向莉琳，李 巍，武 欣，王新春，簡炎林*

(1.深圳市第三人民醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518112；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

維藥菊苣提取物對Balb/c小鼠肝纖維化的治療作用研究

向莉琳1，李 巍1，武 欣1，王新春2，簡炎林1*

(1.深圳市第三人民醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518112；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

目的 探討維藥菊苣正丁醇提取物（CGB）抗雄性小鼠肝纖維化的治療作用。方法 采用刀豆凝集素（Con A）在Balb/c雄性小鼠誘導(dǎo)肝纖維化，造模成功后第6周分別用低劑量 （100 mg/kg）和高劑量 （500 mg/kg）CGB干預(yù)治療，并以秋水仙堿（0.1 mg/kg）做陽性對照。治療第10周處死小鼠留取肝臟組織和血清，比較各組小鼠肝功能、關(guān)鍵性肝纖維化指標(biāo)。病理分析肝臟組織變化和TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)因子表達差異。結(jié)果 與模型組比較，CGB治療組的肝功能指標(biāo)（ALT，AST）和血清肝纖四項指標(biāo)（PC-Ⅲ、CIV、LN和HA）指標(biāo)不同程度降低（P＜0.05）；肝組織TGF-β1蛋白表達下降，Smad7蛋白表達升高（P＜0.05）。肝臟組織病理顯示，不同劑量CGB治療均能一定程度上減緩小鼠肝纖維化的發(fā)展。結(jié)論 CGB具有抗肝纖維化的活性，影響TGF-β1/ Smad信號通路可能是其潛在的抗肝纖維化作用機制。

菊苣；肝纖維化；刀豆凝集素；TGF-β1蛋白；Smad7蛋白

肝纖維化作為多種慢性肝臟疾病晚期惡化至肝硬化的中心環(huán)節(jié)，是繼發(fā)于肝臟炎癥或組織修復(fù)過程中細胞外基質(zhì)蛋白 （extracellular matrixc，ECM）合成增多和成分改變導(dǎo)致的過度沉積而形成的病理性改變。隨著對肝纖維化發(fā)生機制研究的不斷深入，研究證明轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)通過促進肝成纖維細胞的增殖，激活成纖維細胞的聚集，調(diào)控膠原蛋白、蛋白多糖等ECM的合成和代謝，在肝纖維化發(fā)展過程起關(guān)鍵作用[1]。維藥菊苣又名藍菊，源自菊科菊苣屬的一年生草本植物毛菊苣 (Cichorium glandulosum Boiss)，廣泛分布于歐亞等地區(qū)。其根莖及種子系我國西北少數(shù)民族常用藥材，具開通阻滯、利尿、消腫、清熱的作用[2]。近年來隨著天然產(chǎn)物分離技術(shù)的快速發(fā)展，菊苣根及種子的提取物在抗腫瘤、抗炎性反應(yīng)和保肝等作用獲得廣泛關(guān)注[3-5]。實驗研究表明維藥菊苣全草的脂溶性提取物(CGB)富含三萜類、黃酮類化合物，水溶性提取物(CGW)富含糖類，均能起到抗肝纖維化的作用，但藥理藥效的作用機制存在明顯差異，有待進一步研究[6]。

本實驗旨在通過建立刀豆凝集素Con A誘導(dǎo)所致的Balb/c雄性小鼠肝纖維化模型，并以CGB為研究對象，觀察其對阻斷小鼠纖維化的的作用及對肝TGF-β1和Smad7蛋白表達的影響，探討潛在的抗纖維化作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級Balb/c雄性小鼠60只，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于深圳市第三人民醫(yī)院動物實驗公共服務(wù)平臺,許可證號:SYXK（粵）2012-0120。小鼠在實驗過程中均自由攝食，動物飼養(yǎng)房保持恒定溫度24℃，光照時間按照日照時間隨晝夜變化。

1.2 藥物與試劑

CGB(主成分為倍半萜內(nèi)酯類和黃酮類成分，由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院饋贈)，秋水仙堿片(西雙版納藥業(yè)有限公司)，Con A(25 mg/支，美國Sigma公司)。PC III、CIV、LN和HA ELISA試劑盒[基爾頓生物科技（上海）有限公司]，ALT和AST測試盒(南京建成生物工程研究所)，TGF-β1和Smad7抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 主要儀器

STP-120脫水機(德國Microm)；KD-BM包埋機(浙江科迪)；HM355S型全自動石蠟切片機 （美國Thermo Scientific）；Cryotome FE切片機 (英國Sandon)；BH2顯微鏡 （日本Olympus）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific)。

2 方法

2.1 造模與分組

60只小鼠中隨機取出10只作為正常組。剩余小鼠按經(jīng)尾靜脈注射 Con A 15 mg/kg造模[7]，每周1次，連續(xù)6周。第6周后將剩余存活的40只小鼠應(yīng)用隨機數(shù)字表分組法分為4組，每組10只。陽性對照組給予秋水仙堿0.1 mg/kg，CGB高、低劑量組的給藥量分別為100、500 mg/kg[4]。灌胃體積均為0.5 mL/10 g，正常組和模型組均經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水。每日1次，連續(xù)4周。給藥期間繼續(xù)造模至第10周末。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般情況觀察 觀察小鼠一般狀況如飲食變化、行為、皮膚黏膜顏色改變和體質(zhì)量等。

2.2.2 生化指標(biāo)的檢測[8]各組小鼠均于第10周末處死，采用眼眶法取血，靜置2 h后3 500 r/min離心10 min，分離血清，血清作生化及肝纖維化指標(biāo)的測定用，-20℃冰箱保存。多功能酶標(biāo)儀檢測肝功能 ALT和 AST指標(biāo)，ELISA法檢測肝纖維化HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ指標(biāo)。

2.2.3 肝臟病理組織學(xué)觀察 小鼠肝臟取出后用PBS沖洗去雜質(zhì)，在肝左葉最大截面處取組織置于4%多聚甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，做好標(biāo)記，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變，并按照中華肝臟病學(xué)會提出的肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)對肝臟切片進行纖維化程度評估[9]。具體為:0:無肝纖維化；Ⅰ:輕度膠原纖維增生；Ⅱ:膠原纖維明顯增多，在匯管區(qū)以及中央靜脈部位有明顯增加的膠原纖維，大致呈星形向外側(cè)發(fā)散延伸，但是并沒有纖維間隔形成；Ⅲ:小葉內(nèi)偶見纖維膠原間斷，纖維增加嚴重，纖維間隔形成，但是互相之間沒有形成連接的纖維隔斷；Ⅳ:肝臟中有大部分形成彼此相連的纖維間隔，分割肝實質(zhì)伴隨肝小葉結(jié)構(gòu)的紊亂。

2.2.4 TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)因子檢測 免疫組化染色法檢測TGF-β1、Smad7蛋白表達水平。肝左葉切片30 mL/L過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，室溫封閉后分別滴加兔抗小鼠TGFβ1抗體（1∶500）、單克隆 Smad7抗體（1∶100），4℃過夜，PBS洗滌后DAB顯色，在Olympus BH2顯微鏡下采集圖像，以運用IPP 6.0軟件對圖片作半定量分析，測定平均光密度值。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量資料用“±s”表示，不同治療組與模型組之間比較采用One-way ANOVA（單因素方差分析）和獨立t檢驗進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 CGB對小鼠一般情況的影響

完成實驗后，正常組小鼠生長狀態(tài)良好，體質(zhì)量有明顯增長，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤。模型組小鼠與正常組小鼠相比，生理機能明顯被破壞，存在毛色灰暗，無光澤，反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。治療組小鼠經(jīng)CGB各劑量治療后，小鼠食欲正常，活動狀態(tài)明顯改善，體質(zhì)量增長速度明顯高于模型組，與正常組基本一致。從體質(zhì)量外觀變化與活動能力說明各CGB治療組存在明確的治療作用。

3.2 CGB對肝纖維化小鼠肝臟病理學(xué)改變的影響

按肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn)對各個組肝纖維化進行了評分、比較，如表1。HE染色結(jié)果顯示模型組Con A造成肝纖維大量增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝臟功能受損，纖維化程度分級為為Ⅲ和Ⅳ。各治療組與模型組比較，部分消除肝纖維的增生后，肝竇明顯，肝細胞胞質(zhì)均勻，水腫明顯減輕。

表1 CGB對Con A致肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)影響 (n=10)

圖1 CGB對Con A致肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)改變光鏡圖（HE，×100）

3.3 CGB對小鼠血清中ALT，AST的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT，AST活性顯著升高(P＜0.01)，提示造模成功。與模型組比較，CGB高、低劑量組和秋水仙堿組小鼠血清中ALT、AST活性顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，提示藥物有預(yù)防肝纖維化作用，其中，500 mg/kg CGB治療組效果最好、活性最高。結(jié)果見表2。

3.4 CGB小鼠肝纖化四項的影響

表2 CGB對Con A致肝纖維化小鼠血清ALT和AST的影響 (n=10，±s)

表2 CGB對Con A致肝纖維化小鼠血清ALT和AST的影響 (n=10，±s)

注:與正常組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。

組別正常組模型組秋水仙堿組CGB低組CGB高組劑量(mg/kg) --0.1 100 500 ALT（IU/L）47.01±14.11 142.7±34.51##96.53±17.39*102.5±15.28*78.31±9.76**AST（IU/L）192.8±17.77 368.2±61.56##288.4±46.35*276.4±31.76*222.4±24.38**

模型組與正常組小鼠血清中HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量相比存在顯著性差異(P＜0.01)，提示造模成功。造模8周后，CGB高、低劑量組和秋水仙堿組的HA，LN，PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量均低于模型組，存在顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，其中CGB高劑量組與模型組間存在非常顯著性差異(P＜0.01)，結(jié)果見表3。

表3 CGB對Con A致肝纖維化小鼠血清HA，LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ的影響 (n=10，±s)

表3 CGB對Con A致肝纖維化小鼠血清HA，LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ的影響 (n=10，±s)

組別 劑量(mg/kg)正常模型秋水仙堿CGB低CGB高--0.1 100 500 HA (ng/mL) 129.5±11.1 302.8±43.0##245.5±57.0*224.6±29.4*147.5±47.3**LN (ng/mL) 532.3±48.0 729.5±86.6##642.8±44.8*669.2±31.3*602.3±75.4*PC-Ⅲ(μg/mL) 17.83±4.79 66.42±14.88##24.51±6.63*18.42±2.55*16.72±1.93**C-Ⅳ(ng/mL) 8.53±1.44 23.81±5.11##16.17±2.45*15.31±2.74*12.45±1.68**

3.5 CGB對小鼠肝組織中TGF-β1、Smad7蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組TGF-β1吸光度明顯增強(P＜0.01)；高低劑量的CGB治療組和秋水仙堿組作用4周后，TGFβ1蛋白表達均較模型組降低 (P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組減少較為明顯。Smad7的蛋白表達，正常組的明顯高于模型組(P＜0.01)；高低劑量的CGB治療組和秋水仙堿組均較模型組升高(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組增加較為明顯。結(jié)果見表4。

表4 CGB對Con A致肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1、Smad7蛋白表達水平的影響 (n=10，±s)

表4 CGB對Con A致肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1、Smad7蛋白表達水平的影響 (n=10，±s)

組別正常模型秋水仙堿CGB低CGB高劑量(mg/kg) --0.1 100 500 TGF-β10.121±0.016 0.181±0.037##0.163±0.017*0.149±0.024*0.126±0.019**Smad7 0.118±0.011 0.058±0.004##0.082±0.003*0.077±0.005*0.106±0.013**

4 討論

目前針對維藥菊苣保肝作用的研究較多，但主要集中于對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化和急性酒精肝損傷治療作用。與CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷模型不同，Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷模型涉及T細胞、巨噬細胞的活化，細胞因子的釋放等多種因素，其發(fā)病機制與乙肝致肝纖維化的機制更接近[10]。本研究中，CGB應(yīng)用于Con A誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，其預(yù)防和治療作用也是通過檢驗乙肝常用肝功能和肝纖維化指標(biāo)觀察。ALT和AST是常用的肝功能指標(biāo)，正常情況下兩者均儲存于肝細胞膜和線粒體中，當(dāng)肝臟部位存在炎性反應(yīng)時，ALT和AST就會釋放到血液中，導(dǎo)致指標(biāo)升高。所以轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值居高不降反映出肝臟組織存在持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細胞腫脹壞死，而轉(zhuǎn)氨酶的下降說明疾病狀態(tài)的恢復(fù)。與模型組相比，CGB各劑量組均能夠抑制血清中 ALT、AST的升高，說明CGB能明顯改善肝組織損傷情況。另外，肝纖維化的程度可通過檢測常用的肝纖維化相關(guān)標(biāo)志物進行判斷，目前組織和血清中的HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ含量與肝纖維化的發(fā)展程度有密切關(guān)系[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，各劑量的CGB治療組均能抑制血清HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ水平，說明維藥菊苣正丁醇提取物CGB能延緩肝纖維化的進展。

TGF-β1是一族具有多種生物活性的堿性蛋白質(zhì)，至少有5個亞型，其中TGF-β1活性最強，被認為是肝纖維化快速發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[12]。TGF-β1在肝纖維化早期分泌增多，通過與受體結(jié)合，大量激活下游信號分子Smad家族蛋白。Smad形成同源/異源寡聚體進入細胞核后，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，對成纖維細胞和巨噬細胞產(chǎn)生趨化作用，誘導(dǎo)這些細胞過度分泌促炎物質(zhì)和纖維化細胞因子，使ECM過度沉積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)展。在TGF-β1/Smad信號通路中，Smad家族的不同亞型起到差異化的調(diào)控作用，Smad2/3磷酸化激活轉(zhuǎn)入細胞核后，在細胞水平上介導(dǎo)TGF-β1發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；而Smad6/7卻可以抑制TGF-β1復(fù)合體磷酸化Smad2/3這一過程，對TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)起到平衡調(diào)節(jié)作用[13]。在本實驗中，通過Con A制備小鼠肝纖維化模型后給予CGB灌胃干預(yù)后，測得TGF-β1和Smad7表達水平均與正常組接近，明顯區(qū)別于模型組 （P＜0.05或P＜0.01），說明CGB抗肝纖維化的作用與TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)。而治療組和模型組比較，TGF-β1表達下降，Smad7表達升高，進一步明確CGB對TGF-β1/Smad信號通路的調(diào)控作用是通過促進Smad7分泌,抑制TGF-β1表達實現(xiàn)的。

本研究表明CGB能有效預(yù)防和治療Con A誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化,調(diào)控肝細胞TGF-β1/Smad信號通路，阻斷TGF-β1蛋白合成，緩解肝纖維化發(fā)展可能是CGB抗纖維化的分子機制之一。

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（本文編輯 楊 瑛）

Therapeutic Effects of Uigur Medicine Cichorium glandulosum Boiss Extracts on Hepatic Fibrosis in Balb/c Mice

Li-Lin Xiang1,Wei Li1,Xin Wu1,Xin-Chun Wang2,Yan-Lin Jian1*
(1.Department of Pharmacy,The Third People Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518112,China; 2.The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

Objective To investigate the therapeutic effects of the N-butyl alcohol extracts of Cichorium glandulosum Boiss(CGB)on hepatic fibrosis in mice.Methods A standard model of concanavalin A(Con A)induced Balb/c mice heptic fibrosis was established,and the treated groups were given 100 mg/kg and 500 mg/kg CGB,respectively.Colchicine (0.1 mg/ kg)was used as positive control group.At 10th week of treatment,all mice were scarified to take liver tissue and serum.The serum liver function index and liver fibrosis index levels in all groups were compared.The changes of liver tissue and expressions of TGF-β1/Smad were made pathologic analyses.Results In Con A induced Balb/c mice,CGB resisted,suppressed Compared with the model group,the liver function index (ALT,AST)and indexes of hepatic fibrosis (PC-III,CIV,LN and HA)in CGB treatment group were reduced in different degrees(P＜0.05);The expression of TGF-β1was decreased and expression of Smad7 was increased(P＜0.05).Pathological results indicated different doses can improve the hepatic fibrosis of Balb/c mice.Conclusion CGB show the anti-hepatic fibrosis effect,its potential mechanism maybe related with the regulation of TGF-β1/Smad signal channel.

Cichorium glandulosum boiss;liver fibrosis;concanavalin A;TGF-β1;Smad7

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.008

2015-06-03

深圳市科技計劃項目（201203067）；深圳市新發(fā)傳染病重點專科基金資助項目(201161)。

向莉琳，女，副主任藥師，研究方向:醫(yī)院藥學(xué)。

筒炎林，男，主任藥師，Email:james766＠139.com。