阮文福，段文明，梁杏梅，陳兆霓，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，南寧 530021)

熱烈慶祝中國(guó)藥理學(xué)會(huì)成立30周年！玉郎傘多糖對(duì)藥物性肝損傷小鼠的保護(hù)作用*

阮文福，段文明，梁杏梅，陳兆霓，黃仁彬

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，南寧 530021)

目的 探討玉郎傘多糖對(duì)布洛芬(IBU)致小鼠肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 將昆明種小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，即空白對(duì)照組(NC)，模型對(duì)照組，玉郎傘多糖大(600 mg·kg-1)、中(300 mg·kg-1)、小(150 mg·kg-1)劑量組及聯(lián)苯雙酯組(聯(lián)苯雙酯，150 mg·kg-1)。玉郎傘多糖大、中、小劑量組和聯(lián)苯雙酯組灌胃給予相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥后2 h，除NC組外，其他各組灌胃IBU，200 mg·kg-1，制備小鼠肝損傷模型。造模后禁食不禁水20 h，測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(T-BiL)、堿性磷酸酶(ALP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平；取肝組織行病理學(xué)檢查，觀察肝組織損傷程度。結(jié)果 與模型對(duì)照組比較，玉郎傘多糖各劑量組血清ALP、AST、ALT活性降低，T-BiL及IL-6、TNF-α水平降低；肝組織MDA水平降低，肝勻漿SOD及GSH-Px水平升高(P<0.05)。玉郎傘多糖可減輕肝細(xì)胞損傷程度。結(jié)論 玉郎傘多糖對(duì)IBU所致肝損傷小鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及減少炎癥因子釋放等有關(guān)。

玉郎傘；多糖；布洛芬；保肝作用

由藥物、免疫反應(yīng)、病毒感染及代謝等因素引起的肝細(xì)胞壞死，進(jìn)而導(dǎo)致綜合征即為肝損傷[1]。近年來(lái)，由于藥物聯(lián)合應(yīng)用、濫用以及用藥不當(dāng)?shù)雀鞣N原因?qū)е碌募毙运幬镄愿螕p傷不容小覷。常見(jiàn)致肝損傷的藥物包括非甾體抗炎藥(non-steroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)、腫瘤化學(xué)治療(化療)藥、抗結(jié)核藥以及部分中草藥等[2-4]。NSAIDs被廣泛用于治療風(fēng)濕性疾病和解熱鎮(zhèn)痛，但該類藥物可引起多種不良反應(yīng)，尤其以肝損傷最常見(jiàn)，臨床表現(xiàn)為輕微肝功能異常、嚴(yán)重肝功能衰竭甚至死亡等[3-7]。其中布洛芬多引起肝細(xì)胞變性、壞死等急性肝損傷，臨床則可能出現(xiàn)食欲減退、惡心、疲勞及黃疸等癥狀[6-10]。肝臟是機(jī)體重要的免疫器官，布洛芬引發(fā)肝臟損傷后，募集到肝臟的單核細(xì)胞和肝內(nèi)的Kupffer細(xì)胞將被活化，并成為腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的主要來(lái)源，參與肝損傷過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6 ，IL-6)和 TNF-α水平可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞炎癥程度[2-3]。

玉郎傘是廣西壯族習(xí)用藥材，為蝶形花科植物疏葉崖豆[MillettiapulchraKurzvar.laxior(Dunn)Z.Wei]的干燥塊根，該藥具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血及抗衰老等作用功效[11]。臨床主要用于小兒智力低下、老年健忘及體弱多病癥等的治療[11-14]。其主要活性成分包括多糖、黃酮及皂苷類等，成分較復(fù)雜。本課題組研究人員經(jīng)多年研究，證實(shí)玉郎傘多糖具有調(diào)節(jié)免疫和抗氧化作用，且對(duì)急性化學(xué)性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，但其是否對(duì)布洛芬所致藥物性肝損傷具有保護(hù)作用，筆者尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)中研究玉郎傘多糖對(duì)布洛芬所致藥物性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(桂)2011-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(桂)2011-0005。

1.1.2 藥物與試劑 玉郎傘多糖(Yulangsanpolysaccharide，YLSPS，將玉郎傘50 g加入5倍量95%乙醇回流60 min，將乙醇揮干后加入純化水400 mL煮沸2 h，離心后取上清液醇沉，多糖檢驗(yàn)證實(shí)含量為67.80%，批號(hào)：20130929)，加入純化水配制成YLSPS大劑量(600 mg·kg-1，YLSPSH)，YLSPS中劑量(300 mg·kg-1，YLSPSM)和YLSPS小劑量(150 mg·kg-1， YLSPSL)。布洛芬(ibuprofen，IBU)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：14883)；聯(lián)苯雙酯(biphenyldicarboxylate，BPDC)由北京協(xié)和制藥廠提供(批號(hào)：20120606)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒(批號(hào)：20130409)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒(批號(hào)：20130409)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(批號(hào)：20130904)、總膽紅素(total bilirubin ，T-BiL)試劑盒(批號(hào)：20130904)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號(hào)：20130408)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號(hào)：20130420)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(批號(hào)：20130410)以及考馬斯亮藍(lán)試劑盒(批號(hào)：20130809)均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：722S)，高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL-16G-A)，臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TDL-5)，電子天平(Startorius公司，型號(hào)：BP190S)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-52AA)，三用電熱恒溫水箱(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，型號(hào)：SHH.W21.Cr600)，彩色病理圖文分析系統(tǒng)(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：PTPS-2011)。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備與分組 取健康合格的昆明種小鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，即空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，聯(lián)苯比酯組(BPDC，150 mg·kg-1)和YLSPS小、中、大劑量組(YLSPSL，YLSPSM，YLSPSH)?？瞻讓?duì)照組及模型對(duì)照組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液10 mL·kg-1，其余4組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，10 mL·kg-1，每日一次，連續(xù)2周。末次給藥后2 h，空白對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，10 mL·kg-1，其余各組按相同容量灌胃給予IBU 200 mg·kg-1。禁食不禁水約20 h后，取血及臟器測(cè)定。

1.2.2 血清TNF-α與IL-6水平檢測(cè) 采用ELISA法測(cè)定血清TNF-α與IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定 給予IBU 20 h后小鼠經(jīng)眼球取血，3 000 r·min-1(r=10 cm)離心10 min，分離上層血清，分裝，按各試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清AST(賴氏法)、ALT(賴氏法)、T-BiL(咖啡因比色法)和ALP(鐵氰化鉀比色法)水平。

1.2.4 肝組織生化指標(biāo)測(cè)定 肝組織勻漿的制備：取肝臟右葉，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗以除去積血，干凈濾紙拭凈后稱定質(zhì)量，并加適量預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液，制備成10%肝組織勻漿，4 ℃下3 500 r·min-1離心15 min，取上清液，分裝。蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

MDA、GSH-Px和SOD測(cè)定：肝組織勻漿中MDA(硫代巴比妥酸比色法)、SOD(黃嘌呤氧化酶法)以及GSH-Px(比色法)的水平測(cè)定均按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，組織中蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

病理學(xué)檢查：選取肝右葉相同部位肝組織，置于10%甲醛固定，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡下觀察肝組織損傷程度。參照文獻(xiàn)[12]，肝組織損傷程度可分4級(jí)：0級(jí)(-)，肝組織具備正常結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ級(jí)(+)，肝小葉尚具備正常結(jié)構(gòu)，但渾濁腫脹、氣球樣變或脂肪變性較明顯，也見(jiàn)點(diǎn)狀壞死；Ⅱ級(jí)(++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不甚清晰，可見(jiàn)明顯灶狀壞死并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅲ 級(jí)(+++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見(jiàn)明顯片狀壞死并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2 結(jié)果

2.1 YLSPS對(duì)小鼠血清ALT、AST、ALP與T-BiL水平的影響 模型對(duì)照組小鼠血清ALT、AST和ALP活性及T-BiL含量顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明造模成功。與模型對(duì)照組比較，YLSPS大、中劑量組，以及聯(lián)苯雙酯組小鼠血清ALT、AST和ALP水平以及T-BiL含量明顯降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示大、中劑量YLSPS保護(hù)肝組織活性與聯(lián)苯雙酯藥相當(dāng)。見(jiàn)表1。

2.2 YLSPS對(duì)小鼠肝組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝臟SOD和GSH-Px活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示小鼠急性肝損傷造模成功。YLSPS對(duì)上述變化均有較強(qiáng)阻滯作用。與模型對(duì)照組比較，YLSPS大、中劑量組與聯(lián)苯雙酯組肝組織SOD和GSH-Px活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組MDA上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，聯(lián)苯雙酯組和YLSPS中、大劑量組MDA水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.3 YLSPS對(duì)小鼠血清TNF-α與IL-6含量的影響 見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，聯(lián)苯雙酯組，YLSPS大、中劑量組小鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組小鼠血清ALT、AST、ALP與T-BiL測(cè)定結(jié)果

組別小鼠數(shù)劑量/(mg·kg-1)ALTASTALP(U·L-1)T?BiL/(mg·d-1)空白對(duì)照組10…42．22±9．2254．70±10．92130．78±41．140．48±0．11模型對(duì)照組10…123．79±29．13?1138．84±33．20?1302．21±83．79?12．01±0．55?1聯(lián)苯雙酯組1015063．66±16．57?264．32±16．94?2205．27±67．60?20．64±0．15?2YLSPS 小劑量組10150112．90±27．39119．55±25．24262．49±75．921．84±0．19 中劑量組1030088．81±20．01?294．47±22．54?2240．54±60．89?21．32±0．15?2 大劑量組1060072．78±18．42?271．63±18．33?2177．20±57．21?20．83±0．21?2

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05

表2 6組小鼠肝組織SOD、GSH-Px與MDA水平測(cè)定結(jié)果

±s

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05

表3 6組小鼠血清TNF-α與IL-6測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Analysis results of the serum level of TNF-α and IL-6 in six groups of mice

組別小鼠數(shù)劑量/(mg·kg-1)TNF?αIL?6空白對(duì)照組10…38．46±9．7281．97±23．39模型對(duì)照組10…104．17±32．65?1174．36±37．58?1聯(lián)苯雙酯組1015051．45±12．41?2115．82±28．64?2YLSPLS 小劑量組1015090．93±18．97153．36±26．39 中劑量組1030074．09±15．44?2137．12±32．75?2 大劑量組1060055．74±9．01?2120．26±19．84?2

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05

2.4 肝組織病理學(xué)檢查 空白對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列，肝血竇、肝細(xì)胞索規(guī)則排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死等病理變化。鏡下可見(jiàn)模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞腫脹，小葉中心大片壞死，脂肪樣變明顯，匯管區(qū)及小葉內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。YLSPS小劑量組大片肝細(xì)胞腫脹，小葉中心呈灶狀壞死，肝細(xì)胞明顯脂肪變性，匯管區(qū)及小葉內(nèi)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。YLSPS中、大劑量組肝細(xì)胞壞死、變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度有所減輕，比較其他部位病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)YLSPS中、大劑量有較強(qiáng)的減輕肝組織損傷作用(表4，圖1)。

表4 6組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

Tab.4 Hepatic histopathology of six groups of mice只

3 討論

肝臟是體內(nèi)最大、最主要的代謝器官，外源性和內(nèi)源性化合物代謝等均需要通過(guò)肝臟來(lái)處理，因藥物濫用或多種藥物聯(lián)合使用等均可能引起肝臟損害，即所謂藥物性肝病(drug induced liver disease，DILD)。肝臟疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病[2-3]。在歐美國(guó)家，藥物是導(dǎo)致重癥肝炎的最常見(jiàn)原因，其中以對(duì)乙酰氨基酚等NSAIDs最常見(jiàn)[15]。NSAIDs具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，臨床應(yīng)用也可引起多種不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、胃腸道出血及腎損害等，其對(duì)肝臟的損害也逐漸引起重視[5，16]。近年來(lái)有關(guān)應(yīng)用布洛芬導(dǎo)致重度肝臟損害的報(bào)道越來(lái)越多。但藥物性肝損傷的機(jī)制較復(fù)雜，除藥物本身及其代謝產(chǎn)物能引起中毒性肝損傷外，藥物還能與肝細(xì)胞蛋白質(zhì)等成分結(jié)合形成新抗原，并啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞或體液免疫，導(dǎo)致由免疫介導(dǎo)的肝損傷[2-4]。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.聯(lián)苯雙酯組；D.YLSPS小劑量組；E.YLSPS中劑量組；F.YLSPS大劑量組

A.blank control group; B.model control group; C.biphenyldicarboxylate group; D.low-dose YLSPS group；E.medium-dose YLSPS group；F.high-dose YLSPS group

Fig.1 Strcture of hepatic histopathology in six groups of mice(HE，×100)

本研究結(jié)果顯示，高、中劑量YLSPS能有效降低小鼠血清ALT、AST和ALP活性，且量效關(guān)系明顯，提示YLSPS具有良好的保肝活性[17]。

TNF-α與IL-6大多時(shí)候處于一種高活性狀態(tài)，在肝細(xì)胞自身免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，且肝細(xì)胞損害程度以及病情嚴(yán)重程度與其存在密切聯(lián)系[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，布洛芬致肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯升高。YLSPSH和YLSPSM組小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，YLSPS可能通過(guò)減少炎癥細(xì)胞因子分泌而發(fā)揮護(hù)肝作用。

SOD作為動(dòng)物體內(nèi)非常重要的抗氧化酶系，其作用是清除過(guò)氧化物和自由基，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化物生成且加速其清除，降低其對(duì)細(xì)胞和組織的損傷，有利于抗衰老。GSH-Px是重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，還原性GSH特異性催化過(guò)氧化氫還原反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整的作用。GSH-Px也能催化氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSH)轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)并加速體內(nèi)自由基清除，從而減輕自由基對(duì)生物膜中不飽和脂肪酸的破壞，有效減少肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)自由基的抵御能力。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物，是脂質(zhì)過(guò)氧化自由基反應(yīng)程度的指標(biāo)之一，能間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度和肝細(xì)胞損傷程度。氧自由基損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷是眾多急性藥物性肝損傷的主要作用機(jī)制[8，11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、中劑量YLSPS可以明顯降低布洛芬所致急性肝損傷小鼠肝組織MDA含量，提高肝組織SOD及GSH-Px活性。提示 YLSPS對(duì)藥物性肝損傷的保護(hù)作用可能與抗自由基并且抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.005

Protective Effect ofYulangsanPolysaccharide Against Hepatic Injury in Mice

RUAN Wenfu，DUAN Wenming，LIANG Xingmei，CHEN Zhaoni，HUANG Renbin

(DepartmentofPharmacology，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To investigate the protective effect ofYulangsanpolysacharide (YLSPS) and mechanism against ibuprofen-induced liver injury in mice. Methods The mice were randomly divided into the blank control(NC)， the model control，YLSPS at 150 mg·kg-1， 300 mg·kg-1，600 mg·kg-1groups and biphenyldicarboxylate (150 mg·kg-1BPDC) group.The mice were orally administered with corresponding agents once per day for consecutive 14 days，whereas the blank control group and model control group were orally administered with saline.Except the blank control group， all the other mice were orally administered IBU 200 mg·kg-1body weight 2 h after last lavagedof medicimes. The mice were fasted and watered ad lib for 20 h after model establishment.Activities of ALT，AST and ALP，content of T-BiL，TNF-α，IL-6 in serum；activities of SOD，GSH-Px and content of MDA in liver tissue were detected.The morphological pathology test was used to examine degrees of hepatic injury. Results Compared with the model control， YLSPS could obviously reduce activities of ALT，AST and ALP，content of T-BiL，MDA，TNF-α and IL-6, and increase SOD，GSH-Px and CAT (P<0.05), and then lessen the hepatic injury. Conclusion YLSPS showed potential protective effect against ibuprofen-induced liver injury in mice, the mechanism may be related to attenuating free radical injury and inhibiting lipid peroxidation and lowering release of inflammatory factors.

Yulangsan; Polysaccharide；Ibuprofen；Hepatoprotection

2014-05-22

2014-07-01

*廣西科學(xué)研究與科技開(kāi)發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目(10124008-6)；廣西地方性高發(fā)疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金(KFJJ2010-22)；廣西科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(No.12-97-20)

阮文福(1980-)，男，越南河內(nèi)人，在讀博士，主要研究方向：抗肝炎藥物研究。電話：0771-5339805，E-mail：phucdhy@gmail.com。

黃仁彬(1955-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向：抗病毒性肝炎藥、抗老年性癡呆藥、抗心血管病藥研究。電話：0771-5339805，E-mail：huangrenbin518@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)07-0866-05