張憲利，張 靜，趙鳳娟，趙自國(guó)

（1.濱州學(xué)院 生命科學(xué)系，山東 濱州 256603；2.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603）

索氏提取法提取裂殖壺菌粉油脂參數(shù)的優(yōu)化

張憲利1，張 靜2，趙鳳娟3，趙自國(guó)3

（1.濱州學(xué)院 生命科學(xué)系，山東 濱州 256603；2.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603）

裂殖壺菌作為富含DHA的海洋真菌成為研究熱點(diǎn)，但其干粉的油脂提取效率并不高，索氏提取法是能夠提高油脂得率的方法之一。通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討了兩種不同混合溶劑條件下，提取時(shí)間、藻粉量、水浴溫度等因素對(duì)新舊兩份裂殖壺菌藻粉材料油脂提取的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)分別確定了其最佳提取條件組合：有機(jī)萃取溶劑為1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑，藻粉量1.0g，萃取時(shí)間2.5h，水浴溫度95℃，得到新、舊藻粉的最高粗油脂提取率分別為81.70%和47.43%。在最佳條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的索提方法油脂提取率高，可以有效甄別新舊菌粉，將為裂殖壺菌油脂提取工藝的優(yōu)化及實(shí)際工業(yè)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

裂殖壺菌；油脂；索氏提取；參數(shù)優(yōu)化

1 引言

裂殖壺菌（Schizochytriumsp.）俗稱(chēng)裂壺藻，是一類(lèi)海洋真菌，屬于真菌門(mén)（Eumycota）、卵菌綱（Oomycetes）、水霉 目 （Saprolegniales）、破 囊 壺 菌 科（Thraustochytriaceae），其形態(tài)特征為單細(xì)胞球形。裂殖壺菌目前已成為工業(yè)化生產(chǎn)DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid） 的 重 要 菌 種 來(lái) 源［1］。Schizochytrium細(xì)胞積累大量有用的活性物質(zhì)，如：角鯊烯、色素和油脂等，其油脂含量占細(xì)胞干重的70%以上，主要由甾醇、色素等的不皂化物、極性脂和中性脂組成［2，3］，以甘油三酯為主的中性酯可占90%以上。總脂中DHA的含量高，可達(dá)35%～40%，容易分離純化，且不含魚(yú)油DHA特有的魚(yú)腥味［4］。裂殖壺菌因富含油脂尤其是DHA已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)對(duì)于裂殖壺菌的研究主要集中于菌種選育及對(duì)其培養(yǎng)方式的研究［5，6］、產(chǎn)脂肪酸的代謝機(jī)理研究［7～9］以及對(duì)其脂肪酸的提取方式的探索等方面，尤其下游油脂提取及精煉技術(shù)的研究備受關(guān)注［10，11］。綜合相關(guān)報(bào)道，油脂提取得率因原料及方法差異而呈現(xiàn)明顯差異；但針對(duì)特定菌種材料缺乏對(duì)具體提取工藝參數(shù)的優(yōu)化研究，針對(duì)菌粉材料進(jìn)行的油脂提取研究鮮有報(bào)道。索氏提取法，最早由德國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)家提出，已在生物油脂提取中有普遍的應(yīng)用［12～14］，主要用于粗脂肪含量的測(cè)定，因其節(jié)省提取溶劑，且操作過(guò)程可控性好，具有較好的優(yōu)化潛力和可行性。

本研究利用索氏提取法粗提裂殖壺菌菌粉中的脂質(zhì)，并對(duì)其油脂提取參數(shù)加以優(yōu)化，提出針對(duì)索氏提取真菌油脂提取方法的改良建議，從而為裂殖壺菌油脂提取工藝的優(yōu)化及實(shí)際工業(yè)應(yīng)用提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表1。

表1 藻粉材料信息

2.2 儀器及試劑

儀器：N－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械會(huì)社）、HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）、202－1型電熱干燥箱（濟(jì)南潔康空氣凈化設(shè)備廠）、FA1204B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、索氏提取器、圓底燒瓶、攪拌器、移液管、具塞試管等玻璃容器若干；

試劑：氯仿、甲醇、乙醚、石油醚、正己烷、蒸餾水；1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶液；1∶1等體積石油醚—乙醚混合溶液等。

2.3 方法

2.3.1 樣品處理

分別取一定量新、舊藻粉，裝入燒杯中，置于恒溫干燥箱中于65℃條件下烘干至恒重（標(biāo)準(zhǔn)：兩次之差＜0.0008g）。取出后置于干燥器中待用。

2.3.2 索氏提取法

具體操作流程參照相關(guān)文獻(xiàn)［12，14］。選擇1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶液和1∶1等體積石油醚－乙醚混合溶液兩種不同的溶劑條件下，分別控制提取時(shí)間、藻粉量、水浴溫度等變量，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定其油脂提取的最佳條件組合。

2.3.3 提油率的測(cè)定

采用減重法［15］。其計(jì)算公式為：

式中：P為樣品中粗脂肪的提取率（%）；m2為索氏提取前樣品濾紙筒的質(zhì)量（g）；m3為索氏提取后樣品濾紙筒的質(zhì)量（g）；m1為樣品菌粉中粗油脂的理論含量（g）：菌粉質(zhì)量＊理論粗油脂含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 舊藻粉在兩種不同溶劑條件下的單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 提取時(shí)間對(duì)粗油脂提取率的影響

不同提取時(shí)間條件下粗油脂提取率的變化較大，隨著時(shí)間的增加，提取率逐步提高。然而，1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下，當(dāng)提取時(shí)間為2.5h時(shí)，其粗油脂提取率最高，提取時(shí)間達(dá)到3.0h時(shí)出現(xiàn)了提取率下降的現(xiàn)象。不同提取時(shí)間條件下，溶劑為1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下的粗油脂提取率均明顯高于1∶1石油醚—乙醚混合溶劑（圖1）。

圖1 不同提取時(shí)間對(duì)粗油脂得率的影響

3.1.2 藻粉質(zhì)量對(duì)粗油脂提取率的影響

1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下，藻粉質(zhì)量對(duì)粗油脂提取率的影響較大；粗油脂提取率隨著藻粉量的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；在該設(shè)定條件下，當(dāng)藻粉量為1.5g時(shí)，粗油脂提取率最高；1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下的粗油脂提取率均高于1∶1石油醚—乙醚混合溶劑（圖2）。

圖2 不同藻粉量條件下索氏提取法提取的粗脂得率

3.1.3 水浴溫度對(duì)粗油脂提取率的影響

1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下，粗油脂提取率伴隨水浴溫度的增加而增高，當(dāng)水浴溫度設(shè)定為95℃左右時(shí)，粗油脂提取率最高（圖3）。而1∶1石油醚—乙醚混合溶劑條件下，則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

圖3 不同水浴溫度條件下索氏提取法提取的粗脂得率

通過(guò)各單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑條件下的粗油脂提取率均優(yōu)于1∶1等體積石油醚—乙醚混合溶劑，因此，后續(xù)僅設(shè)計(jì)1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑條件下的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

3.2 氯仿—甲醇混合溶劑條件下舊藻粉的油脂提取正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇藻粉量（A）、提取時(shí)間（B）和水浴溫度（C）為考察因素，進(jìn)行L9（3）3正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，正交實(shí)驗(yàn)情況見(jiàn)表3。

表2 油脂提取條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Ⅰ

表3 舊藻粉油脂提取條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)Ⅱ

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三個(gè)因素對(duì)裂殖壺菌粗脂得率的影響大小是：C＞B＞A，即水浴溫度的影響最大，提取時(shí)間影響其次，藻粉量的影響最小。綜合各因素考慮，最佳的油脂提取條件組合為A1＋B2＋C2，即：有機(jī)萃取溶劑為1∶1等體積氯仿－甲醇混合溶劑，藻粉量1.0g，提取時(shí)間2.5h，水浴溫度95℃時(shí)，粗油脂提取率最高。

將正交試驗(yàn)獲得的粗油脂得率最佳條件組合進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，3次平行實(shí)驗(yàn)得出的提油率平均值為47.43%。

3.3 氯仿—甲醇混合溶劑條件下新藻粉的油脂提取正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

選用新藻粉，同樣進(jìn)行L9（3）3正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)參見(jiàn)表2，正交實(shí)驗(yàn)情況見(jiàn)表4。

表4 新藻粉油脂提取條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)Ⅱ

三個(gè)因素對(duì)裂殖壺菌粗脂得率的影響大小是：C＞A＞B，即水浴溫度的影響最大，藻粉質(zhì)量影響其次，提取時(shí)間的影響最小。綜合各因素考慮，最佳的油脂提取條件組合為A1＋B2＋C2，即：藻粉量1.0g左右，提取時(shí)間2.5h，水浴溫度95℃的提取條件下，粗油脂提取率最高。

將正交實(shí)驗(yàn)獲得的最佳提取條件的組合進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，3次平行實(shí)驗(yàn)得出的提油率平均值為81.70%。

3.4 新舊藻粉粗油脂提取率的比較

通過(guò)新舊藻粉的正交實(shí)驗(yàn)，比較其各自在最佳提取條件組合下的粗油脂得率，發(fā)現(xiàn)新藻粉的粗油脂提取率（81.70%）明顯高于舊藻粉（47.43%）；但新舊藻粉二者的最佳提取條件組合相同。

4 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)索氏提取方法從裂殖壺菌干藻粉提取油脂。在兩種不同的等體積混合溶劑下，分別以提取時(shí)間、藻粉量和水浴溫度為單因素控制條件，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出其粗油脂提取率，進(jìn)而通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出最佳的油脂提取參數(shù)組合，實(shí)現(xiàn)對(duì)索氏提取法提取條件的優(yōu)化，并將其用于藻粉鑒別。

萃取有機(jī)溶劑為1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑，藻粉量1.0g左右，提取時(shí)間2.5h，水浴溫度95℃時(shí)，粗油脂提取率最高，可達(dá)81.7%，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其的技術(shù)優(yōu)化。當(dāng)萃取有機(jī)溶劑為1∶1等體積石油醚—乙醚混合溶劑時(shí)，各項(xiàng)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不及前者。分析可能是該組合的沸點(diǎn)較低，而水浴溫度過(guò)高時(shí)容易造成乙醚的過(guò)度揮發(fā)，使混合溶劑不呈現(xiàn)1∶1等體積混合，對(duì)提取造成不良影響。

新舊藻粉分別在各自的最佳提取條件組合下，新藻粉的粗油脂提取率（81.70%）明顯高于舊藻粉（47.43%），可通過(guò)索氏提取比較藻粉的油脂得率來(lái)甄別新舊藻粉。分析原因可能是舊藻粉放置時(shí)間太長(zhǎng)，加之發(fā)酵培養(yǎng)基不同，菌種組成可能存在差異，也可能與不同批次的菌粉添加比例不同有關(guān)。

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Optimization the Parameter of Grease Extraction From Schizochytrium Limacinum Powder Based on Soxhlet Method

Zhang Xianli1，Zhang Jing2，Zhao Fengjuan3，Zhao Ziguo3
（1.DepartmentofLifeSciences，BinzhouUniversity，Binzhou256603，China；2.CollegeofMarineLife，OceanUniversityofChina，Qingdao266003，China；3.EngineeringTechnologyResearchCenterofDevelopment andUtilizationofWildPlantResourcesinYellowRiverDeltainShandongProvince，Binzhou256603，China）

Schizochytrium has become one of the research hotspots of marine fungi for its high contents of DHA，while the oil grease extraction efficiency of schizochytrium powder is not high.The soxhlet extraction method is recognized as an effective way to improve the extraction efficiency.Under the condition of two mixed solvent，the article discusses the effect of extraction time，amount of powder and temperature on grease extraction from the new and old schizochytrium powder.In addition，the optimal extraction condition has been determined through the experiment and the orthogonal experiment.The results show that when the organic solvent is mixed by equal volume of chloroform and methanol，the amount of algae powder is 1.0g，extraction time is 2.5h，and temperature is 95℃，the extraction rate of grease is the highest，being 81.70%for new and 47.43%for old powder material.Through repeated experimental verification under the optimal condition，the article finds out that this optimized processing is effective in improving grease extraction rate and powder discrimination，which will provide useful references for grease extraction and future industrial application.

schizochytrium limacinum；grease；soxhlet extraction；parameter optimization

TS224

A

1674－9944（2015）08－0294－04

2015－06－17

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201310449125）；山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2011DL012）；濱州學(xué)院科研項(xiàng)目（編號(hào)：2012ZDL04；BZXYFB20130706）資助

張憲利（1992—），男，山東泰安人，濱州學(xué)院生命科學(xué)系大學(xué)生。

趙鳳娟（1981—），女，山東青州人，副教授，博士，主要從事海洋生物技術(shù)研究。