尹春華，韓燁，呂樂，許倩倩，閆海

（北京科技大學化學與生物工程學院生物科學與工程系，北京100083）

引 言

蝦青素 （3，3′－二羥基－4，4′－二酮基－β－胡蘿卜素），是最早從河螯蝦外殼、牡蠣和鮭魚中發(fā)現的一種紅色類胡蘿卜素。蝦青素是自然界抗氧化性最強的物質，其抗氧化能力是維生素E的1000倍，有 “超級維生素E”之稱［1］，可有效清除細胞內的氧自由基［2］，具有增強細胞再生能力、保護細胞和DNA的健康［3］，維持機體平衡等功能［4］。并且蝦青素是唯一能通過血腦屏障的抗氧化劑［5］，可抑制腦血栓的形成。目前蝦青素已廣泛應用于食品生產、水產養(yǎng)殖、醫(yī)療保健和化妝品等領域。但是，蝦青素化學性質極不穩(wěn)定，對熱、氧、自然光和紫外線敏感，容易發(fā)生氧化而降解，這給蝦青素的儲存、使用等帶來很多不便［6］。蝦青素酯化可彌補蝦青素在這一方面的不足，許多研究表明蝦青素酯不僅具有蝦青素的生理活性，而且隨著修飾基團的加入，賦予了蝦青素酯一些新的功能性質［7－8］，如蝦青素脂肪酸酯更易被小腸吸收，蝦青素辛酸單酯和二酯在肝組織中具有更高的累積速率［8］。

目前，蝦青素酯主要由化學法合成［9］，采用堿金屬烷醇鹽等有機堿為催化劑，酰氯為?；噭?，反應過程復雜，污染大，反應溫度高 （80～120℃），反應過程中蝦青素易受熱異構化或降解降低反應產率，產物的分離純化復雜且產品的生物活性不高。與化學合成法相比，酶法合成具有反應條件溫和、催化效率高、催化專一性強等優(yōu)點［8，10－12］。Sumida等［8］研究了酶法催化蝦青素中鏈脂肪酸酯的合成。反應以辛酸和蝦青素為底物，2 mg蝦青素在80mg脂肪酶催化下，反應進行3d后單酯的生成率不到10%。他們也嘗試了將辛酸換成月桂酸和癸酸，但反應產率均不高，沒有實際應用價值。本文以蝦青素和琥珀酸酐為底物，嘗試酶法合成蝦青素短鏈酯——蝦青素琥珀酸酯，研究并優(yōu)化了其合成條件。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

蝦青素，純度95.3%，購于Dr.Ehrenstorfer公司。假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase），北京化工大學贈送。色譜流動相甲醇、乙腈為色譜純，分別購于Dikma technologies公司和Dima technology公司。其他試劑皆為分析純，購于國藥集團化學試劑北京公司。

1.2 分析測試儀器。

高效液相色譜儀，日本島津公司LC－20A （配SPD－M20A二極管陣列檢測器）。液相色譜質譜聯用儀 （waters UPLC－MS Xevo G2QTOF），美國waters公司。

1.3 蝦青素琥珀酸酯的合成

往25ml具塞錐形瓶中加入5ml DMSO （二甲基亞砜），適量的蝦青素和琥珀酸酐，待兩底物完全溶解后，加入適量脂肪酶搖勻，蓋好瓶塞，外用兩層錫箔紙包好避光置于轉速為200r·min－1的恒溫搖床中反應，適時取樣分析，檢測蝦青素轉化率。文中蝦青素轉化率定義為酯化反應過程中蝦青素減少量與反應前蝦青素總量的百分比，每次實驗重復3次，取平均值。為了排除蝦青素降解率 （與溫度有關，5%左右）對轉化率的影響，每次實驗均做相應空白對照，校正轉化率。

1.4 脂肪酶酶活的定義和測定方法

采用橄欖油乳化液水解滴定法測定［13］。酶活定義：脂肪酶在37℃，pH8.0水解橄欖油乳化液每分鐘產生1μmol的脂肪酸所耗用的酶量，即為1個脂肪酶活力單位。

1.5 蝦青素琥珀酸酯的分析方法

蝦青素琥珀酸酯定性分析采用液相色譜質譜聯用法：色譜質譜儀為waters UPLC－MS Xevo G2 QTOF，質譜采用電噴霧電離 （ESI）。色譜柱為BEH C18 （100mm×2.1mm，1.7μm），流動相為色譜純甲醇－乙腈 （體積比為9∶1），流速0.4 ml·min－1。

蝦青素轉化率的定量檢測采用HPLC法。檢測條件為［14］：色譜柱為Diamonsil C18柱 （250×4.6mm，5μm）。流動相為色譜純甲醇－乙腈 （體積比為9∶1），檢測器為島津20A二極管陣列檢測器，檢測波長475nm，流速1.0ml·min－1，進樣量20μl。定量計算為外標法。

2 實驗結果與討論

2.1 蝦青素酯的檢測與定性

蝦青素分子結構兩端各有一個羥基 （—OH），每一個羥基都可以與羧基脫水反應生成酯基。圖1是Candidasp.脂肪酶催化蝦青素和琥珀酸酐反應樣品典型色譜圖。相對于不加酶空白對照 （色譜圖未列出），樣品中多出現了兩個色譜峰 （峰1，峰2），推測應該是酯化產物蝦青素單琥珀酸酯和蝦青素二琥珀酸酯。進一步采用色譜質譜聯用儀檢測分析，測得色譜峰1，峰2的負離子質譜的最大荷質比 （m／z）分別為795.4108，695.3957，而蝦青素二琥珀酸酯和蝦青素單琥珀酸酯負離子掃描最大質荷比理論計算值分別為795.4128和695.3948，誤差均小于5×10－6?？梢娚V峰1是蝦青素二琥珀酸酯，而色譜峰2是蝦青素單琥珀酸酯。實驗結果表明酶法催化蝦青素琥珀?；缮蓡午晁狨ズ投晁狨?。

圖1 蝦青素酯化反應產物HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of succinylation products from astaxanthin

2.2 酶的篩選

分別以足量的固定化酶Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM，Novozym 435和游離假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）為催化劑，在各酶適宜的反應溫度下以1mg蝦青素 和100mg琥珀酸酐為底物，5ml二甲基亞砜 （DMSO）為反應溶劑，反應48h，取樣測定蝦青素轉化率，用以評價各脂肪酶催化蝦青素琥珀?；男Ч?（表1）。實驗結果表明Lipozyme RM IM和Novozym 435脂肪酶催化本反應的活力極低，尤其是Lipozyme RM IM催化反應48h后檢測不到產物生成。Lipozyme TL IM雖能催化反應發(fā)生，但反應產率不高。假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）作為催化劑，在所測試脂肪酶中催化效率最高。而且由于假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）是國產粗酶，來源方便、成本低廉，故本文選定Candidasp.脂肪酶為合成蝦青素琥珀酸酯的催化劑進行下一步研究。

表1 不同脂肪酶合成蝦青素琥珀酸酯Table 1 Enzymatic synthesis of astaxanthin succinates using different lipases

2.3 脂肪酶反應體系

表2 有機溶劑對蝦青素酯化的影響Table 2 Effect of organic solvents on astaxanthin esterification

有機相酶促反應中有機介質性質尤其是其親疏水性是影響催化效果的關鍵因素。有機溶劑直接影響反應體系中底物濃度、傳質速率，而且有機溶劑可奪走吸附在酶分子表面的必需水，打斷氫鍵，破壞酶的活性構象從而影響酶的活性和穩(wěn)定性［15］。大量研究表明有機溶劑對酶活的影響與溶劑極性密切有關［16－17］，Laane等［18］認為極性參數logP （有機溶劑在正辛醇／水體系中分配系數的對數）可描述溶劑的極性與酶活的關系，認為logP＜2的極性較強的有機溶劑不適合作脂肪酶催化反應的介質［18－19］。表2為常用代表性有機溶劑作為反應介質對蝦青素琥珀酸酯合成的影響。結果表明logP值顯然不能用來判斷溶劑對Candidasp.酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的影響。在疏水性溶劑正己烷和石油醚反應體系中，檢測不到酯的生成，主要原因應是琥珀酸酐在這些溶劑中幾乎不能溶解，無法與另一底物蝦青素充分接觸。以N，N－二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜 （DMSO）為反應介質，轉化率較高。這可能與這兩種有機溶劑特殊的物化性質有關，它們既可以溶解親水性物質，又可以溶解疏水性物質，對蝦青素和琥珀酸酐這兩種底物都有很好的溶解度。但是丙酮同為非質子極性溶劑，對這兩種底物的溶解度也很好，而且logP值比DMF，DMSO大，反應產率卻不高，其中原因還需進一步研究。

2.4 溫度

溫度是影響酶催化作用的主要因素之一。隨著溫度的升高，化學反應速度加快；另一方面，過高的溫度會引起酶的變性失活。而且本反應中底物蝦青素化學性質極不穩(wěn)定，過高的反應溫度會導致其降解變性，影響反應最終轉化率。在不同反應溫度下，將1mg的蝦青素和0.1g琥珀酸酐溶于5ml DMSO中，分別加入0.2gCandidasp.脂肪酶反應，并設置不加酶的空白對照以考察溫度對蝦青素降解的影響。反應結果見圖2。在溫度較低 （45℃以下）時，蝦青素的轉化率隨溫度的升高而升高。比較45℃和50℃下反應進程可見：雖然50℃反應初速度較快，達到平衡所需時間短，但其最終轉化率和45℃卻沒有明顯差異。究其原因，應該是該酶50℃開始明顯失活導致。不加酶空白對照實驗表明 （數據未列出），45℃下蝦青素的降解率不到8%，而50℃度時蝦青素的降解率升至15%。綜合轉化率和降解率兩者考慮，該酶促反應溫度45℃比較適宜。

圖2 反應溫度對蝦青素酯化的影響Fig.2 Effect of temperature on astaxanthin esterification（Reaction conditions：1mg astaxanthin，100mg succinic anhydride，5ml DMSO，0.2g Candidasp.lipase）

2.5 摩爾比

由于蝦青素價格昂貴，酯化反應中應使蝦青素轉化相對完全，理論上這可加大琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比來實現。圖3是底物摩爾比對蝦青素的轉化率的影響，結果表明摩爾比是此反應的關鍵因素。當琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比低于40時，檢測不到酯化產物，說明酯化反應基本不能進行。底物摩爾比大于40，酯化反應才能發(fā)生而且蝦青素的轉化率隨摩爾比的升高而升高，兩者摩爾比為800時，轉化率可達90%以上，摩爾比升至1200時，蝦青素接近于反應完全 （99.1%）。這與文獻報道蝦青素中鏈酯的合成 （底物摩爾比在30以上酯化才能發(fā)生）相一致［8］，可見對于酶催化，蝦青素的羥基活潑性還不夠高，需要在高摩爾比下酯化才能進行。底物摩爾比不僅影響轉化率，也影響產物組成（表3）。在低摩爾比情況下，主要生成的是單酯，高摩爾比下才有較多的二酯生成。推測該反應機理，可能是串聯反應，蝦青素的一個羥基先酯化生成單酯，在高琥珀酸酐濃度下，單酯的另一個羥基再酯化生成二酯，其具體反應機理還需進一步研究。

表3 底物摩爾比對蝦青素酯化反應產物分布的影響Table 3 Effect of substrate molar ratios on esterification products from astaxanthin

2.6 含水量的影響

在有機相酶催化反應，微量水的存在對酶維持其活性構象至關重要，絕對無水的體系中酶表現不出活性，而且反應體系中的水還影響酯化反應的化學平衡，有時需要采取一些措施去除反應中產生的水［20］。催化中水對反應的影響不僅與酶有關，而且與反應體系有關［21］。Sumida等［8］在非極性溶劑正己烷中合成蝦青素中鏈脂肪酸酯研究中發(fā)現，加入適量的水 （0.5%～20%）能極大地提高蝦青素酯的生成率。為了考察蝦青素琥珀酸酯酶促合成中體系含水量對反應的影響，先將DMSO脫水處理（加入無水Na2SO4靜置過夜），然后以1mg蝦青素和134mg琥珀酸酐 （即兩者摩爾比為1∶800）為反應底物，脫水后DMSO作為酯化反應介質，分別加入不同的水量，0.2g脂肪酶，45℃條件下反應48h，檢測蝦青素的轉化率。如圖4所示，當反應體系中含水量達到0.5%時蝦青素轉化率最高，比文獻報道蝦青素中鏈酯合成所需水量偏低［8］。這主要可能是由于所用酶不同，而且本研究采用的?；噭┦撬狒c文獻中采用的羧酸不一樣。

圖3 底物摩爾比對蝦青素酯化反應的影響Fig.3 Effect of substrate molar ratios on astaxanthin esterification

圖4 體系含水量對蝦青素酯化的影響Fig.4 Effect of water content in system on astaxanthin esterification

2.7 反應加酶量的影響

以1mg蝦青素和134mg琥珀酸酐為底物（摩爾比為1∶800），以5ml DMSO為反應介質，加入不同量脂肪酶45℃下反應48h后檢測蝦青素的轉化率，實驗結果如圖5所示。脂肪酶含量為0.2g時，蝦青素轉化率達到最高，加大脂肪酶用量，蝦青素轉化率不升高反而略有下降。究其原因主要是由于過多的脂肪酶在反應體系中分散不好，容易成團，這點在實驗過程中可觀察到。故0.2g脂肪酶為本合成條件下催化劑最佳用量。

圖5 酶量對蝦青素酯化的影響Fig.5 Effect of lipase amount on astaxanthin esterification

3 結 論

采用假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）成功地對蝦青素琥珀?；铣闪宋r青素琥珀酯。實驗表明酶和反應介質、底物摩爾比是該酶促反應的關鍵因素：在所考察的幾種酶源中，假絲酵母脂肪酶（Candidasp.lipase）的催化活性最高；DMSO為最合適的反應介質。底物摩爾比不僅決定了蝦青素的轉化率，而且決定了產物的組成，琥珀酸酐和蝦青素摩爾比低于40，酯化反應不能發(fā)生，低摩爾比下產物中只有單酯，摩爾比大于150時產物中才出現二酯。同化學法相比，生物酶法合成維生素E酯具有反應條件溫和、環(huán)境友好、產品色澤好等優(yōu)點，符合綠色化學發(fā)展方向，具有很好的開發(fā)應用前景。本文反應產物為蝦青素單酯和二酯的混合物，影響這兩種產物的相對含量的因素，以及這兩種酯的穩(wěn)定性及生理功能還需要進一步研究。

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