王 艷 卞 良 劉晴晴 熊 鷹 李澤陽 龍健兒

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系 上海 200032)

STAT3在新型腸道病毒71型(EV71)感染和復(fù)制中的作用初步研究

王 艷 卞 良 劉晴晴 熊 鷹 李澤陽 龍健兒△

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系 上海 200032)

目的 研究STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)對新型腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及復(fù)制的影響。方法 觀察EV71感染橫紋肌肉瘤細(xì)胞后STAT3的動態(tài)表達;利用慢病毒載體下調(diào)或過表達STAT3技術(shù),觀察細(xì)胞在改變STAT3表達后,對EV71感染細(xì)胞后病毒VP1表達、形成蝕斑和病毒滴度的影響,研究STAT3對EV71感染和復(fù)制的影響。結(jié)果 EV71感染可明顯下調(diào)細(xì)胞STAT3-Tyr705磷酸化(p-STAT3)水平。在STAT3表達穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞中,p-STAT3水平也下調(diào),這有利于EV71病毒感染和復(fù)制。而過表達STAT3的細(xì)胞內(nèi),p-STAT3水平也上調(diào),對EV71感染和復(fù)制的效應(yīng)與上述STAT3下調(diào)的結(jié)果相反。免疫共聚焦和蝕斑分析發(fā)現(xiàn)高表達p-STAT3的細(xì)胞不易被EV71感染。結(jié)論EV71感染可明顯下調(diào)p-STAT3水平,并促進病毒的復(fù)制。STAT3影響EV71的感染和復(fù)制,可能主要通過STAT3的磷酸化水平影響細(xì)胞對病毒的易感性。

EV71; STAT3; 橫紋肌肉瘤細(xì)胞

腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是導(dǎo)致嬰幼兒手足口病及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的主要病原體,目前尚無有效的疫苗和特異性抗病毒藥物[1-5]。因此,加強EV71與宿主相互作用的基礎(chǔ)研究顯得非常重要。研究表明,EV71感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)和細(xì)胞凋亡可能與其導(dǎo)致神經(jīng)性重癥相關(guān)[1-2,6]。EV71誘生一些致炎癥因子,如COX2、VCAM-1、TNF-α等通過激活C-Src(sarcoma kinase)、PDGFR (platelet-derived growth factor)、EGFR、PI3K/AKT、MAPK和NF-κB等信號通路[7-10]來表達;而PDGFR,EGFR,PI3K/AKT,NF-κB等分子可能與STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)分子在信號傳遞的多個層次上相互作用,形成正向或反向、直接或反饋的調(diào)控[11-14]。STAT3還能拮抗STAT1、STAT4等介導(dǎo)的Th1型細(xì)胞因子(如IL-12,IFN-γ)的釋放,調(diào)節(jié)Treg、Th1、Th17等輔助T細(xì)胞的發(fā)育和分化等[13,15-16]。此外,STAT3可通過Fas、BCL-XL及BCL-2等基因參與細(xì)胞凋亡過程[11]。因此,作為中軸性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,STAT3在病毒感染、細(xì)胞免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長發(fā)育和凋亡等多個環(huán)節(jié)起著重要的調(diào)節(jié)作用。

然而,STAT3在病毒感染和復(fù)制中的作用尚不明確,有研究表明STAT3影響多種病毒的感染和復(fù)制,如SARS-CoV、VZV、HCV和HBV等[17-20]。研究發(fā)現(xiàn),pY705-STAT3 (p-STAT3)在VZV、HCV和HBV等病毒感染后上調(diào),并促進上述病毒的復(fù)制。而在Vero E6細(xì)胞中,p-STAT3在SARS-CoV感染后下調(diào);在B細(xì)胞中,低水平的p-STAT3有利于激活EBV裂解細(xì)胞[21]。顯然STAT3對病毒感染和復(fù)制的影響是一個病毒特異性生物學(xué)過程。至于STAT3是否在EV71的感染和復(fù)制中發(fā)揮重要作用目前并不清楚。因此,本研究擬通過觀察EV71感染細(xì)胞后STAT3的動態(tài)變化,構(gòu)建過表達STAT3細(xì)胞株及STAT3穩(wěn)定沉默細(xì)胞株,以研究STAT3對EV71感染和復(fù)制的影響。

材 料 和 方 法

材料和試劑 EV71病毒株(Genbank Access No.HQ891927,064-Shanghai)由本實驗室分離并保存[22]。橫紋肌肉瘤(rhabdomysarcoma,RD)細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫。慢病毒過表達載體pCDH-puro和基因沉默載體pLKO.1-puro系統(tǒng)分別為美國SBI和Addgene公司產(chǎn)品。

構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)或過表達STAT3的RD細(xì)胞 為構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)STAT3表達細(xì)胞,通過設(shè)計與人類STAT3 mRNA (NM_139276.2) 1 578～1 598位點靶向結(jié)合的短發(fā)卡RNA(short hairpin,shRNA)。將shRNA克隆入慢病毒載體pLKO.1,與病毒包裝質(zhì)粒pspAX2,pMD2.G共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞,包裝有感染性的病毒。用包裝好的慢病毒感染RD細(xì)胞,通過嘌呤霉素(2 μg/mL)篩選穩(wěn)定整合慢病毒的細(xì)胞株RD-pLKO.1-shSTAT3。提取細(xì)胞基因組DNA經(jīng)PCR進一步確認(rèn)病毒整合情況。為構(gòu)建過表達STAT3細(xì)胞,將STAT3 cDNA (位于133～2 396,NM_213662)克隆入慢病毒載體pCDH-puro中,按照上述類似方法包裝有感染性的慢病毒,然后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株(RD-pCDH-STAT3-puro)。同時分別構(gòu)建和篩選整合陰性對照慢病毒載體pLKO.1-SCR及pCDH-puro的RD細(xì)胞作為對照。

免疫熒光染色 為確定STAT3對病毒感染的作用,將上述整合不同慢病毒的RD細(xì)胞接種于6孔板(6×105/孔),孵育24 h后感染EV71 (MOI=1.0 PFU/細(xì)胞)。2 h后棄去病毒上清,重新加入2 mL新鮮培養(yǎng)基。感染后6 h,細(xì)胞經(jīng)4%甲醛固定、甲醇穿透之后與VP1單抗(1∶1 000稀釋)和山羊抗鼠IgG-DyLight 594(1∶500稀釋)反應(yīng)。最后用DAPI染色,在EVOS F1熒光顯微鏡下觀察;或同時以p-STAT3單抗(1∶100稀釋)和山羊抗兔IgG-Alexa FluorTM488染色。最后經(jīng)DAPI著染,細(xì)胞免疫熒光經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察。

MTT法檢測細(xì)胞存活力 為確定STAT3表達改變后EV71感染如何影響細(xì)胞存活力,將整合不同慢病毒的RD細(xì)胞接種在96孔板(2×104/孔)中,孵育24h后,EV71以不同的MOI感染細(xì)胞(從MOI=10 PFU/細(xì)胞開始2倍連續(xù)稀釋)。細(xì)胞孵育24～72 h后,隨后加入MTT(10 μL/孔)反應(yīng)4 h,再加入DMSO (200 μL/孔)于37 ℃裂解15 min,并測定細(xì)胞570 nm處的吸光度(D)值。病毒感染后細(xì)胞的存活力百分?jǐn)?shù)以DEV71-infected/Dcell control×100%表示。

EV71蝕斑形成分析 將RD細(xì)胞接種于6孔板(1×106/孔),孵育24 h。之后EV71按梯度稀釋感染RD細(xì)胞2 h,棄去病毒上清后用PBS洗3遍,然后用2 mL含2% FBS及0.5%低熔點瓊脂糖的新鮮培養(yǎng)基覆蓋并孵育72 h。用0.1%的中性紅染色4～6 h后觀察蝕斑形成情況。為確定STAT3對EV71形成蝕斑能力的影響,將整合不同慢病毒的RD細(xì)胞分別接種于6孔板,然后用相同病毒儲存液(經(jīng)正常RD細(xì)胞測定后病毒滴度為4.8×107PFU/mL)經(jīng)指定倍數(shù)稀釋,分別用0.5 mL病毒稀釋液感染不同細(xì)胞2 h,按上述方法檢測EV71在不同細(xì)胞上形成蝕斑的數(shù)量和大小。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 不同組間的數(shù)據(jù)使用Student′st檢驗進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.0軟件進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

EV71對STAT3表達的影響 EV71感染細(xì)胞后30和45 min,STAT3磷酸化(p-STAT3)水平分別下調(diào)1.86和3.14倍,并長時間持續(xù)下降(圖1A)。而總STAT3的表達在EV71感染后無顯著變化(圖1B)。結(jié)果表明EV71感染可迅速下調(diào)p-STAT3的水平,而對總STAT3的表達無顯著影響。

p-STAT3與EV71感染的關(guān)系 為研究p-STAT3與EV71感染的關(guān)系,我們利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)在EV71感染早期(6 h,MOI=1 PFU/細(xì)胞),高水平p-STAT3表達的細(xì)胞(強綠色熒光)通常不易被EV71感染、幾乎看不到VP1染色信號(紅色熒光);而被EV71感染,VP1染色信號強的細(xì)胞,其p-STAT3的水平通常較低(圖2)。提示細(xì)胞高表達p-STAT3可能抑制了EV71的感染。

下調(diào)STAT3可促進EV71的感染和復(fù)制 為確定STAT3及p-STAT3在EV71感染和復(fù)制中的作用,我們采用shRNA下調(diào)STAT3和p-STAT3的方法,通過構(gòu)建相應(yīng)的慢病毒載體、篩選穩(wěn)定下調(diào)STAT3的細(xì)胞株RD-pLKO.1-shSTAT3(圖3A)。在穩(wěn)定細(xì)胞株中,STAT3 mRNA、總STAT3及p-STAT3與對照細(xì)胞株RD-pLKO.1-SCR相比均明顯下調(diào)(圖3B)。在EV71感染后的8 h,免疫熒光染色顯示RD-pLKO.1-shSTAT3細(xì)胞中VP1信號高于對照組RD-pLKO.1-SCR細(xì)胞(圖3C)。EV71在不同MOI條件下感染細(xì)胞,細(xì)胞存活力隨MOI的增加而下降,RD-pLKO.1-shSTAT3細(xì)胞存活力較對照RD-pLKO.1-SCR細(xì)胞下降更快,并且下降的幅度隨著病毒感染時間延長至42～72 h而更為明顯(圖3D)。比較兩種細(xì)胞EV71蝕斑形成情況,結(jié)果顯示RD-pLKO.1-shSTAT3細(xì)胞形成的蝕斑大于對照組RD-pLKO.1-SCR細(xì)胞,且邊緣較清晰;形成的蝕斑數(shù)量在等量病毒、相同感染時段較對照組增加2.92倍(圖3E)。提示下調(diào)STAT3和p-STAT3水平使細(xì)胞對EV71更敏感,顯著恢復(fù)了RD細(xì)胞由于整合pLKO.1慢病毒載體后而喪失的部分對EV71的敏感性(病毒儲存液在RD-pLKO.1-SCR上形成的蝕斑數(shù)明顯少于正常RD細(xì)胞,結(jié)果未統(tǒng)計)。觀察EV71感染RD-pLKO.1-shSTAT3細(xì)胞后病毒的復(fù)制情況,結(jié)果顯示在感染后8～24 h,EV71 VP1在RD-pLKO.1-shSTAT3細(xì)胞中的表達與對照相比,可更早地檢測到,且表達量明顯更高(圖3F),同時上清液中病毒滴度在感染后4～24 h均明顯高于對照組(P<0.05,圖3G)。上述結(jié)果提示下調(diào)STAT3和p-STAT3水平可增加細(xì)胞對EV71的易感性,進而促進病毒的感染和復(fù)制。

圖1 EV71感染RD細(xì)胞后p-STAT3和STAT3的表達Fig 1 Expressions of p-STAT3 and STAT3 after EV71 infected RD cells

圖2 免疫熒光染色觀察EV71感染細(xì)胞后VP1和p-STAT3的表達(×200)Fig 2 Immunofluorescence staining of VP1 and p-STAT3 in cells after EV71 infection (×200)

過表達STAT3抑制EV71的感染和復(fù)制 為進一步確認(rèn)STAT3對病毒感染的作用,將STAT3基因克隆并包裝進入慢病毒載體pCDH-STAT3-puro,進而篩選穩(wěn)定表達的細(xì)胞株RD-pCDH-STAT3-puro(圖4A)。在穩(wěn)定細(xì)胞株中,STAT3 mRNA上調(diào)了3.68倍,總STAT3和p-STAT3較對照組RD-pCDH-puro分別上調(diào)了2.41倍和1.97倍(圖4B)。利用此RD-pCDH-STAT3-puro細(xì)胞檢測過表達STAT3對EV71感染和復(fù)制的影響:在EV71感染細(xì)胞后8h,免疫熒光染色初步顯示RD-pCDH-STAT3-puro細(xì)胞中VP1信號弱于對照組RD-pCDH-puro細(xì)胞(圖4C);病毒以不同的MOI復(fù)數(shù)感染細(xì)胞之后,隨著MOI的增加,RD-pCDH-STAT3-puro和對照組RD-pCDH-puro細(xì)胞的存活力均明顯下降,但RD-pCDH-STAT3-puro較對照組下降更慢。當(dāng)病毒感染至48 h時,RD-pCDH-STAT3-puro細(xì)胞存活力比對照組下降的幅度也更小(圖4D)。比較EV71感染兩種細(xì)胞株的蝕斑形成情況,發(fā)現(xiàn)等量病毒在相同的感染時間內(nèi),RD-pCDH-STAT3-puro細(xì)胞形成的蝕斑數(shù)量約為對照組RD-pCDH-puro細(xì)胞的81%(圖4E)。觀察EV71的復(fù)制情況,發(fā)現(xiàn)RD-pCDH-STAT3-puro細(xì)胞中EV71 VP1的表達在感染后8～24 h低于對照組(圖4F),且上清中病毒滴度在感染后8～24 h也明顯低于對照組(P<0.05,圖4G)。上述結(jié)果說明,過表達STAT3和高水平的p-STAT3降低了細(xì)胞對EV71的易感性,并不利于EV71的感染和復(fù)制。

討 論

STAT3可影響多種病毒的復(fù)制過程,有研究顯示HCV核心蛋白可直接與STAT3相互作用并激活STAT3。研究發(fā)現(xiàn)在HCV復(fù)制時STAT3被持續(xù)地磷酸化,且STAT3的活化可顯著促進HCV的復(fù)制。由于STAT3是轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)STAT3可能通過正向調(diào)控微管動力蛋白而影響HCV的復(fù)制過程[19]。HBV的X蛋白(HBx)在病毒復(fù)制及誘導(dǎo)肝細(xì)胞腫瘤過程中發(fā)揮重要作用。Waris等[20]發(fā)現(xiàn),HBx可與線粒體結(jié)合并誘導(dǎo)一些轉(zhuǎn)錄因子(如STAT3和NF-κB活化)。另有研究發(fā)現(xiàn),帶狀皰疹病毒感染可導(dǎo)致細(xì)胞STAT3的磷酸化,而磷酸化抑制劑可抑制體外VZV的復(fù)制,顯著減小由VZV感染導(dǎo)致的皮膚損傷[18]。

圖3 STAT-3表達下調(diào)促進EV71的感染和復(fù)制Fig 3 STAT-3 knock-down stimulated EV71 infection

圖4 STAT-3過表達抑制EV71的感染和復(fù)制Fig 4 STAT-3 overexpression inhibited EV71 infection

STAT3在病毒復(fù)制中的作用十分復(fù)雜,如p-STAT3在上述病毒如HCV、HBV和VZV感染后上調(diào),并促進病毒的復(fù)制,而在Vero E6細(xì)胞中p-STAT3在SARS-CoV感染后下調(diào)[17],這與本研究EV71感染后使細(xì)胞p-STAT3下調(diào)類似。此外,在B細(xì)胞中低水平的p-STAT3有利于激活EBV裂解細(xì)胞[21],而IL-6誘導(dǎo)的STAT-3磷酸化和入核過程也被人偏肺病毒(human metapneumovirus)感染所抑制[23]。顯然,宿主細(xì)胞STAT3影響病毒復(fù)制是一個對病毒特異的應(yīng)答過程。

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了STAT3與EV71的感染和復(fù)制有關(guān)。EV71感染可以明顯抑制STAT3的磷酸化,而高水平p-STAT3抑制了EV71的感染。下調(diào)STAT3可以促進病毒增殖,而過表達STAT3則抑制病毒復(fù)制。結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察EV71感染細(xì)胞早期p-STAT3和VP1的分布及等量病毒在相同感染時間內(nèi)形成的蝕斑,提示細(xì)胞STAT3影響EV71感染和復(fù)制可能主要通過p-STAT3水平來影響細(xì)胞對EV71的敏感性,進而影響EV71的復(fù)制。至于STAT-3影響EV71感染和復(fù)制的分子機制,以及EV71又如何下調(diào)宿主細(xì)胞p-STAT3水平而拮抗細(xì)胞的抗病毒能力,尚需進一步研究。明確STAT3和EV71感染和復(fù)制的關(guān)系有利于加深對EV71致病機制的理解,并為研究抗EV71感染藥物提供線索。

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Effects of STAT3 on enterovirus 71 (EV71) infection and replication

WANG Yan, BIAN Liang, LIU Qing-qing, XIONG Ying, LI Ze-yang, LONG Jian-er△

(LaboratoryofMedicalMicrobiology,DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai,200032,China)

Objective To identify the roles of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in enterovirus 71 (EV71) infection and replication. Methods According to the observations of the kinetics of STAT3 in rhabdomysarcoma (RD) cells after EV71 infection,and the detection of the effects of loss-and gain-of-function of STAT3 (by knocked-in a short-hairpin RNA or a STAT3 gene into the cellular genome with a lentivirus vector,respectively) on the expression of EV71 VP1,virus plaque-forming,and virus titer after EV71 infection,we evaluated host STAT3 roles in EV71 infection and replication. Results The level of phosphorylated STAT3-Tyr705(pY705-STAT3) was down-regulated significantly after EV71 infection.In the RD cells knocked-down STAT3,p-STAT3 was also down-regulated.The knock-down of STAT3 promoted EV71 infection and replication.By contrast,over-expression of STAT3 showed the opposite effects on EV71 infection.Confocal microscopy analysis and plaque-forming assay indicated that high level of p-STAT3 decreased the cellular susceptibility to EV71 infection. Conclusions Our data indicated that host STAT3 has an important role in EV71 infection and replication,which may be induced by the doen-regulation of phosphorylated p-STAT3 level.Therefore,EV71 infection increased the cellular susceptibility to the virus and promoted the viral replication.

EV71; STAT3; rhabdomysarcoma cell

國家傳染病重大專項 (2012ZX10004503-003); 國家自然科學(xué)基金基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)項目(J1210041); 上海市自然科學(xué)基金(09411964500)

R 738.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.004

2014-08-17;編輯:張秀峰)

△Corresponding author E-mail:longjianer@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Science and Technology Major Project on Infectious Diseases (2012ZX10004503-003),Basic Science Youth Training Program of National Science Foundation of China (J1210041),and the Shanghai Science and Technology Fund (09411964500).