(zhì)量濃度的美羅培南能降低外植體的分化率，抑制原球莖的再生。

表4 Mer質(zhì)量濃度對(duì)農(nóng)桿菌侵染原球莖的影響 Table 4 Effect of Mer on Agrobacterium-infected protocorms

2.7 GUS活性檢測(cè)

由GUS組織化學(xué)染色可知(圖2)，有抗性的鐵皮石斛原球莖上的藍(lán)色斑點(diǎn)多而集中(圖2-A)，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照原球莖未變藍(lán)色(圖2-B)，可初步證明圖2-A中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛基因侵染成功。

圖2 鐵皮石斛原球莖GUS組織化學(xué)染色Fig.2 GUS histochemical staining of protocorms of Agrobacterium-infected Dendrobium officinale

2.8 PCR檢測(cè)

將獲得的5株具有PPT抗性的再生植株及未轉(zhuǎn)化植株提取DNA(圖3)。PCR結(jié)果顯示(圖4)，3株能特異性地?cái)U(kuò)增989 bp的條帶，與質(zhì)粒PCR擴(kuò)增出的條帶完全相同。而未轉(zhuǎn)基因植株無條帶出現(xiàn)，因此初步證明這3株鐵皮石斛為陽性轉(zhuǎn)化植株。

1～5：轉(zhuǎn)化植株；6：未轉(zhuǎn)化植株。 1 to 5: Transformed plant;6: Untransformed plant.

3 討論

在建立成熟高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系過程中，選擇出最優(yōu)的侵染條件是十分必要的。對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率諸因素的研究發(fā)現(xiàn)：(1)由于鐵皮石斛原球莖生長緊實(shí)，不易侵染，摁壓處理后的原球莖轉(zhuǎn)化率最高，這可能是因?yàn)獒槾烫幚淼膫谶^小，農(nóng)桿菌無法有效地侵染到原球莖；刀切處理也有可能對(duì)原球莖傷害過大導(dǎo)致不能正常生長，死亡率增加。(2)侵染時(shí)間為30 min時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，到60 min時(shí)反而下降，這表明侵染時(shí)間過短，T-DNA未能成功轉(zhuǎn)入植物基因組內(nèi)，而時(shí)間過長，農(nóng)桿菌過多生長對(duì)原球莖造成毒害作用[10]，這一結(jié)果與馮瑩[11]的研究一致。(3)乙酰丁香酮可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達(dá)，促進(jìn)農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[12,13]。而單子葉植物由于不分泌酚類物質(zhì)或酚類物質(zhì)含量低而不能誘導(dǎo) Vir 基因的活化, 因此可以通過添加乙酰丁香酮對(duì)單子葉植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而劉小琳等[14]，黃天帶等[15]的研究結(jié)果認(rèn)為AS的添加不能提高轉(zhuǎn)化效率，這可能與受體材料的類型差異有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加濃度為200 mol·L-1的乙酰丁香酮可顯著提高抗性原球莖獲得率，但是AS濃度過高轉(zhuǎn)化率會(huì)下降，其原因可能是高濃度的AS使農(nóng)桿菌侵染活力增強(qiáng)，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞受到農(nóng)桿菌的毒害而無法生存,而且較高濃度的AS對(duì)農(nóng)桿菌的生長也有影響。(4)張振華等[16]和MEN等[17]用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化石斛時(shí)，也是使用相對(duì)較高濃度(OD600為0.8～1.2)的菌液，但CHAI等[18]認(rèn)為，使用低濃度菌液侵染可以避免因農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)時(shí)過度繁殖而引起的原球莖死亡。本研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌液OD600值為1.0時(shí)的濃度具有較高的轉(zhuǎn)化效率，且未發(fā)現(xiàn)因農(nóng)桿菌過度生長而導(dǎo)致難除菌的問題。

1：pCAMBIA3301-RTACS質(zhì)粒；2～6：轉(zhuǎn)化植株；7：未轉(zhuǎn)化植株；M:mark DL2000。 1:pCAMBIA3301-RTACS plasmid;2 to 6: Transformed plant;7:Untransformed plant;M:Mark DL2000.

本試驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上，參考其他植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素，設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行研究[19-23]。GUS基因PCR結(jié)果顯示，并不是所有侵染植株表現(xiàn)出陽性反應(yīng)，仍然有假轉(zhuǎn)化體存在，假轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生是目前遺傳轉(zhuǎn)化中非常普通的現(xiàn)象，需要更深層次的研究進(jìn)行改善。本研究為鐵皮石斛的轉(zhuǎn)基因提供了技術(shù)平臺(tái)，也為鐵皮石斛新品種開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，但是對(duì)植株新性狀的獲得還需要更進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

Study onAgrobacterium-mediated transformation system ofDendrobiumofficinale

CUI Bo1,2, LIU Jia2， WANG Jieqiong2， JIANG Suhua1， WU Zhenjiang2， YE Yongzhong2

(1.Zhengzhou Normal College，Zhengzhou 450044，China; 2.College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

Using the protocorms ofDendrobiumofficinaleas recipient materials, the genetic transformation system ofDendrobiumofficinalewithAgrobacterium-mediated method was studied, and such influencing factors as PPT’s resistant pressure, infection concentration of bacteria, concentration of AS, treatment methods of protocorms, infection time and concentration of Mer of the system were also optimized. The results showed that the press-treated protocorms were infected successfully by using the screening medium which contained 50 mg·L-1Mer and 2.0 mg·L-1PPT after being treated withAgrobacteriumtumefacienssuspension (OD600=1.0, added 200 μmol·L-1AS) for 30 min and co-cultured for 48 h.GUS histochemical staining and PCR analysis of the regenerated plants confirmed that the ACC synthase antisense gene had been introduced into theDendrobiumofficinalegenome.

Dendrobiumofficinale; protocorms; ACC synthase; genetic transgenic；transformation system optimization

2014-10-14

鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(074SGYS33205-2)；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110128)

崔 波(1962-)，男，河南泌陽人，研究員，主要從事花卉分子生物學(xué)研究。

葉永忠(1957-)，男，湖北黃岡人，教授，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2015)02-0208-05

S435.72

A