張屹　劉建雄　梁志懷　等

摘 要：以20個(gè)不同類型的西瓜品種為試驗(yàn)材料，采用室內(nèi)苗期人工接種鑒定方法和分子標(biāo)記檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)，研究不同西瓜品種對(duì)枯萎病的抗性差異及不同鑒定方法之間的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，人工接種鑒定與分子檢測(cè)方法鑒定結(jié)果基本吻合，CAPS標(biāo)記（7716_fon）可以將西瓜抗、感枯萎病的界限有效定性為病株率70%。

關(guān)鍵詞：西瓜；枯萎??；分子標(biāo)記檢測(cè)；人工接種鑒定

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：1001-3547（2015）12-0050-03

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，F(xiàn)ON）侵染所致的土傳維管束病害，是嚴(yán)重制約西瓜生產(chǎn)的病害之一[1～3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，尖孢鐮刀菌西瓜專化型生理小種有4個(gè)，0、1、2和3，其中，1號(hào)生理小種在我國(guó)致病力最強(qiáng)、存在范圍最廣[4]。因此，以1號(hào)生理小種為病原菌株，開展西瓜品種枯萎病抗性評(píng)價(jià)具有很強(qiáng)的代表性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究者們已對(duì)西瓜枯萎病病菌1號(hào)生理小種的抗病基因（Fon-1）進(jìn)行定位[5～8]，并利用已開發(fā)的分子標(biāo)記開展不同西瓜新品種Fon-1基因的分布調(diào)查，為西瓜新品種抗性鑒定提供了重要的依據(jù)。本文通過(guò)對(duì)20份不同類型西瓜品種進(jìn)行抗枯萎病室內(nèi)人工接種鑒定與分子檢測(cè)分析，以期為西瓜抗病分子育種和抗源篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試西瓜為湖南省西瓜甜瓜研究所引進(jìn)的雜交品種20個(gè)，其中包括有籽西瓜、無(wú)籽西瓜和小果型西瓜3類。

供試病原菌為西瓜枯萎病菌1號(hào)生理小種（FON-1），由北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心西瓜課題組許勇老師惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

①接種鑒定方法 參照耿麗華等[9]報(bào)道的西瓜苗期接種鑒定方法，于2014年5～7月在湖南省西瓜甜瓜研究所基地大棚內(nèi)進(jìn)行。供試西瓜材料按編號(hào)播種于滅菌的沙子中，當(dāng)西瓜幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，置于孢子濃度為5×106個(gè)/mL的西瓜枯萎病病菌懸浮液中接種15 min。每個(gè)品種設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別調(diào)查病株率。

②DNA提取 待接種后7 d進(jìn)行單株取樣，采取CTAB法提取基因組DNA[10]。

③PCR反應(yīng)體系 均采用12 μL，包括1.2 μL 10×Buffer（含 Mg2+），1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL 10 μmol/μL引物，0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，2 μL 30 ng/μL模板DNA，用去離子水補(bǔ)足至12 μL。引物7716_fon為張屹等[8]已發(fā)表的西瓜抗枯萎病基因分子標(biāo)記，由上海生工生物技術(shù)公司合成。

7716_fon引物序列為：5'-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3'，5'-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯萎病抗性分析

用中國(guó)西瓜主產(chǎn)區(qū)當(dāng)前分布最廣的尖孢鐮刀菌西瓜?；?號(hào)生理小種（FON-1）對(duì)供試的20個(gè)西瓜品種進(jìn)行苗期枯萎病接種鑒定，結(jié)果表明（表1），20個(gè)品種對(duì)枯萎病表現(xiàn)出不同抗性。其中，9個(gè)品種表現(xiàn)為高抗（HR，枯萎病病株率0～20%），占總數(shù)的45%；2個(gè)品種表現(xiàn)為中抗（MR，枯萎病病株率21%～50%），占總數(shù)的10%；5個(gè)品種表現(xiàn)為輕抗（LR，枯萎病株率51%～80%），占總數(shù)的25%；而表現(xiàn)為感病（S，枯萎病病株率80%以上）的品種有4個(gè)，占總數(shù)的20%。

2.2 抗病基因分子檢測(cè)

利用CAPS標(biāo)記7716_fon對(duì)20個(gè)西瓜品種Fon-1基因進(jìn)行分子檢測(cè)。結(jié)果表明（圖1），有12個(gè)品種能擴(kuò)增出170 bp的特異帶，基因型鑒定表現(xiàn)為抗枯萎病品種；8個(gè)品種僅能擴(kuò)增出104 bp的特異帶，基因型鑒定表現(xiàn)為感枯萎病品種。

2.3 田間枯萎病接種鑒定與分子鑒定結(jié)果比對(duì)

利用國(guó)內(nèi)西瓜枯萎病病菌優(yōu)勢(shì)小種對(duì)引進(jìn)的20個(gè)西瓜品種進(jìn)行抗性鑒定及分子檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，結(jié)果顯示（表1、圖1），CAPS標(biāo)記7716_fon可以有效區(qū)分抗、感枯萎病材料，其結(jié)果與抗性鑒定結(jié)果吻合，并將病株率70%定性為感抗界限。

3 討論與結(jié)論

西瓜抗枯萎病育種工作早在1902年即開展，第一個(gè)抗病品種Conqueror是通過(guò)對(duì)枸櫞西瓜的抗性轉(zhuǎn)育育成，此后，Calhoun Gray、Jubilee、Crimson Sweet、Summit、Smokylee等抗病性強(qiáng)的品種相繼問(wèn)世[11]。近年來(lái)，隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的迅速推廣，連作障礙成為西瓜生產(chǎn)的主要制約因子。因此，西瓜育種家把抗枯萎病作為了最重要的選育性狀之一。本研究中所引進(jìn)的品種包括了5個(gè)無(wú)籽西瓜、11個(gè)有籽西瓜和4個(gè)小果型西瓜品種。通過(guò)枯萎病苗期接種鑒定發(fā)現(xiàn)，4個(gè)小果型西瓜品種均感枯萎??；無(wú)籽西瓜中1個(gè)表現(xiàn)為高抗、1個(gè)表現(xiàn)為中抗、3個(gè)表現(xiàn)為輕抗；而有籽西瓜中8個(gè)表現(xiàn)為高抗、1個(gè)表現(xiàn)為中抗、2個(gè)表現(xiàn)為輕抗。不同類型的西瓜品種抗性差異明顯，推測(cè)原因是，現(xiàn)今小果型西瓜品質(zhì)與枯萎病性狀并存的抗性親本材料依然偏少，未能在育種中得到很好的運(yùn)用。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)優(yōu)良性狀基因進(jìn)行聚合，選育優(yōu)良性狀材料是重要的趨勢(shì)。

張國(guó)良等[12]研究指出，西瓜枯萎病抗性遺傳可能受多基因控制，不同資源材料其抗病基因可能各不相同。隨著西瓜全基因組信息的公布[13]，西瓜在進(jìn)化過(guò)程中也丟失了部分抗病基因。本研究利用與西瓜枯萎病抗性基因（Fon-1）緊密連鎖的CAPS標(biāo)記7716_fon進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與苗期接種鑒定結(jié)果吻合，而且以病株率70%為界限對(duì)抗、感枯萎病進(jìn)行了有效區(qū)分。但是，7716_fon能檢測(cè)含有Fon-1基因的品種對(duì)病原菌表現(xiàn)的抗病性程度差異，我們初步認(rèn)為是由于西瓜的抗源不同，導(dǎo)致與其相關(guān)聯(lián)的生長(zhǎng)勢(shì)、生物量存在差異，進(jìn)而影響其抗性反應(yīng)表現(xiàn)。本研究首次利用分子標(biāo)記對(duì)西瓜枯萎病發(fā)病率進(jìn)行了定性分析，并將病株率70%定義為感抗界限，可以加快西瓜抗性育種的進(jìn)程，為快速進(jìn)行栽培品種的抗性分子改良提供了一條有效的技術(shù)途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐潤(rùn)芳，楊鼎新.我國(guó)西瓜抗枯萎病育種的進(jìn)展與前景[J]. 中國(guó)西瓜甜瓜，1992（1）：2-5.

[2] 周鳳珍，康國(guó)斌.西瓜部分抗枯萎病材料的抗性遺傳研究[J].中國(guó)西瓜甜瓜，1996（2）：17-18.

[3] Zhang Z G， Zhang J Y， Wang Y C， et al. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil[J]. FEMS Microbiol Lett， 2005， 249（1）： 39-47.

[4] 張興平，王鳴.我國(guó)西瓜枯萎病生理小種分化研究初報(bào)[J].中國(guó)西瓜甜瓜，1991（1）：39-43.

[5] Xu Y， Ou Y X， Zhang H Y， et al. Identification of a RAPD marker linked to Fusarium wilt resistant gene in wild watermelon germplasm （Citrullus lanatus var. citroides） [J]. Acta Botanica Sinica， 1999， 41（9）： 952-955.

[6] 許勇，張海英，康國(guó)斌，等.西瓜抗枯萎病育種分子標(biāo)記輔助選擇的研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2000，27（2）：151-157.

[7] Leigh K， Fenny D. Draft of RAPD map of watermelon[J]. American Society for Horticultural Science， 2001， 126（3）：344-350.

[8] 張屹，張海英，郭紹貴，等.西瓜枯萎病菌生理小種1抗性基因連鎖標(biāo)記開發(fā)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（10）：

2 085-2 093.

[9] 耿麗華，郭紹貴，呂桂云，等.西瓜枯萎病菌生理小種鑒定技術(shù)體系的建立和驗(yàn)證[J].中國(guó)蔬菜，2010（20）：52-56.

[10] Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research， 1980， 8（19）： 4 321-4 325.

[11] 張屹，魏林，許勇，等.西瓜枯萎病的研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（5）：67-70.

[12] 張國(guó)良，王春生，楊坤，等.西瓜枯萎病抗性材料的轉(zhuǎn)育及其遺傳規(guī)律的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，27（6）：616-618.

[13] Guo S G， Zhang J G， Sun H H， et al. The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus） and resequencing of 20 diverse accessions[J]. Nature Genetics， 2012， 45： 51-58.