魏 蕾 孫 穎 馬莉莉 紀宗斐 張卓君 戴曉敏 吳萬龍 岳 濤 朱 琦 沈 杰 姜林娣△

(1復旦大學附屬中山醫(yī)院風濕免疫科 上海 200032; 2上海光華中西醫(yī)結合醫(yī)院類風關內(nèi)科 上海 200052)

輔助T細胞多巴胺受體(DR)表達對類風濕關節(jié)炎(RA)患者疾病活動度的影響

魏 蕾1▲孫 穎1▲馬莉莉1紀宗斐1張卓君1戴曉敏1吳萬龍1岳 濤2朱 琦2沈 杰2姜林娣1△

(1復旦大學附屬中山醫(yī)院風濕免疫科 上海 200032;2上海光華中西醫(yī)結合醫(yī)院類風關內(nèi)科 上海 200052)

目的 檢測類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血輔助T淋巴細胞(T helper cells,Th cells)不同亞群細胞膜表面多巴胺受體(dopamine receptor,DR)水平,分析其與疾病活動度、實驗室指標及功能狀態(tài)之間的關系。方法 選取25位初診或3個月內(nèi)未接受DMARDs治療的RA患者(DAS28>3.2),12位健康對照及13位同期年齡匹配的骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者。采用流式細胞術檢測患者外周血Th細胞亞群表面DR1～DR5的表達情況,分析Th細胞DR表達水平與人口學資料、實驗室檢查、功能狀態(tài)及疾病活動度之間的相關性。結果 RA組Th2細胞百分比為1.28%(0.74%～2.68%),較健康對照組(中位數(shù)0.18%,四分位數(shù)間距0.11%～0.31%,P<0.001)及OA組(中位數(shù)0.48%,四分位數(shù)間距0.03%～1.47%,P=0.029)明顯升高。RA組Th2細胞DR2表達水平為25.40%(四分位數(shù)間距3.79%～37.10%),明顯高于健康對照組(中位數(shù)3.74%,四分位數(shù)間距0.00%～12.98%,P=0.006)及OA組(中位數(shù)3.45%,四分位數(shù)間距0.00%～20.55%,P=0.040)。RA組Th2細胞DR4表達量也高于健康對照組和OA組(健康對照組vs.RA組,P=0.022;OA組vs.組,P=0.010)。Th2細胞與關節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count,SJC)和簡化疾病活動指數(shù)(SDAI)呈正相關(分別為r=0.421,P=0.036;r=0.396,P=0.050)。Th1細胞DR5百分比分別為2.22% (四分位數(shù)間距0.57%～12.24%)與SJC及臨床疾病活動指數(shù)(CDAI)呈正相關(分別為r=0.492,P=0.012;r=0.445,P=0.026)。Th2細胞DR1和DR3百分比分別為11.15%(四分位數(shù)間距2.93%～36.20%)、9.80%(1.62%～23.05%),均與健康評估問卷(Health Assessment Questionnaire,HAQ)評分呈負相關(分別為r=-0.469,P=0.018;r=-0.464,P=0.019)。結論 RA患者Th2細胞多巴胺受體DR2和DR4明顯升高,Th細胞DR水平與RA患者SJC、CDAI及HAQ存在相關性。

類風濕關節(jié)炎(RA); 輔助T細胞; 多巴胺受體; 疾病活動度

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以四肢小關節(jié)為主的慢性炎癥性、進展性疾病,環(huán)境、遺傳以及兩者交互作用在RA發(fā)病中起重要作用,但其確切發(fā)病機制目前尚不明確。近年來發(fā)現(xiàn),多巴胺與免疫系統(tǒng)的關系十分密切:在多發(fā)性硬化以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型的腦組織中[1],以及RA患者滑液[2]和炎癥性腸病患者結腸黏膜炎癥組織中[3],均發(fā)現(xiàn)多巴胺含量異常;流行病學調查顯示,RA合并精神分裂癥的患病率僅為0.09%[4],明顯低于人群中RA的患病率。因此,關于多巴胺調節(jié)免疫系統(tǒng)的基礎研究可能是對現(xiàn)有發(fā)病機制的重要補充。

多巴胺受體(dopamine receptor,DR)屬于七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體,包括DR1～DR5在內(nèi)的5種亞型,根據(jù)其結構和藥理學特點的不同分為2類,即D1樣受體和D2樣受體。D1樣受體包括DR1和DR5受體,D2樣受體包括DR2、DR3、DR4受體,D1樣受體和D2樣受體分別激活Gas和Gai亞單位,相應引起腺苷酸環(huán)化酶的活化或抑制,最終催化ATP變成cAMP的含量升高或減少,進一步引起下游信號通路的改變。本文將RA患者外周血輔助T細胞(T helper cells,Th cells)亞群DR水平與疾病活動度、功能狀態(tài)以及血清學指標做相關性研究,探索DR在RA中的作用。

材 料 和 方 法

研究對象 2013年7月至2014年4月就診于復旦大學附屬中山醫(yī)院風濕免疫科門診和上海光華中西醫(yī)結合醫(yī)院門診RA患者共25人。入選標準:(1)符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的分類標準;(2)初發(fā)未使用改善病情的抗風濕藥物(disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)藥物或近3個月內(nèi)未使用DMARDs治療;(3)疾病處于活動期(DAS28-CRP>3.2)。排除標準包括:(1)高血壓、冠心病等心血管疾病;(2)甲狀腺功能亢進、糖尿病等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病;(3)惡性腫瘤;(4)急、慢性感染;(5)近期有明顯應激事件發(fā)生;(6)使用各種可能影響交感神經(jīng)系統(tǒng)的藥物;(7)神經(jīng)精神障礙,包括精神分裂癥、帕金森病、抑郁癥等。同期復旦大學附屬中山醫(yī)院骨科病房接受膝關節(jié)置換術的原發(fā)性膝骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者13名以及健康志愿者12名為對照,膝骨關節(jié)炎診斷符合1986年美國風濕病學會公布的膝骨關節(jié)炎修訂標準。對照均滿足排除標準。

主要試劑 兔抗人DR D1、D3、D4、D5多克隆抗體(德國Merk Millipore公司),D2(美國LifeSpan BioSciences公司)。APC-H7 標記的CD4 (Cod.560158,clone RPA-T4)、APC標記的IFN-γ (Cod.551385,clone 4S.B3)、PerCP-CyTM5.5 標記的IL-4 (Cod.561234,clone 8D4-8)、PE conjugated IL-17A(Cod.560436,clone SCPL1362) 鼠抗人單克隆(lgG1-κ)流式抗體及其同型對照抗體(美國Becton Dickinson公司)。佛波酯(phorbolmyristate acetate,PMA)、離子霉素(ionomycin)以及蛋白轉運抑制劑布雷菲德菌素A(brefeldin A)、染色緩沖液以及固定破膜劑(美國Becton Dickinson公司)。淋巴細胞分離液、二甲亞砜(DMSO)、CF405 M標記羊抗兔抗體、青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)。1640培養(yǎng)液(RPMI-1640)、滅活胎牛血清(FBS) (美國GibcoBre公司),兔lgG抗體(美國 Santa Cruz公司)。

臨床評估 記錄RA患者、骨OA患者以及健康志愿者一般資料,RA患者臨床評估包括:28關節(jié)關節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count,TJC)、關節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count,SJC)、疼痛評分、患者總體評分(patient global score,PGA)和醫(yī)生總體評分(evaluator global test,EGA)均用100 mm視覺模擬量表(visual analog scale,VAS)、血沉(魏氏法),C反應蛋白(CRP)、類風濕因子(rheumatoid factor,RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗CCP抗體)。疾病活動度根據(jù)DAS28-CRP、簡化疾病活動指數(shù)(SDAI)和臨床疾病活動指數(shù)(CDAI)公式進行評分,公式分別為:DAS28-CRP=0.56×sqrt(TJC28)+0.28×sqrt(SJC28)+0.36×ln[CRP(mg/L)+1]+0.014×PGA(mm)+0.96;其中sqrt是開平方根,ln是取自然對數(shù),TJC28代表28個關節(jié)壓痛數(shù),SJC28代表28個關節(jié)壓痛數(shù)[5]。CDAI=SJC+TJC+PGA(cm)+EGA(cm)[6];SDAI=SJC+TJC+PGA(cm)+EGA(cm)+CRP(mg/dL)[7]。

實驗方法

分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs) 抽取清晨空腹肘靜脈血10 mL,EDTA抗凝,423×g離心10 min后上層血漿凍存于-80 ℃冰箱保存,下層細胞用Ficoll密度梯度離心法800×g離心20 min分離PBMC,調整細胞終濃度至1×106/mL,凍存于含有10%DMSO的FBS凍存液中,置于程序降溫盒于-80 ℃保存。

細胞復蘇與刺激 凍存管在37 ℃水浴中迅速搖晃解凍,1～2 min融化后,423×g離心10 min,棄上清,用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細胞,臺盼藍染色,計算細胞存活率(>90%)。調整細胞濃度(終濃度為1×106/mL),接種于24孔板中,每孔加入佛波酯(50 ng/mL)、離子霉素(1 000 ng/mL)及阻斷劑布雷菲德菌素A,予37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)6 h。

流式細胞術檢測Th1、Th2、Th17細胞DR亞群 每個樣本加入500 μL含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS放置于4°冰上封閉30 min,423×g離心10 min后用250 μL染色緩沖液混勻,制成細胞懸液。每管流式細胞管加入50 μL細胞懸液。細胞染色分為3步:第一步加入APC-H7標記的CD4抗體及分別對應兔抗人DR抗體D1～D5 (1∶100稀釋),4 ℃避光孵育30 min,加入染色緩沖液1 mL洗滌后,用90 μL染色緩沖液重懸,加入CF405 M標記羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋),4 ℃避光孵育30 min,染色緩沖液洗滌1遍后加入破膜/固定液250 μL,置于4 ℃避光保存30 min,加入1 mL破膜/固定緩沖液洗滌2遍后,50 μL重懸細胞,加入小鼠抗人APC標記IFN-γ、PerCP-CyTM5.5 標記的IL-4以及PE偶聯(lián)IL-17A抗體混合液,4 ℃孵育30 min,破膜/固定緩沖液1 mL洗滌2遍后,加入250 μL染色緩沖液上機檢測。檢測采用美國BD公司Conto Ⅱ流式細胞儀,FACS Diva 軟件獲取數(shù)據(jù)并用Flow jo 7.6.1進行數(shù)據(jù)分析,每管檢測細胞數(shù)目約為(0.5～1.5)×106個,結果以陽性細胞百分比表示,DR+Th細胞表示DR陽性的各類Th亞群細胞占該亞群細胞的百分比。

結 果

人口學資料 RA組患者平均年齡為(54±12)歲,其中男性4例、女性21例;OA組平均年齡(60±10)歲,其中男性5例、女性8例;健康對照組平均年齡為(25±2)歲,其中男性和女性各6名。RA組和OA組年齡差異無統(tǒng)計學意義(P=0.098),但均高于健康對照組(P<0.001)。RA組臨床資料見表1。

外周血Th細胞亞群分析 RA組CD4細胞陽性率為42.20%±7.67%,接近于OA組(41.59%±8.99%,P=0.977),明顯高于健康對照組(32.51%±6.76%,P=0.04)。Th1細胞百分比在RA組、OA組、健康對照組間無明顯差異(P=0.88)。RA組Th2細胞百分比為1.28%(0.74%～2.68%),明顯高于健康對照組和OA組(P值分別為<0.001和0.029),RA組Th17細胞百分比高于健康對照組(P=0.007),較OA組升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.096)。外周血Th細胞亞群流式圖見圖1,3組外周血Th1、Th2、Th17細胞百分比統(tǒng)計結果見表2。

表1 RA患者人口學資料Tab 1 The demographics of patients with rheumatoid arthritis

TJC:Tender joint count; SJC:Swollen joint count; ESR:Erythrocyte sedimentation rate; CRP:C reactive protein; Anti-CCP antibody:Anti-cyclic citrullinated protein; RF:Rheumatoid factor; PGA:Patient global assessment; EGA:Evaluator global assessment; HAQ:Health assessment questionnaire; DAS28:Disease activity score based on 28 joints; CDAI:Clinical disease activity index; SDAI:Simplified disease activity index.

表2 RA、OA患者及健康人外周血Th細胞亞群百分比檢測結果Tab 2 Detection results of Th cell subsets in peripheral blood of RA,OA patients and healthy controls

(1)vs.healthy controls,(2)vs.osteoarthritis group,P<0.05; Con:Healthy control group.

流式細胞術檢測Th1、Th2、Th17細胞表面D1～D5表達 外周血Th2細胞D1～D5代表性的流式圖見圖2。RA組Th2細胞DR2受體表達量為25.40% (3.79%～37.10%),健康對照組和OA組分別為3.74% (0.00%～12.98%)和3.45%(0.00%～20.55%),RA組Th2細胞表面DR2陽性顯著高于后兩組(RA組vs.健康對照組,P=0.006;RA組vs. OA組,P=0.040,圖3A);Th2細胞DR4受體在RA組、OA組和健康對照組表達水平分別為10.30%(3.61%～14.75%)、2.98%(0.00%～5.67%)、2.26%(0.00%～8.08%),RA組Th2細胞DR4受體顯著升高(健康對照組vs. RA組,P=0.022;OA組vs. RA組,P=0.010,圖3B),分布見表3。RA組DR2+Th1細胞百分比為 1.93%(0.66%～5.41%),健康對照組為0.62%(0.28%～1.25%),顯著低于RA組(P=0.006);RA組和OA組Th1細胞DR4表達分別為2.38%(0.69%～4.36%)和2.04%(0.65%～4.24%),明顯高于健康對照組0.48%(0.16%～1.02%)(RA組vs.健康對照組,P=0.001;OA組vs.健康對照組,P=0.015;RA組vs.OA組,P=0.622)。RA組Th1和Th17細胞DR1～DR5的表達及與其他兩組的比較見表4。

圖1 RA患者Th細胞亞群流式細胞圖Fig 1 FACs of proportions of Th cell subtypes in RA patients

圖2 RA患者DR+Th2典型流式細胞圖Fig 2 Representative FACs of proportions of DR+Th2 cells in RA patients

Th細胞亞群以及細胞表面DR表達與臨床指標相關性 RA患者Th1細胞百分比與TJC(r=0.427,P=0.033)、疼痛評分(r=0.397,P=0.049)、EGA(r=0.417,P=0.038)、DAS28(r=0.477,P=0.016)以及SDAI(r=0.432,P=0.031)呈正相關。Th2細胞百分比與SJC和SDAI呈正相關(分別為r=0.421,P=0.036;r=0.396,P=0.050)。Th1細胞DR5受體和SJC以及CDAI呈正相關(分別為r=0.492,P=0.012;r=0.445,P=0.026),Th2細胞DR1和DR3與健康評估問卷評分(HAQ)呈負相關(分別為r=-0.469,P=0.018;r=-0.464,P=0.019)。Th17DR1～DR5與疾病活動度、功能狀態(tài)及炎癥指標無明顯相關性。

圖3 Th2細胞DR2(A)和DR4(B)表達Fig 3 The DR2(A) and DR4(B) expression on Th2 cells

表3 Th2細胞DR表達水平Tab 3 The expression level of DR on Th2 cells(mean and 25%-75% range,%)

(1)vs.healthy controls,(2)vs.osteoarthritis group,P<0.05.

表4 Th1和Th17細胞DR表達水平Tab 4 The DR expression levels on Th1 and Th17 cells (mean and 25%-75% range,%)

vs. healthy controls,P<0.05.

討 論

多巴胺是單胺類神經(jīng)遞質,作為腎上腺素和去甲腎上腺素的前體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要功能,參與情緒、情感、運動、記憶、攝食、學習等多種生命活動的調節(jié)。中樞及外周多巴胺水平的異常,可造成多種精神神經(jīng)功能障礙,表現(xiàn)為精神分裂癥、抑郁、杜氏抽動癥、帕金森病等疾病。多巴胺與其特異性的DR組成多巴胺能系統(tǒng),可通過下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感/副交感神經(jīng)纖維、初級和次級淋巴結以及免疫細胞發(fā)揮作用,包括樹突狀細胞和T細胞在內(nèi)的多種免疫細胞以及滑膜成纖維細胞[8]可以合成、儲存、運輸多巴胺,通過旁分泌和自分泌的方式作用于多種免疫細胞胞膜上的特異性DR,影響免疫細胞的分化、活化、靜息、凋亡以及細胞因子的分泌。多巴胺的不同藥理生理學效應取決于多巴胺的濃度、作用細胞的類型及功能狀態(tài)以及結合的DR類型?，F(xiàn)有研究已證實淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等多種細胞表達DR1～DR5五種類型受體。

多巴胺參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病,有關RA的研究較為廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者關節(jié)滑液和外周血中的多巴胺濃度較對照組明顯升高。早期有研究探討了多巴胺激動劑/抑制劑在RA尤其是難治性RA患者中的藥理學作用[9-10]。通過RA動物模型發(fā)現(xiàn),多巴胺D1樣受體激動劑可以改善膠原誘導關節(jié)炎動物模型的關節(jié)評分及影像學病變[11],在SCID小鼠與RA患者滑膜組織嵌合模型中,D2樣受體拮抗劑氟哌啶醇可以誘導IL-6和Th17細胞大量聚集,加速軟骨破壞,與之相反的是D1樣受體拮抗劑SCH23390可以抑制軟骨破壞,進一步發(fā)現(xiàn)滑膜組織中的樹突狀細胞可以儲存和釋放多巴胺,通過結合D1樣受體,依賴IL-6升高上調IL-17水平[2]。RA患者滑膜成纖維細胞DR mRNA較OA患者滑膜組織明顯增高,且兩組滑膜成纖維細胞DR表達以D2樣受體為主,外源性的多巴胺與RA患者滑膜成纖維細胞共培養(yǎng)后顯著抑制炎癥因子IL-6 和IL-8的產(chǎn)生[8]。

雖然DR DR1～DR5根據(jù)藥理學和結構特點的不同分為D1樣和D2樣受體,但是,即使是同一類受體,其表達和功能也不同。T細胞DR1～DR5表達量較B細胞、NK細胞、嗜酸性粒細胞及巨噬細胞低,DR3和DR5在免疫細胞中的水平較為穩(wěn)定,DR2和DR4波動性較大[12]。通過激活DR4受體可以抑制ERK1/ERK2磷酸化,上調Krupple樣因子2表達誘導T細胞處于靜息狀態(tài)[13]。DR2受體活化可增加IL-10的合成,抑制效應T細胞的功能[14],激活DR3受體可促進IFN-r分泌[15]。活化T細胞(effective T cells)較原始T細胞(naive T cells)D1樣受體和DR2樣受體均升高[16],表明DR水平不僅取決于細胞種類的不同,同時也受細胞功能狀態(tài)的影響。

DR DR1～DR5在Th1和Th2細胞分布的不同,與Th1和Th2細胞在RA發(fā)病中的作用不同。Th1主要發(fā)揮促炎功能,而Th2細胞通過分泌抑制性細胞因子起抑炎作用。本研究中RA組Th2細胞比例顯著高于健康對照及OA組,且與STC及SDAI呈正相關,這一發(fā)現(xiàn)也與既往報道相符。van Roon等[17]發(fā)現(xiàn)RA患者外周血T細胞較正常人分泌更多的IL-4,而IFN-r分泌下降,且IL-4水平與血沉、C反應蛋白、TNF-α以及關節(jié)破壞正相關,而IL-4是Th2細胞分化和分泌的重要細胞因子。此外,Th2細胞還可分泌IL-10,發(fā)揮免疫抑制功能,與Th1和Th17相比,起免疫負向調控作用。本研究初步探索了RA患者外周血Th細胞亞群多巴胺受體的表達情況,結果發(fā)現(xiàn),Th2細胞DR2和DR4受體表達均較對照組上調,兩者同屬D2樣受體,Th1DR2低下,DR4升高,且與臨床指標有一定相關性;其在RA中確切的免疫調節(jié)機制尚不清楚,需體外實驗及動物實驗進一步研究多巴胺及其受體在RA中的作用。樣本量偏小是本研究的不足之處,此外,樹突狀細胞、巨噬細胞和成纖維細胞DR間的相關性尚需以后研究補充。

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The influence of dopamine receptor (DR) expressed in T helper cell subsets on the disease activity of rheumatoid arthritis (RA) patients

WEI Lei1▲, SUN Ying1▲, MA Li-li1, JI Zong-fei1, ZHANG Zhuo-jun1, DAI Xiao-min1, WU Wan-long1, YUE Tao2, ZHU Qi2, SHEN Jie2, JIANG Lin-di1△

(1DepartmentofImmunologyandRheumatology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofRheumatology,ShanghaiGuanghuaHospitalofIntegratedChinese&WesternMedicine,Shanghai200052,China)

Objective To detect the expressions of dopamine receptor D1-D5 among different T helper (Th) cells in patients with rheumatoid arthritis (RA) and to analyze the correlation between dopamine receptor (DR) and disease activity,laboratory tests and functional status. Methods Patients with RA (n=25),or osteoarthritis (OA) (n=13) diagnosed according to the ACR criteria,as well as healthy donors (n=12) were recruited in this study.RA patients were all treatment naive or free of disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) at least for 3 months.Flow cytometry was performed to detect the dopamine receptor D1-D5 in Th1,Th2 and Th17 cells in three groups.Correlation analyses were made between the demographics,clinical data,functional status,disease activity and dopamine receptor expressions on Th cell subsets. Results The percentage of Th2 cells in patients with RA was 1.28% (0.74%-2.68%) and significantly higher than that in healthy controls (median 0.18%,IQR:0.11%-0.31%,P<0.001) and patients with OA (median 0.48%,IQR:0.03%-1.47%,P=0.029).Meanwhile,the dopamine receptor DR2 expressed on Th2 cells in rheumatoid arthritis group (median 25.40%,IQR:3.79%-37.10%) were remarkably elevated than that in healthy donors (median 3.74%,IQR:0.00%-12.98%,P=0.006) and OA patients (median 3.45%,IQR:0.00%-20.55%,P=0.040).Th2 cells also expressed higher level of DR4 in RA group than that in healthy controls and OA group (P=0.022 andP=0.010,respectively).A positive correlation was found between Th2 cells percentage and swollen joint count (SJC) (r=0.421,P=0.036) as well as SDAI (r=0.396,P=0.050).DR5 expressed on Th1 cells in RA group was 2.22%(IQR:0.57%-12.24%)and had positive correlations with SJC (r=0.492,P=0.012) and CDAI(r=0.445,P=0.026).DR1 and DR3 on Th2 cells were 11.15%(IQR:2.93%-36.20%) and 9.80%(IQR:1.62%-23.05%),and all negatively related with Health Assessment Questionnaire (HAQ) (DR1:r=-0.469,P=0.018;DR3:r=-0.464,P=0.019).Conclusions Dopamine receptor DR2 and DR4 on Th2 cells were highly expressed.Dopamine receptor levels in Th cells are correlated with SJC,CDAI and HAQ in RA patients.

rheumatoid arthritis (RA); T helper cells; dopamine receptor; disease activity

R 593.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.001

2014-07-25;編輯:張秀峰)

上海市科委基礎研究重點項目(12JC1402500)

▲Co-first authors

△Corresponding author E-mail:zsh-rheum@hotmail.com

*This work was supported by the Major Program of Shanghai Committee of Science and Technology (12JC1402500).