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        A1AT、MYH10在膀胱尿路上皮癌中的表達及其臨床意義

        2015-06-24 14:34:12成重峰王沛濤王新生牛海濤
        現(xiàn)代泌尿外科雜志 2015年6期

        成重峰,徐 婷,荊 濤,王沛濤,王新生,牛海濤

        (1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東青島 266021;2.解放軍第401醫(yī)院,山東青島 266071;3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東青島 266003)

        ·臨床研究·

        A1AT、MYH10在膀胱尿路上皮癌中的表達及其臨床意義

        成重峰1,徐 婷2,荊 濤3,王沛濤3,王新生3,牛海濤3

        (1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東青島 266021;2.解放軍第401醫(yī)院,山東青島 266071;3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東青島 266003)

        目的 探討α-抗胰蛋白酶A1AT、肌球蛋白10MYH10在膀胱尿路上皮癌組織中的表達與其病理分級和臨床分期的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測標本中A1AT、MYH10的表達,根據(jù)臨床病理資料進行分析;A1AT、MYH10的表達情況與膀胱癌的病理分級及臨床分期的關(guān)系采用χ2和Fisher’s確切概率法統(tǒng)計分析。結(jié)果 在癌旁正常膀胱組織中A1AT和MYH10的陽性表達率分別為10%、0%,而在60例膀胱尿路上皮癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞中,陽性表達率分別為81.7%、60%,膀胱尿路上皮癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞A1AT和MYH10陽性表達率顯著高于癌旁正常膀胱組織(P<0.01)。A1AT和MYH10的陽性表達率在低分級膀胱尿路上皮癌中分別為68%、36%,在高分級膀胱尿路上皮癌中分別為91.4%、77.1%,在非肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌中分別為65%、30%,在肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌中分別為90%、75%。A1AT和MYH10在高分級、肌層浸潤性膀胱癌組織中的陽性表達率明顯高于低分級、非肌層浸潤性膀胱癌組織,2種標記物在膀胱癌的病理分級和臨床分期之間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 A1AT、MYH10在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到重要作用,可作為膀胱尿路上皮癌的新的腫瘤標記物,并為膀胱尿路上皮癌的預(yù)防及診療提供新的靶點。

        膀胱癌;尿路上皮癌;間質(zhì)細胞;A1AT;MYH10;免疫組織化學(xué)

        膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤,且發(fā)病率有逐年增高的趨勢。近年隨著對膀胱癌發(fā)生發(fā)展機理的逐步研究,許多相關(guān)腫瘤標記物被發(fā)現(xiàn)可用于協(xié)助膀胱癌的診療。癌旁間質(zhì)蛋白質(zhì)的改變而引起膀胱腫瘤的機制也成為近年研究熱點,其中在治療方式的選擇和腫瘤預(yù)后評估方面取得了一定的進展[1]。我們應(yīng)用免疫組化方法檢測A1AT、MYH10在膀胱尿路上皮癌癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞表達以探討其與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及臨床意義。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 標本來源于2009年1月至2013年12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科住院行手術(shù)切除病理存檔的60例標本,癌旁正常組織標本10例。其中膀胱全切術(shù)33例,膀胱部分切除術(shù)19例, 經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù) (transurethral resection of bladder tumor,TURBt) 8例。男40例,女20例;年齡32~75歲,平均(58.3±10.5)歲;均為首次發(fā)病且未行任何放化療。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO) 2004分級:低分級25例,高分級35例;國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control,UICC) 2009 TNM分期:非肌層浸潤性膀胱癌(Tis-1)20例,肌層浸潤性膀胱癌(T2-4)40例。

        1.2 試劑 A1AT一抗兔抗人多克隆抗體,MYH10一抗兔抗人多克隆抗體 購自武漢博士德生物公司,SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

        1.3 免疫組化染色方法 根據(jù)試劑盒步驟,標本經(jīng)10%(體積分數(shù))甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)方法連續(xù)切片,厚4 μm,切片經(jīng)二甲苯脫蠟,無水乙醇脫水,自來水沖洗、試劑A封閉阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS水洗后進行抗原修復(fù),滴加一抗4℃過夜,水洗后DAB顯色,蘇木素復(fù)染、乙醇脫水,中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照,染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

        1.4 陽性結(jié)果判斷 由2位副高以上從事免疫組化實驗的醫(yī)師在雙盲的條件下對染色結(jié)果進行評判:ACTN4、A1AT、MYH10陽性為細胞質(zhì)棕黃色顯色。所有染色結(jié)果均采用統(tǒng)一評分標準,評分過程均重復(fù)3次以上,以盡可能減少誤差。在高倍鏡下選取10個不同視野,每視野計數(shù)100個細胞,采用半定量法,觀察陽性細胞染色強度并對陽性細胞百分比進行評分。陽性細胞染色強度評分:無色為0分,淺黃色記為1分,棕黃色記為2分,棕褐色記為3分;按陽性細胞所占百分比評分:0分為無陽性細胞,1分為<25%,2分為25%~50%,3分為>50%;以染色強度和陽性細胞百分比的總積分判斷,總積分<3分判為陰性,3~6分判為陽性[2]。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理,根據(jù)A1AT和MYH10的表達情況與膀胱癌的臨床病理分級及分期的關(guān)系采用χ2和Fisher’s確切概率法進行檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 膀胱癌和癌旁正常組織中A1AT和MYH10的表達情況 A1AT和MYH10在正常組與膀胱癌組的陽性表達率在統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性意義(P<0.01,表1)。表明A1AT和MYH10與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展均有密切關(guān)系。

        表1 正常膀胱組織與膀胱癌組織中A1AT和MYH10陽性表達率比較 [例(%)]

        2.2 膀胱癌組織中A1AT和MYH10蛋白表達與膀胱癌不同病理分級及臨床分期之間的關(guān)系

        2.2.1 A1AT陽性表達與膀胱癌病理分級和臨床分期的關(guān)系 A1AT在低分級和高分級尿路上皮癌組的陽性表達率在統(tǒng)計學(xué)上有意義(P<0.05);在非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌組的陽性表達率在統(tǒng)計學(xué)上有意義(P<0.05)。由此得出A1AT與膀胱尿路上皮癌的惡性程度和浸潤程度具有相關(guān)性(表2)。A1AT在正常組膀胱上皮細胞及間質(zhì)不表達,在高級別尿路上尿癌及間質(zhì)細胞表達較在低級別者中要強(圖1)。

        2.2.2 MYH10陽性表達與膀胱癌病理分級和臨床分期的關(guān)系 MYH10在低分級和高分級尿路上皮癌組的陽性表達率在統(tǒng)計學(xué)上有意義(P<0.05);在非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌組的陽性表達率在統(tǒng)計學(xué)上有意義(P<0.05)。由此得出MYH10與膀胱尿路上皮癌的惡性程度和浸潤程度具有相關(guān)性(表2)。MYH10在高級別尿路上皮癌細胞及間質(zhì)細胞中表達較在低級別者中要強(圖2)。

        表2 A1AT和MYH10蛋白表達與膀胱癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [例(%)]

        圖1 A1AT在膀胱正常組及尿路上皮癌組中的表達(SP,×100)

        A:在正常上皮及間質(zhì)細胞不表達;B:在高分級膀胱尿路上皮癌細胞呈陽性染色;C:在低分級尿路上皮癌細胞呈陽性染色;D:在高分級尿路上皮癌的癌旁間質(zhì)細胞陽性染色;E:在低分級尿路上皮癌癌旁間質(zhì)細胞陽性染色。

        圖2 MYH10在膀胱尿路上皮癌組中的表達(SP,×100)

        A:在高分級膀胱尿路上皮癌細胞呈陽性染色;B:低分級尿路上皮癌細胞呈陽性染色;C:在高分級尿路上皮癌的癌旁間質(zhì)細胞陽性染色;D:在低分級尿路上皮癌癌旁間質(zhì)細胞陽性染色。

        3 討 論

        膀胱癌發(fā)病率高且術(shù)后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,嚴重威脅患者生命。目前對其發(fā)病機制研究仍不明確,近年蛋白質(zhì)組學(xué)研究為生物標記的發(fā)現(xiàn)提供了大量的侯選蛋白,為協(xié)助研究膀胱癌的生物學(xué)特性提供切入點。查閱相關(guān)文獻A1AT、MYH10與多種腫瘤的發(fā)生,轉(zhuǎn)移等有關(guān)。據(jù)報道膀胱癌間質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)癌異質(zhì)性中起到關(guān)鍵性作用。而生物標記的發(fā)現(xiàn)應(yīng)同時在腫瘤細胞及其相應(yīng)的間質(zhì)中進行[3-4]。A1AT、MYH10在膀胱癌癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞中表達說明其可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展等有關(guān)。有關(guān)癌細胞/癌間質(zhì)細胞來源的生物標記已有報道,如在胰腺癌細胞中,RNA干擾技術(shù)敲除CAP1后導(dǎo)致薄片狀偽足結(jié)構(gòu)減少,運動以及侵襲性降低[5],人類脂肪酸合酶(fatty acid synthase,F(xiàn)ASN)為癌基因,抑制FASN可有選擇性有效的殺傷癌細胞[6]。

        A1AT由SERPINA1基因編碼,位于第14號染色體,70位等位基因調(diào)控其合成。是一種由肝臟分泌的糖蛋白,是血清中最主要的蛋白酶抑制劑。A1AT在細胞中發(fā)揮不同的調(diào)控作用,如內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細胞生存、血液凝結(jié)等方面起著很重要的作用。研究認為癌細胞可以通過釋放彈性蛋白酶、纖溶酶和組織蛋白酶等破壞周圍組織,進而局部擴散,而 A1AT 可以抑制這些酶的活性。而其在膀胱腫瘤中表達起到上述作用,進而可以通過抑制其在體內(nèi)表達而達到治療作用。

        本研究中A1AT較少在膀胱正常組織中表達,陽性率為10%(1/10),膀胱癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞中A1AT的陽性表達率為81.7%(49/60),正常組與膀胱癌組的A1AT陽性表達率之間的差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示A1AT與膀胱癌關(guān)系密切。低分級和高分級膀胱癌的A1AT陽性表達率分別為68%和91.4%進一步分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞及間質(zhì)細胞A1AT的陽性表達率隨著膀胱癌的病理分級升高而增高。而MIYAKE[7]的研究認為A1AT在膀胱癌患者尿液蛋白質(zhì)中的監(jiān)測可以為膀胱癌的診斷提供便利條件,其通過免疫組化、免疫蛋白印跡等試驗證明A1AT與膀胱癌患者的病理分級有統(tǒng)計學(xué)意義但與臨床分期不具有統(tǒng)計學(xué)意義,分析原因這可能與本次實驗中選擇的樣本量較小有關(guān),下一步可通過加大試驗入組的樣本量。COAKLEY[8]認為A1AT在肺癌中的表達可能是機體對腫瘤引起組織破壞和腫瘤組織浸潤、擴散的防御反應(yīng)。A1AT的表達水平結(jié)合其在血液中的抑制活力可對肺癌的診療提供一定線索,因此可以進一步預(yù)測A1AT在膀胱癌中的表達可以起到類似的作用。

        MYH10蛋白是肌球蛋白超家族的的一員,由MYH10基因編碼,位于17p13.3染色體。MYH10存在于肌細胞中具有收縮功能,然而在非肌細胞中各種各樣的細胞功能也與肌球蛋白有關(guān)。 哺乳類動物的肌球蛋白10最初被發(fā)現(xiàn)坐落于絲狀偽足的尖端[9-10],在絲狀偽足的形成和延伸[10-11]、細胞吞噬作用[12]、細胞移動[13]等方面有重要作用。

        研究中MYH10在膀胱正常組織中不表達,膀胱癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞中MYH10的陽性表達率為60%(36/60),正常組與膀胱癌組的MYH10陽性表達率之間的差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示MYH10與膀胱癌關(guān)系密切。低分級和高分級膀胱癌的MYH10陽性表達率分別為64%和77.1%,進一步分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞及間質(zhì)細胞MYH10的陽性表達率隨著膀胱癌的病理分級升高而增高,查閱相關(guān)文獻,尚未見到膀胱癌表達MYH10的報道,XIONG等[14]首次報道MYH9在膀胱癌的過表達是早期膀胱癌整體生存率的獨立預(yù)測因子。然而MYH9與MYH10具有同源序列,在某些功能上具有重疊[15],因此聯(lián)系MYH10在非肌細胞中的作用可以推測MYH10在膀胱癌細胞的發(fā)生發(fā)展中可能起到作用。

        本次研究中A1AT、MYH10在膀胱尿路上皮癌癌細胞及癌旁間質(zhì)細胞中表達并與膀胱癌的病理分級和臨床分期有關(guān),可以推測其可能參與了膀胱癌發(fā)生及發(fā)展。腫瘤間質(zhì)為實質(zhì)提供營養(yǎng)支持作用,對腫瘤的發(fā)展起促進作用,而A1AT、MYH10在腫瘤間質(zhì)細胞的表達可進一步證實其在腫瘤中的作用。免疫組化實驗中A1AT、MYH10在膀胱癌的高表達可作為膀胱癌是否具有高浸潤性的指標并且是膀胱癌生物標記的良好侯選蛋白,可為膀胱尿路上皮癌的預(yù)防及診療提供新的靶點。

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        (編輯 何宏靈)

        Expressions and clinical significance of A1AT and MYH10 proteins in human bladder urothelial carcinoma

        CHENG Chong-feng1, XU Ting2, JING Tao3, WANG Pei-tao3, WANG Xin-sheng3, NIU Hai-tao3

        (1.Medical College of Qingdao University, Qingdao 266021; 2.the 401st Hospital of PLA, Qingdao 266071; 3. Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

        Objective To explore the expressions of A1AT and MYH10 proteins in bladder urothelial carcinoma and their correlation with pathological grade or clinical stage of bladder urothelial carcinoma. Methods The expressions of A1AT and MYH10 in carcinoma specimens were detected with immunohistochemical staining (SP) method. The relationship among the A1AT and MYH10 expressions, pathological grade and clinical stage was further analyzed with reference to the clinicopathological data. Chi-square and Fisher’s tests were used for statistical analysis. Results In healthy para-carcinoma tissues, the positive expression rates of A1AT and MYH10 were 10% and 0% respectively, while in carcinoma specimens, their positive expression rate was 81.7% and 60%, respectively, with statistical difference (P< 0.01). The positive expression rates of A1AT in low-grade, high grade, superficial and invasive carcinoma were 68%, 91.4%, 65%, 90%, and the positive expression rates of MYH10 were 36%, 77.1%, 30%, and 75%. The results showed that the positive expression rates of A1AT and MYH10 in the high-grade and invasive bladder urothelial carcinoma were significantly higher than in the low-grade and superficial bladder urothelial carcinoma, with statistical significance (P< 0.05). Conclusions A1AT and MYH10 may play an important role in the occurrence and development of bladder urothelial carcinoma, which can serve as new markers and provide new targets for the prevention and diagnosis of bladder urothelial carcinoma.

        bladder cancer; bladder urothelial carcinoma; stromal cells; alpha-1-antitrypsin(A1AT);myosin-10 (MYH10); immunohistochemistry

        2015-01-26

        2015-03-19

        王新生,教授.E-mail:wangxs@qyfy.cn

        成重峰(1987-),男(漢族),碩士在讀.研究方向:泌尿系腫瘤.E-mail:ccf20121008@126.com

        R737.14

        A

        10.3969/j.issn.1009-8291.2015.06.010

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