劉達綜，高慧珊，劉 娜，何潔明，徐樹蘭，鄭常格，呂思行

(廣州市生物防治站 廣東廣州510460)

基礎研究

一株球孢白僵菌的形態(tài)及分子生物學鑒定

劉達綜，高慧珊，劉 娜，何潔明，徐樹蘭，鄭常格，呂思行*

(廣州市生物防治站 廣東廣州510460)

利用PDA培養(yǎng)基，對收集自廣東茂名的玉米螟(Pyrausta nubilalis)病原真菌(編號：Bba1菌株)進行分離培養(yǎng)。對Bba1菌株的菌落形態(tài)、產孢結構和分生孢子形態(tài)、大小進行觀察和測量，從形態(tài)學初步鑒定該菌株為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)；同時對Bba1菌株的26s rDNA和rDNA ITS區(qū)域進行序列分析，與NCBI數(shù)據庫中球孢白僵菌的同源性達到99%以上。最終判定來自玉米螟的病原真菌Bba1菌株為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

白僵菌 分離 鑒定

球孢白僵菌是國內外廣泛用于害蟲生物防治的殺蟲真菌之一，被認為是最具開發(fā)潛力的一種昆蟲病原真菌，能侵染15個目149個科的700多種昆蟲和10多種蟬螨。[1]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在分類上屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，叢梗孢目(Moniliales)，叢梗孢科(Moniliaceae)，白僵菌屬(Beauveria)。白僵菌屬的典型特征為產孢細胞(瓶梗狀)常濃密簇生，有時輪生或單生，或直接生在氣生菌絲、稍有分化的分生孢子?；蚺虼蟮呐菽疑希蛐位蚱繝?，下部膨大，反復向頂部軸式產孢，形成膝狀彎曲且具有小齒突的產孢軸。產孢細胞和泡囊常增生，在分生孢子梗及菌絲上聚集成卵狀或球狀的孢子頭。分生孢子透明，壁薄。[2]傳統(tǒng)分類學主要是根據菌株分生孢子和產孢結構判斷菌種，往往受到主觀作用的影響。真菌rDNA具有保守區(qū)域，在菌種分類上具有重要意義。利用rDNA的特性進行分子生物學研究，為菌株種屬判定提供更為客觀的依據。

本研究在Bba1菌株形態(tài)學鑒定基礎上，對菌株26s rDNA和rDNA ITS區(qū)域進行PCR擴增和序列分析，以期使菌種鑒定結果更為準確、科學。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

Bba1為廣州市生物防治站采自廣東茂名的玉米螟病原真菌。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)參照文獻[3-4]的方法配制。

1.3 方法

1.3.1 Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及生長情況的觀察

按照文獻[5]報道的方法觀察記錄菌落形態(tài)特征。每天定時用游標卡尺量出菌落長寬并記錄，分析菌株生長情況，記錄7d。定期在光學顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.3.2 Bba1菌株分生孢子的形態(tài)大小測定

Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至15d時，在無菌條件下，刮取平板上生長的白僵菌菌落，轉移到三角燒瓶中，加入一定量的0.5%吐溫-80無菌水和滅菌玻璃珠，在漩渦振蕩器上充分振蕩使孢子均勻分散，制備成孢子懸浮液。并在顯微鏡下用軟件測定分生孢子的直徑。

1.3.3 Bba1菌株的分子生物學鑒定

在無菌條件下，分別把菌株用接種針接種于液體培養(yǎng)基中，放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d(培養(yǎng)溫度為26℃，濕度為95%)。將液體培養(yǎng)好的菌絲體經濾紙過濾，自然晾干。用材料盒收集置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。方法參考文獻[6]進行菌株總DNA的抽提。根據真菌26s rDNA和 rDNA的ITS區(qū)設計出特異性引物(見表1)對菌株進行檢測。PCR反應體系30μL：ddH2O為12μL；2XMaster Mix為15μL；Primer 1(10μM)為1μL；Primer 2(10μM)為1μL；Template為1μL。引物ITS5/ITS4的反應條件為：96℃預變性5min；接著35個循環(huán)：94℃變性45s，56℃退火溫度40s，72℃延伸40s；72℃后延伸5min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in the study

對Bba1菌株26s rDNA和 rDNA的ITS序列進行克隆、測序，測序結果進行Blast比對分析，利用Clustsl X和MEGA 5軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 Bba1菌株菌落形態(tài)特征

Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)情況如圖1所示，菌落色澤為乳白色。菌落質地為粉狀，菌落薄、中間褶皺、呈放射狀生長。菌落底部無色或淡黃色。在光學顯微鏡下Bba1菌株產孢細胞輪生或單生，分生孢子梗反復向頂部軸式產孢，結果形成膝狀彎曲的具有小齒突的產孢軸。分生孢子梗光滑呈穗狀，分生孢子透明，壁薄且為球形，大小為2.1μm×2.7μm，表面光滑，與球孢白僵菌特點相似。

圖1 Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Bba1 strain on PDA culture medium

Bba1菌株在PDA培養(yǎng)基平板上的生長量如表2所示。Bba1菌株菌落生長特點是從第2d到第4d出現(xiàn)一個高峰，從第5d開始放慢了生長速度，到第7d菌落未覆蓋滿培養(yǎng)基。

表2 Bba1菌株菌落生長量Tab.2 Comparison of colony growth of the Bba1 strain

2.2 Bba1菌株的分子生物學鑒定

提取Bba1菌株基因組DNA為模板，利用引物SF-1/SF-4和ITSs1/ITSs4對26s rDNA和rDNA ITS區(qū)進行PCR擴增，分別得到 630bp和247bp片段。對Bba1菌株DNA模板的PCR檢測結果如圖2所示。

測序結果分析顯示Bba1菌株26s rDNA擴增長度為558bp(GenBank基因登錄號為FJ755242.1)，Bba1 菌株rDNA ITS區(qū)序列擴增長度為247bp(GenBank基因登錄號為HQ722920.1)。將測序得到的兩條序列片段提交到GenBank中分別與已知序列進行對比，用Clustsl X和MEGA 5軟件進行分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3、4看出，該菌株都與球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在一個分支上，其同源性均為99%。通過序列分析，最終確定該菌株為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

圖2兩組引物對Bba1菌株DNA模板的PCR擴增結果Fig.2Bba1 strain PCR amplification results influnced by two sets of primers

圖3 Bba1菌株26s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bba1 strain based on 26s rDNA sequences

圖4 Bba1菌株rDNA ITS區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bba1 strain based on rDNA ITS sequences

3 討 論

球孢白僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌，也是一類重要的環(huán)保型生物防治菌。關于球孢白僵菌的分類一直是眾多學者研究的熱點，單純依靠形態(tài)特征對球孢白僵菌進行分類，很難將與其相近的菌株區(qū)分開。因此在傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的基礎上，利用分子生物學技術可以客觀準確地判定菌株種屬。本研究利用傳統(tǒng)形態(tài)學對Bba1菌株菌落形態(tài)、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)、大小進行測定，同時結合分子生物學方法，分別對rDNA保守區(qū)域 26s rDNA和 rDNA ITS區(qū)域進行擴增，通過測序分析，建立起系統(tǒng)進化樹，進一步證明傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定結果Bba1菌株為球孢白僵菌。Bba1菌株的鑒定為下一步開展球孢白僵菌防治玉米螟制劑的研究及生產應用奠定了基礎。

［1］ 李正躍，張文青. 球孢白僵菌對馬鈴薯塊莖蛾的毒力及其與常用農藥的生物相容性測定[J]. 植物保護，2005，3(31)：57-61.

［2］ 李增智. 白僵菌的分類和鑒定[J]. 中國蟲生真菌研究與應用，1990(2)：89-95.

［3］ 王更生. 中藥材白僵蠶主要生產條件的優(yōu)化及其指紋圖譜的研究[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2006.

［4］ 劉丹，吳淑賢，韓福生，等. 白僵菌對沙棘木蠹蛾幼蟲的致病力及其生物學特性研究[J]. 河北農業(yè)大學學報，2009，2(23)：93-96.

［5］ 劉吉平，呂思行，米紅霞. 生物防治白僵菌與家蠶病原白僵菌的生物學特性初步比較[J]. 蠶業(yè)科學，2011，37(3)：442-448.

［6］ 呂思行，劉吉平，湯歷，等. 兩廣地區(qū)家蠶白僵菌的SSRs遺傳多樣性[J]. 昆蟲學報，2012，55(10)：1142-1148.

Morphological and Molecular Identification of a Beauveria bassiana Strain

LIU Dazong，GAO Huishan，LIU Na，HE Jieming，XU Shulan，ZHENG Changge，LV Sixing*
(Guangzhou Biological Control Station，Guangzhou 510460，Guangdong Province，China)

A strain(No．Bba1)was isolated using PDA culture medium from the muscardine cadaver of Pyrausta nubilalis collected from Maoming in Guangdong Province．In this study，the colony morphology，spore structure，spore shape and size of Bba1 strain were observed and measured，and it was initially identified as Beauveria bassiana．At the same time，its 26s rDNA and rDNA ITS were sequenced and then compared with those of Beauveria bassiana in NCBI database．The results showed the homology was above 99%．Eventually，Bba1 strain was identified as Beauveria bassiana.

Beauveria bassiana；isolation；identification

S884.3

：A

：1006-8945(2015)08-0019-03

*

廣東省重點科研基地建設項目(2012A061300001)；廣東省科技基礎條件建設項目(2013B060500004)；廣州市科技基礎條件平臺建設項目(201509020002)。

2015-07-10