劉興健, 楊 鑫, 張志芳, 李軼女, 易詠竹, 胡小元*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018

貓ω-like干擾素在家蠶中的表達(dá)和生物活性檢測(cè)

劉興健1, 楊 鑫1, 張志芳1, 李軼女1, 易詠竹2, 胡小元1*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018

干擾素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)和寵物治療中可以用于治療病毒性傳染病和提高疫苗免疫效力。用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶中表達(dá)貓ω-like干擾素，將貓ω-like干擾素基因進(jìn)行優(yōu)化后合成，克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393上，與病毒復(fù)制基因失活拯救型BmBacmid病毒DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系，獲得重組BmNPV病毒，貓ω-like干擾素基因位于多角體基因啟動(dòng)子下游，用重組病毒感染家蠶收獲表達(dá)產(chǎn)物。采用細(xì)胞病變法利用干擾素抑制VSV-GFP感染貓腎細(xì)胞的方法來(lái)測(cè)定干擾素活性，結(jié)果顯示干擾素效價(jià)可以達(dá)到4.53×106IU/mL以上。研究結(jié)果有望為研制新型動(dòng)物干擾素疫苗提供參考。

貓ω-like干擾素；家蠶；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；抗病毒活性

一直以來(lái)貓、犬等動(dòng)物作為寵物和人類的關(guān)系很密切，尤其是近年來(lái)，隨著城鎮(zhèn)中寵物喂養(yǎng)的比例大大增加，國(guó)家對(duì)城鎮(zhèn)居民寵物飼養(yǎng)的監(jiān)管也更加正規(guī)，寵物已經(jīng)融入到人們的日常生活中，隨之而來(lái)的就是如何應(yīng)對(duì)寵物疾病。病毒性疾病如冠狀病毒病、免疫缺陷病毒等引起的傳染性病毒病嚴(yán)重威脅著貓、犬的健康。開發(fā)高效的寵物用抗病毒制劑用于寵物治療甚至畜牧養(yǎng)殖業(yè)有很重要的作用。干擾素(interferon)是一種廣譜的抗病毒、抗腫瘤以及具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子[1]，1957年，Isaacs[2]在用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)被感染細(xì)胞產(chǎn)生了一種影響其他細(xì)胞從而干擾病毒感染復(fù)制的因子，并將其命名為干擾素。貓干擾素(feline interferon，F(xiàn)eIFN)基因在1992年被Nakamura等[3]首次分離，后來(lái)其被歸為ω型干擾素。用BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的貓干擾素(Intercat?)在20世紀(jì)初就在日本投入生產(chǎn)并上市，產(chǎn)值達(dá)到13億日元，用于治療貓杯狀病毒感染等疾病[4,5]，另外在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)其在抗犬細(xì)小病毒[6,7]和犬腸炎病毒[6]等方面都具有一定的效果。

貓的ω型干擾素基因經(jīng)分析在基因組中至少有13種，在大腸桿菌和畢赤酵母的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，不同的干擾素基因的抗病毒活性差異較大[8,9]。我們選用了報(bào)道中首次用于表達(dá)的商品化的貓ω-like干擾素[8]，該基因全長(zhǎng)585 bp，它是α干擾素的一種突變類型，商品化產(chǎn)品中的名稱為ω-like，因此本文中也沿用此名稱。為了開發(fā)新型的重組貓干擾素生物制劑，本課題組利用重組桿狀病毒在家蠶生物反應(yīng)器[10]中進(jìn)行了表達(dá)，并在貓腎上皮細(xì)胞(CRFK)中檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性。

BmBacmid家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是結(jié)合常用的Bac-to-Bac、BacPAK6和flashBAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)在BmNPV的基礎(chǔ)上構(gòu)建的一種新型重組病毒和外源基因表達(dá)系統(tǒng)[10]。該系統(tǒng)可以在大腸桿菌中進(jìn)行基因操作和大量制備，在共轉(zhuǎn)染過程中可以批量制備重組病毒，共轉(zhuǎn)染獲得的重組病毒純合率幾乎達(dá)到100%，適于快速構(gòu)建重組病毒和表達(dá)外源蛋白。

為了利用家蠶生物反應(yīng)器快速、高效制備具有抗病毒活性的貓ω干擾素，從而使得寵物病毒病的防治和治療更加有效，本研究以BmBacmid系統(tǒng)進(jìn)行了該干擾素的表達(dá)，以期為新型動(dòng)物干擾素疫苗的研制提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；TC100培養(yǎng)基購(gòu)自AppliChem公司；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自Gibco公司；脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司；Intercat購(gòu)自Virbac公司。

桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393購(gòu)自Invitrogen公司；BmBacmid缺陷型桿粒、VSV-GFP病毒、大腸桿菌DH10B、BmN細(xì)胞系、CRFK細(xì)胞系等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貓ω-like干擾素的獲得 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，獲得該干擾素的基因序列，另外有研究報(bào)道天然的貓ω-like干擾素氨基酸序列信號(hào)肽位置存在兩個(gè)切割位點(diǎn)[11]，推測(cè)可能會(huì)影響其表達(dá)后的分泌效率，因此本文對(duì)其信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行了優(yōu)化改造，將第21位的絲氨酸(S)突變?yōu)槔i氨酸(V)，提高其在該位點(diǎn)的切割效率。在優(yōu)化后的基因序列的5′端加上BamHⅠ酶切位點(diǎn)和Kozak序列，3′端加上終止密碼子和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)完成交由南京金斯瑞公司進(jìn)行合成并克隆到pUC載體上，得到含有貓ω-like干擾素基因的質(zhì)粒pUC-FeIFNωl。

1.2.2 貓ω-like干擾素基因插入到轉(zhuǎn)移載體上 將pUC-FeIFNωl載體用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收600 bp左右的目的片段，與進(jìn)行同樣酶切處理的pVL1393轉(zhuǎn)移載體用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，在Amp抗生素的LB平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的克隆，利用質(zhì)?？焖俅痔岬姆椒êY選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,篩選出連接有相應(yīng)大小目的片段的克隆，測(cè)序鑒定確認(rèn)FeIFN ω-like基因連接到轉(zhuǎn)移載體上獲得了pVL1393-FWL。

1.2.3 家蠶細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備 根據(jù)Summers[12]的操作手冊(cè)，用含有FBS的TC100昆蟲培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶BmN細(xì)胞系，達(dá)到合適的濃度后接種到六孔板中或者35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿上(1×106cells/mL)培養(yǎng)8～12 h，用于共轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組病毒。

1.2.4 重組桿狀病毒的構(gòu)建 根據(jù)失活拯救型BmBacmid構(gòu)建重組病毒的方法[10]，將適量的轉(zhuǎn)移載體pVL1393-FWL和純化的BmBacmid病毒DNA混合后加入脂質(zhì)體，室溫孵育20 min，共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系，27℃培養(yǎng)4～5 d后待細(xì)胞感染發(fā)病并剝落后收集共轉(zhuǎn)染上清液，獲得重組病毒reBm-FWL。

1.2.5 斑篩選高表達(dá)重組病毒 在35 mm培養(yǎng)皿中接種適量的BmN細(xì)胞并在27℃培養(yǎng)12 h，將含有重組病毒的共轉(zhuǎn)染上清液稀釋100倍，取10 μL稀釋液感染BmN細(xì)胞，27℃孵育1 h后將無(wú)血清TC100培養(yǎng)基換成含血清、低熔點(diǎn)凝膠的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5～6 d后挑取病毒斑獲得單獨(dú)的毒株，在24孔板中用液體TC100培養(yǎng)的BmN細(xì)胞系擴(kuò)增篩選的病毒，鑒定獲得24個(gè)reBm-FWL的重組病毒毒株。

1.2.6 貓ω-like干擾素在家蠶中的表達(dá) 用共轉(zhuǎn)染獲得的重組病毒或者斑純化獲得的重組病毒注射感染5齡起家蠶(105pfu/頭)，在濕度65%，溫度25～27℃條件下培養(yǎng)108～120 h，觀察家蠶發(fā)病情況并收集含有重組FeIFN ω-like表達(dá)產(chǎn)物的蠶血淋巴，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 貓ω-like干擾素抗病毒活性檢測(cè) 用微量細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)貓ω-like干擾素的活性[13]。用VSV-GFP病毒感染貓ω-like干擾素處理過的CRFK細(xì)胞，通過綠色熒光反應(yīng)的病毒感染發(fā)病情況來(lái)檢測(cè)其抗病毒活性。具體操作方法如下：在96孔板中接種CRFK細(xì)胞(2×105～3×105cells/mL)，37℃貼壁培養(yǎng)8～12 h；含有貓ω-like干擾素的蠶血淋巴超聲破碎后離心去除細(xì)胞碎片，再用0.2 μm濾膜過濾除菌，用含有FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至不同的梯度，分別用100 μL稀釋液在96孔板中孵育CRFK細(xì)胞12 h左右；去除96孔板中每個(gè)孔中的孵育培養(yǎng)基，加入100 μL含有100TCID50的VSV-GFP病毒DMEM培養(yǎng)基，37℃侵染1 h；棄掉含有病毒的培養(yǎng)基，換成正常含有FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、50 mL/L CO2的條件下培養(yǎng)24 h后倒置在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染情況。

最初的抗病毒活性檢測(cè)中估算樣品稀釋梯度，確定一定的范圍后設(shè)計(jì)合適的稀釋梯度來(lái)計(jì)算最準(zhǔn)確的抗病毒活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號(hào)肽優(yōu)化分析

將干擾素氨基酸序列第21位的絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)其蛋白序列在第23位的切割特異性明顯提高，如圖1(彩圖見圖版二)所示，序列優(yōu)化前分析預(yù)測(cè)在第21位和第23位處均有可能發(fā)生信號(hào)肽切割，序列優(yōu)化后第21位的切割特異性消失，第23位的切割特異性提高，推測(cè)突變有利于最終產(chǎn)物的表達(dá)和分泌。

2.2 含有FeIFN ω-like轉(zhuǎn)移載體的獲得

對(duì)獲得的pVL1393-FWL質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物(圖2)，9 kb左右片段為pVL1393載體片段，600 bp左右片段為FeIFN ω-like基因片段，說(shuō)明貓ω-like干擾素已成功插入到pVL1393轉(zhuǎn)移載體的MCS序列中，后續(xù)的測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。

2.3 貓ω-like干擾素抗病毒活性檢測(cè)

在細(xì)胞病變抑制的實(shí)驗(yàn)中，通過觀察用不同稀釋梯度的FeIFN ω-like表達(dá)產(chǎn)物處理的CRFK細(xì)胞抗VSV-GFP病毒感染情況來(lái)計(jì)算干擾素的抗病毒活性，以商品化的貓干擾素(Intercat?，以1×106IU/mL的母液進(jìn)行梯度稀釋)為陽(yáng)性對(duì)照。

CRFK細(xì)胞用VSV-GFP(100TCID50)侵染后24 h觀察細(xì)胞的發(fā)病情況。實(shí)驗(yàn)組中干擾素在低稀釋倍數(shù)下可以完全抑制VSV病毒，細(xì)胞無(wú)熒光出現(xiàn)(圖3A,彩圖見圖版二)，在5×106倍數(shù)稀釋的情況下，開始有部分細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光(圖3C)，說(shuō)明干擾素濃度無(wú)法完全抑制病毒復(fù)制，但仍能抑制大部分病毒；在1×107倍數(shù)稀釋的情況下，大部分細(xì)胞出現(xiàn)了大面積的綠色熒光(圖3B)，說(shuō)明干擾素濃度過低，無(wú)法有效抑制病毒復(fù)制。同樣觀察記錄陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，記錄病毒感染發(fā)病后的綠色熒光情況(表1)。根據(jù)細(xì)胞感染發(fā)病情況計(jì)算，以Intercat?為陽(yáng)性對(duì)照，在蠶血淋巴中表達(dá)的FeIFN ω-like抗病毒效價(jià)可以達(dá)到2.0×106IU/mL左右。通過斑純化篩選得到的24個(gè)重組病毒株在家蠶中進(jìn)行表達(dá)并檢測(cè)活性，最好的毒株表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性可以達(dá)到4.53×106IU/mL，較共轉(zhuǎn)染液感染家蠶的產(chǎn)物活性提高了2倍左右。

圖2 pVL1393-FWL酶切鑒定結(jié)果

圖3 貓腎上皮細(xì)胞(CRFK)感染VSV病毒發(fā)病的情況

表1 重組貓ω-like干擾素抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果

Table 1 The results of antiviral activity test of recombinant FeIFN ω-like.

樣品蠶血淋巴/Intercat最終稀釋倍數(shù)5×1041×1055×1051×1065×1061×107FeIFNω-like---------±+±--------±-++------±--+±+-------±±-++陽(yáng)性對(duì)照---------±++------+-±+++陰性對(duì)照++++++++++++++++++++++++

注：“-”：無(wú)熒光，細(xì)胞未感染；“±”：少量細(xì)胞感染表達(dá)綠色熒光蛋白；“+”：50%以上細(xì)胞感染表達(dá)綠色熒光蛋白。

3 討論

貓ω-like干擾素已經(jīng)應(yīng)用于寵物飼養(yǎng)等行業(yè)，并且采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，適于真核來(lái)源的外源蛋白的表達(dá)，能夠形成正確的折疊和后期修飾，包括糖苷化、脂肪酸酰基化和乙?；龋畲蟪潭鹊谋ＷC表達(dá)的重組蛋白可以成為天然狀態(tài)且具有生物活性[14]。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的一種也具有以上優(yōu)點(diǎn)，另外在家蠶中還存在特有的N端糖基化過程，更加有利于外源基因的表達(dá)[15]。有研究報(bào)道稱桿狀病毒可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上誘導(dǎo)引發(fā)基礎(chǔ)免疫[16]，這一點(diǎn)使得利用該系統(tǒng)表達(dá)的重組貓ω-like干擾素在抗病毒時(shí)受到協(xié)同促進(jìn)作用，更加有利于抗病毒應(yīng)用。在我國(guó)家蠶可以大規(guī)模飼養(yǎng)，并且生產(chǎn)周期短、生物安全性高、生產(chǎn)成本低。因此，使用重組桿狀病毒在家蠶體內(nèi)表達(dá)貓ω-like干擾素是一個(gè)很好的選擇。

在之前的研究中，Nakamura等[8]同樣利用家蠶表達(dá)過貓的干擾素，并且進(jìn)行了商品化生產(chǎn)，在貓杯狀病毒感染、犬細(xì)小病毒和腸炎病毒感染的治療中進(jìn)行應(yīng)用，但是并未進(jìn)行優(yōu)化改造；另外貓干擾素也在研究中利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)[17]，也可以檢測(cè)到抗病毒活性，但是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)干擾素類的基因較真核表達(dá)系統(tǒng)是有差距的。在本研究中我們?cè)贜akamura研究的基礎(chǔ)上對(duì)干擾素基因進(jìn)行了優(yōu)化，并利用優(yōu)化后的家蠶桿狀病毒表達(dá)體系進(jìn)行了表達(dá)[10]，收獲產(chǎn)物的抗病毒活性檢測(cè)驗(yàn)證了表達(dá)出的干擾素是有高抗病毒活性的，病毒初步篩選后的表達(dá)產(chǎn)物抗病毒效價(jià)可以達(dá)到4.53×106IU/mL蠶血淋巴，已經(jīng)高于商品化對(duì)照組的樣品。用GFP報(bào)告基因監(jiān)測(cè)VSV病毒感染CRFK細(xì)胞的情況使得抗病毒活性檢測(cè)更加方便、靈敏、準(zhǔn)確。

本研究中首先對(duì)其信號(hào)肽序列進(jìn)行了改造，預(yù)測(cè)信號(hào)肽切割特異性在第23位有所提高，可能會(huì)提高表達(dá)產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)量和分泌效率，進(jìn)而提高表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性；利用病毒復(fù)制缺陷型桿粒快速構(gòu)建了重組病毒并實(shí)現(xiàn)了貓ω-like干擾素在家蠶中的表達(dá)并檢測(cè)具有高抗病毒活性，這為進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)相應(yīng)的免疫和治療藥劑提供了條件。為了進(jìn)一步的鑒定該干擾素的表達(dá)，后期可以進(jìn)行相應(yīng)的免疫印跡檢測(cè)，以及采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該產(chǎn)物在動(dòng)物個(gè)體上對(duì)相應(yīng)病毒病的治療效果。

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Expression and Antiviral Activity Detection of Feline Interferon ω-like in Silkworm

LIU Xing-jian1, YANG Xin1, ZHANG Zhi-fang1, LI Yi-nv1, YI Yong-zhu2, HU Xiao-yuan1*

1.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;2.SericulturalResearchInstitute,CAAS,JiangsuZhenjiang212018,China

Interferon is used for treating viral infectious diseases and enhancing vaccine efficacy in stockbreeding and pet healthcare. In this study, recombinant feline interferon ω-like (FeIFN ω-like) was expressed in silkworm using baculovirus expression vector system. The FeIFN ω-like gene was artificially synthesized after optimization. The optimized gene was first cloned into pVL1393 transfer vector, then inserted into BmNPV downstream the polyhedron promoter using co-transfection with BmBacmid DNA. The silkworm was infected by recombinant BmNPV to express the protein. Micro cytopathogenic effect inhibition assay in CRFK cell/VSV-GFP system was used to test the bioactivity of FeIFN ω-like. The antiviral activity assay indicated that the product in hemolymph exhibited antiviral activity that exceeded 4.53×106IU/mL. The results was expected to provide reference for new animal vaccine research.

feline interferon ω-like; silkworm; baculovirus expression system; antiviral activity

2015-05-28; 接受日期：2015-08-24

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100603)；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB114600)；甘肅省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(143NKDA019)資助。

劉興健，博士研究生，研究方向病毒分子生物學(xué)。E-mail：liuxingjian87@gmail.com。*通信作者：胡小元，副研究員，研究方向?yàn)闂U狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。E-mail：huxiaoyuan01@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.07