金洪波，魯 龍，畢生雷，尹永磊，喬建援，劉 鉞，杜風光

（河南天冠企業(yè)集團有限公司，河南南陽 473000）

小球藻的培養(yǎng)方法包括異養(yǎng)、自養(yǎng)、混養(yǎng)3種。小球藻在異養(yǎng)時使用常規(guī)發(fā)酵罐進行培養(yǎng)［1］，與自養(yǎng)相比具有能夠與其他生化生產(chǎn)設(shè)備通用、空間利用效率高、生產(chǎn)效率高等的特點，受到業(yè)內(nèi)人士的廣泛關(guān)注。在異養(yǎng)條件下，小球藻利用葡萄糖、木薯粉等碳源以及酵母粉、蛋白胨等氮源［2］進行培養(yǎng)，由于營養(yǎng)物質(zhì)豐富，容易受到環(huán)境中桿菌、霉菌、酵母菌的污染［3］。河南天冠企業(yè)集團有限公司通過添加500 mg/L的安菌素等抑菌劑，成功克服了染菌的問題，使受到污染的小球藻發(fā)酵能夠繼續(xù)下去，且最終發(fā)酵結(jié)果相差不大［4］;并利用半連續(xù)發(fā)酵工藝將發(fā)酵速率升至 10.37 g/(L·d)，最終干重高達 140.5 g/L［5］。據(jù)報道，固定化技術(shù)的使用也使小球藻的培養(yǎng)水平有一定的提高［6］。

使用藻類制備生物柴油，由于其環(huán)保、可再生等特點，成為目前研究的熱點。藻類制備生物柴油主要是使用乙醇等短鏈醇，在加熱、催化的條件下，與藻細胞內(nèi)油脂發(fā)生酯化反應(yīng)合成生物柴油［7］。目前，使用發(fā)酵液、藻泥、藻粉制備生物柴油［8］。研究表明，使用正已烷等有機物質(zhì)均可以將生物柴油從酯化液中提取出來［9］。但是，使用正已烷并不能將油脂完全萃取出來。因此，筆者使用氯仿作為萃取劑，研究其對生物柴油的萃取效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 536.3 g/L小球藻酯化液由天冠集團車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室發(fā)酵法提供;氯仿為分析級，購于天津科密歐公司;JOYN-SXT-04脂肪測定儀購于上海喬躍公司;G12高速離心機購于長沙英泰儀器公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購于瑞士BUCHI公司;電子天平購于梅特勒公司;玻璃量筒購于四川蜀牛;分液漏斗購于四川蜀牛。

1.2 試驗方法

1.2.1 萃取。每次取100 ml酯化液，先離心棄上清液，固體部分按比例加入氯仿混勻。萃取后離心，反復3次，取上清液部分進行蒸餾。

1.2.2 蒸餾。將萃取的油相裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在壓強-30×105Pa、溫度60℃條件下進行蒸餾;蒸餾結(jié)束后稱量生物柴油重量。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。采用SPASS13.0進行試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

選取萃取溫度(40、60、80 ℃)、萃取時間(30、60、90 min)、萃取劑添加量(2、3、4 ml/g)進行3因素3水平正交試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平

由表2和3可知，萃取溫度試驗極差和F值最大，可以認為萃取溫度是影響氯仿萃取效果的主要因素;其次是萃取時間的極差和F值，可以認為萃取時間對于萃取效果影響也比較大;萃取劑添加量極差和F值最小，所以萃取劑用量不是影響萃取效果的主要因素。由表2可知，溫度80℃、萃取劑添加量2 ml/g、萃取時間30 min時萃取效果最好。

由表2中K值可以看出，溫度升至80℃時，萃取效果更好一些，可以根據(jù)萃取劑揮發(fā)程度來適當提高萃取溫度;萃取劑添加量為3 ml/g時效果最好;隨著萃取時間的延長，而萃取效果反而下降。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

3 結(jié)論

用氯仿萃取小球藻生物柴油試驗的3因素中，萃取溫度是影響萃取效果的主要因素，溫度為80℃時效果最好，是否進一步提高溫度可根據(jù)萃取劑揮發(fā)情況和萃取得油的情況來進一步確定;隨萃取時間的延長，萃取效果反而下降，這可以提高工作效率;萃取劑添加量以3 ml/g為宜，氯仿的使用量并不是越高萃取效果越好，這可以降低損耗和成本。

［1］畢生雷，喬建援，劉鉞，等.異養(yǎng)小球藻用發(fā)酵罐的使用與維護［J］.化學工程與裝備，2014(7):25.

［2］鄭世文，趙玉峰，畢生雷.不同型號酵母浸粉及補糖對異養(yǎng)微藻生長的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014(8):178 -179.

［3］金洪波，畢生雷，喬建援，等.異養(yǎng)小球藻發(fā)酵染菌問題的探析(英文)［J］.Agricultural Science ＆ Technology，2014(12):12.

［4］畢生雷，張成明，金洪波，等.抑菌劑在異養(yǎng)小球藻發(fā)酵過程中的應(yīng)用［J/OL］.食品與發(fā)酵工業(yè)，http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20150122.1431014.html.

［5］畢生雷，張成明，李十中，等.異養(yǎng)小球藻半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)油脂工藝探討［J］.食品與發(fā)酵科技，2014，50(5):36 -40.

［6］畢生雷，張成明，李十中，等.固定化技術(shù)在生物能源及環(huán)境工程領(lǐng)域的研究和應(yīng)用進展［J］.釀酒科技，2015(1):102-105.

［7］畢生雷，張成明，李十中，等.乙醇在微藻產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用［J］.釀酒科技，2015(1):73-76.

［8］河南天冠企業(yè)集團有限公司.一種一步法制生物柴油的方法:中國，CN201410093691.4［P］.2014 -07 -09.

［9］金洪波，畢生雷，尹永磊，等.用正己烷萃取小球藻油條件的優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2015(5):206-207.