施云峰, 莫乃新, 呂 忠, 吳 斌, 史紅雷，王旭剛

(江蘇大學附屬武進醫(yī)院泌尿外科,江蘇常州 213002)

·基礎研究·

抑制CD24基因對膀胱癌細胞生物學行為的影響

施云峰, 莫乃新, 呂 忠, 吳 斌, 史紅雷，王旭剛

(江蘇大學附屬武進醫(yī)院泌尿外科,江蘇常州 213002)

目的 利用特異性siRNA沉默CD24基因表達，探討CD24的表達抑制對體外膀胱癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。方法 利用脂質(zhì)體轉染法將含有CD24特異性siRNA的真核表達質(zhì)粒轉染至人膀胱癌T24細胞中，實時定量PCR和Western blot法檢測T24細胞中CD24基因的表達情況，MTT法、劃痕實驗、Transwells侵襲實驗分別檢測調(diào)控CD24的表達對體外膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲作用的影響。結果 我們成功建立CD24 siRNA轉染的膀胱癌T24細胞株。經(jīng)實時定量PCR和Western blot法證實siRNA組較空載體組細胞CD24 mRNA轉錄和蛋白表達水平明顯降低。MTT檢測發(fā)現(xiàn)siRNA組較空載體組細胞的增殖能力顯著下降。劃痕實驗提示siRNA組細胞的遷移能力顯著降低；Transwells侵襲實驗顯示siRNA組的穿膜細胞數(shù)顯著少于空載體組。結論 特異性siRNA沉默CD24基因表達能顯著抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移，同時明顯抑制其體外侵襲能力。

膀胱癌；細胞增殖；侵襲；RNA干擾

早期膀胱癌可以通過手術獲得較好的療效，但是發(fā)生轉移的晚期膀胱癌的治療仍是臨床的難點，針對膀胱癌轉移的基礎研究具有積極的意義。有研究發(fā)現(xiàn)CD24 高表達于多種腫瘤細胞膜上，并與腫瘤的轉移及預后密切相關[1]。在誘導的膀胱癌研究模型中，CD24基因敲除小鼠發(fā)生腫瘤的比例明顯較對照組低，而且腫瘤的侵襲和轉移能力減弱[2]。因此我們擬采用RNA干擾技術阻斷CD24在膀胱癌T24細胞中的作用，以觀察腫瘤細胞的生長變化情況，并探討其變化機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 膀胱癌T24細胞株購自中科院上海細胞研究所，CD24 siRNA真核表達質(zhì)粒和空載體由上海吉瑪公司構建并測序鑒定，脂質(zhì)體細胞轉染試劑 LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，CD24單克隆抗體購自美國Sigma公司，HRP標記的羊抗兔二抗購自杭州華安生物公司，Transwells小室購自美國Costar公司，BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 膀胱癌T24細胞采用RPMI-1640加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞以2×105個接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞生長至60%～80%融合時開始轉染，按照LipofectamineTM2000說明轉染，共分3組，分別為空白對照組(未做處理)、陰性對照組(轉染無義siRNA)、CD24-siRNA組(轉染CD24 siRNA)，每組設置3個復孔。

1.2.2 實時定量PCR檢測CD24 mRNA的表達 轉染后48 h收集細胞，提取各實驗組細胞總RNA，取1 μg逆轉錄到cDNA。CD24引物序列由上海英俊公司合成，CD24上游引物：5′- AAAGAAATGGCTGAAAGAGCAA -3′，下游引物：5′- AGGCTCATAGAACCATGATTACCC -3′，內(nèi)參β-actin上游引物：5′- GTGATGGTGGGAATGGGT -3′，下游引物：5′- TGGGGTGTTGAAGGTCTC -3′。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s；72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，然后采用2e -△△Ct相對定量比較各組差異。

1.2.3 Western blot檢測 收集轉染后96 h的細胞，用裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后按60 μg/孔上樣后電泳。4 ℃ 100 V轉膜1.5 h至PVDF膜上，PVDF用5%脫脂奶粉TBST液封閉45 min，加入鼠抗人AR單抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。然后再加入HRP標記的二抗(1∶3 000稀釋)孵育1 h，ECL檢測試劑盒顯色，曝光。圖像掃描后用BandScan軟件作灰度分析。

1.2.4 MTT實驗 轉染后的細胞調(diào)整濃度為4×103個/孔，種植于96孔板，將細胞放于37 ℃培養(yǎng)箱、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每組細胞設3個平衡孔，分別于0、24、48、72 h后，吸去多余培養(yǎng)基，然后加入80 μL新鮮培養(yǎng)基，加入20 μL MTT、37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h；吸去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，避光置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀A590 nm處測量各孔的A值。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 將Matrigel基質(zhì)膠與含0.1%BSA的1640液按1∶8比例混合后于37℃包被Transwell小室6 h，然后用50 μL含0.1%BSA的1 640液水化小室30 min。收集轉染48 h的細胞，分組同前，重懸浮后以每孔2×104接種于Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%血清培養(yǎng)基，置于孵箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS洗滌以4%多聚甲醛固定30 min，棉簽擦去上室未穿膜的細胞，后用結晶紫染色30 min，顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)整個視野內(nèi)穿膜至下面的細胞數(shù)，計算平均值。

1.2.6 劃痕實驗 將轉染后的細胞消化接種至6孔板內(nèi)。待細胞融合度達100%后，在6孔板背部，均勻劃出橫線，用PBS清洗細胞3次，去除漂浮的細胞，加入含2%FBS的1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，沿劃痕邊緣等距離取5個數(shù)據(jù)測定點以 Image J軟件測定細胞間距，測量后取平均值。細胞遷移比例用如下公式計算：100%-(24 h后的寬度/實驗開始時的寬度)×100%。

2 結 果

2.1 特異性siRNA作用對CD24基因表達的影響 與空白組比較，陰性對照組和siRNA組的CD24 mRNA相對表達水平分別為1.083±0.21、0.375±0.09。蛋白印跡檢測顯示siRNA組CD24蛋白的表達明顯低于其他兩組(P<0.05,圖1、圖2)。

圖1 CD24 mRNA在各組的相對表達量

A:柱狀圖；B:熒光顯微鏡下，綠色熒光蛋白在細胞中廣泛表達，表明CD24 siRNA和無義siRNA已成功轉入細胞(×100)。

2.2 CD24表達抑制對細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗顯示，轉染CD24-siRNA后的細胞遷移能力顯著降低(F=278.45，P=0.000)，siRNA組遷移比例為[(38.9±4.85)%]較對照組[(73.5±9.51)%]、空白對照組[(75.83±11.24)%]明顯降低(P=0.000)。

2.3 抑制CD24基因表達對膀胱T24癌細胞增殖作用的影響 通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA組細胞的吸光度值顯著低于其他兩組，多個時間點的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著監(jiān)測時間延長，生長抑制作用加劇(圖3)。

圖2 CD24蛋白在各組的表達

1.空白對照組;2.陰性對照組;3.siRNA組。

圖3 MTT實驗檢測細胞在各組中的增殖情況的變化

*與其他組比較，P<0.05。

2.4 抑制CD24基因表達對膀胱癌T24細胞侵襲能力的影響 Transwells侵襲實驗結果顯示，siRNA組穿膜細胞數(shù)(58.9±19.7)與空白對照組(163.4±25.5)及陰性對照組(161.3±18.7)相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。

圖4 Transwells侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力變化(×100)

A:空白對照組;B:陰性對照組;C:siRNA組。

2.5 調(diào)控CD24基因表達對膀胱癌T24細胞內(nèi)相關蛋白的影響 蛋白印跡法檢測顯示，siRNA組細胞中的細胞周期蛋白Cyclin D1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9均有明顯降低(圖5)。

圖5 各組細胞中細胞周期蛋白Cyclin D1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達

3 討 論

CD24為一種膜糖蛋白，是P-選擇素的配體之一，在正常生理情況下，參與介導單核細胞、中性粒細胞與表達P-選擇素的內(nèi)皮細胞、血小板之間的粘附[3]。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)CD24 高表達于多種腫瘤細胞膜上，并與腫瘤的轉移及預后密切相關，已證實了CD24與乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[4]。曹曉鋒等[5]研究CD24可能參與了膀胱尿路上皮腫瘤的血管生成，促進膀胱腫瘤的浸潤和轉移，CD24的高表達是腫瘤的浸潤性和高分級的標志。LEE等[6]研究顯示在胰腺癌、結腸癌、肝細胞癌中CD24陽性細胞群具有自我更新、分化和轉移的能力。

我們在實驗中針對CD24基因mRNA特點設計合成siRNA分子，轉染至膀胱癌T24細胞。通過檢測，發(fā)現(xiàn)轉染后細胞內(nèi)CD24基因mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均明顯下降，說明轉染成功抑制了CD24的表達。后續(xù)的MTT實驗、細胞劃痕實驗及Transwell實驗顯示轉染組細胞增殖、遷移和侵襲能力均較空白對照組和陰性對照組顯著減弱。為初步探討細胞轉染后發(fā)生生長狀態(tài)變化的原因，我們的進一步研究提示，在轉染組細胞中，CD24表達抑制后細胞內(nèi)細胞周期相關蛋白(Cyclin D1)和基質(zhì)金屬蛋白(MMP-2、MMP-9)的表達降低，細胞的增殖和侵襲能力降低可能與此有關。siRNA干擾組T-24細胞MMP-2、MMP-9的分泌量顯著低于對照組細胞，這是可能是由于封閉CD24后阻斷了腫瘤細胞自分泌產(chǎn)生MMPs的結果[7]。OVERDEVEST等[8]通過對比研究膀胱癌的原發(fā)瘤及轉移瘤，發(fā)現(xiàn)CD24在轉移瘤中高表達，裸鼠實驗中，運用單克隆抗體抑制CD24后，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制腫瘤的生長，并延長裸鼠生存期。這些都表明CD24在膀胱癌的轉移進展中可能具有重要的作用。

本研究提示CD24在膀胱癌細胞生長調(diào)控中發(fā)揮關鍵的作用，深入研究CD24的具體作用機制以及其參與介導的相關信號通路變化，對以CD24為新靶點的膀胱癌基因生物治療研究具有積極的意義。

[1] SMITH SC, OXFORD G, WU Z, et al. The metastasis -associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer[J]. Cancer Res,2006,66:1917-1922.

[2] OVRRDEVEST JB, KNUBEL KH, THEODORESCU D, et al. CD24 expression is important in male urothelial tumorigenesis and metastasis in mice and is androgen regulated[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(51):E3588-3596.

[3] 鄒萌萌，吳誠義．CD24 與乳腺癌及其干細胞的研究進展[J]．中國普通外科雜志，2008,17(5)：480-483．

[4] SAGIV E, STARR A, ROZOVSKI U, et al. Targeting CD24 for treatment of colorectal and pancreatic cancer by monoclonal antibodies or small interfering RNA[J]. Cancer Res, 2008,68:2803-2812.

[5] 曹曉鋒，段建敏，魏希鋒，等. 膀胱尿路上皮癌中CD24、VEGF、MVD的表達及其臨床意義[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2009,14(2):118-120.

[6] LEE TK, CASTILLHO A, CHEUNG VC, et al. CD24(+) liver tumor-initiating cells drive self-renewal and tumor initiation through STAT3-mediated NANOG regulation[J]. Cell Stem Cell,2011,9:50-63.

[7] 薛義軍，孫志熙，鄒曉峰，等.小RNA干擾沉默CD147基因對膀胱癌T-24細胞生物學行為的影響[J].腫瘤，2012，32(5)：342-348．

[8] OVERDEVEST JB, THOMAS S, KRISTIANSEN G, et al. CD24 offers a therapeutic target for control of bladder cancer metastasis based on a requirement for lung colonization[J]. Cancer Res, 2011,71(11):3802-3811.

(編輯 何宏靈)

Effects of downregulation of CD24 gene expression on malignant biological behavior of bladder cancer cells

SHI Yun-feng, MO Nai-xin, Lü Zhong, WU Bin, SHI Hong-lei, WANG Xu-gang

(Department of Urology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou 213002, China)

Objective To investigate the effects of CD24 knockdown by siRNA on bladder cancer cell proliferation, apoptosis and invasion. Methods CD24 siRNA plasmids were constructed, and then transfected into T24 cells. The mRNA and protein levels of CD24 expression in the transfected cells were detected using qRT-PCR and Western blot assay. The proliferation, migration and invasion of bladder cancer cells were observed with MTT, scratch test and Transwells assays. Results The mRNA and protein levels of CD24 expression in the siRNA group were significantly decreased compared with the control group. The proliferation of CD24 siRNA cells decreased notably compared with the control group, and the migration ability was reduced. The number of invasive T24 cells in the siRNA group decreased compared with the control group. Conclusions Downregulation of CD24 by siRNA inhibits bladder cancer cell proliferation, induces apoptosis and weakens its invasive ability in vitro.

bladder cancer; cell proliferation; invasion; RNA interference

2014-12-24

2015-04-06

常州市武進區(qū)科技計劃項目(No.WS201316)

施云峰(1983-)，男(漢族)，碩士，主治醫(yī)師.研究方向：泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤基礎與臨床.E-mail: fzy8353@163.com

R737.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.08.018