張玉嶺，陳寶貴*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

回神顆粒對雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)的影響

張玉嶺1，陳寶貴2*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

目的 探討在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)病理早期采用回神顆粒對轉(zhuǎn)基因AD小鼠的治療作用。方法 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法鑒定淀粉樣前體蛋白/早老素1(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的基因表型后，選取3月齡雄性轉(zhuǎn)基因陽性PAD小鼠和同齡、同背景的C57BL/6J野生型雌性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。應(yīng)用Morris水迷宮中逃避潛伏期、穿越平臺的次數(shù)來評價小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的改變，免疫組化法檢測小鼠海馬區(qū)β淀粉樣蛋白(βamyloid protein，Aβ)1-42的表達(dá)水平。結(jié)果 回神顆粒治療組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高，與模型組比較，小鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多(P＜0.05)；穿越平臺次數(shù)與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);治療組大腦海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)陽性面積明顯減少(P＜0.05)。與正常組相比，模型組AD小鼠大腦海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)陽性面積明顯增高(P＜0.05)。結(jié)論 回神顆?？娠@著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制Aβ1-42的過度表達(dá)、聚集。

阿爾茨海默病；APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠；回神顆粒；β淀粉樣蛋白1-42；人參；石菖蒲；鹿角膠

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）俗稱老年癡呆癥，是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，多發(fā)于老年期，病程緩慢不可逆，臨床表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙、人格行為改變等全面性癡呆。數(shù)據(jù)表明，65歲以上人群患病率接近5%，85歲以上人群患病率已接近30%。老年癡呆患者從確診開始，平均存活時間僅約7年[1-2]。由于缺乏理想的治療手段和有效藥物，AD一直為醫(yī)學(xué)界比較棘手的疾病之一。中醫(yī)根據(jù)辨證論治充分發(fā)揮中藥復(fù)方多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，在防治AD方面具有西藥無可比擬的前景和優(yōu)勢。

本研究利用國際公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因動物模型APPswe/PS1dE9為研究對象，同時選用與APPswe/ PS1dE9同背景同月齡的C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)對照。在驗(yàn)證3月齡PPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠存在典型的病理特征與學(xué)習(xí)記憶能力損害的基礎(chǔ)上，觀察回神顆粒對 APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)成績及腦組織Aβ沉積的影響，以期驗(yàn)證回神顆粒對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的保護(hù)性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級（SPF）3月齡的APPswe/ PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠20只；同背景同月齡野生型C57BL/6J小鼠20只(雄性)。許可證號:SCXK（京）2014-0004。實(shí)驗(yàn)動物及飼料皆購自北京華阜康生物科技股份有限公司，體質(zhì)量（26.2±4.3）g。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，小鼠分別飼養(yǎng)至6月齡進(jìn)行動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物與試劑 回神顆粒（天律市武清區(qū)中醫(yī)院院內(nèi)制劑，5g/袋，批準(zhǔn)文號:津藥制字Z20070178號）；10%水合氯醛、磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液（CST）；瓊脂糖凝膠和溴乙錠兔抗Aβ1-42、辣根過氧化物酶（HRP）二抗、濃縮型DAB試劑盒（博奧森生物有限公司）。

1.1.3 主要儀器 EthoVision XT型Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，荷蘭Noldus公司；PCR擴(kuò)增儀（Invitrogen,Grand Island,NY)由武清中醫(yī)院檢驗(yàn)科提供；脫水機(jī)、包埋機(jī)和切片機(jī)均有武清中醫(yī)院病理科提供。

1.2 PCR法鑒定

PCR法鑒定APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型所生子代小鼠為陽性表達(dá)小鼠，具體方法如下[3]:（1）剪取小鼠鼠尾約0.5 cm放入1.5 mL離心管內(nèi)；（2）每管中加入0.5 mL、裂解液，以12 000 r/min，56℃轉(zhuǎn)動2 h以上，離心20 min，取上清液；（3）加入等體積異丙醇混勻，放置30 min；（4）12 000 r/min離心10 min，沉淀DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段。本實(shí)驗(yàn)所用的APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠表型穩(wěn)定，PCR法鑒定小鼠基因型，PCR產(chǎn)物長度為:APP 300 bp左右，PS1 600bp左右 （marker為DL 2000 DNA Marker）。篩選陽性表達(dá)的20只小鼠用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.3 動物分組與干預(yù)方法

PCR檢測鑒定后的3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性的雄性小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組和治療組，每組各10只；同齡、同背景的C57BL/6J陰性純合子(野生型)雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組和正常加藥組，每組各10只。治療組和正常加藥組，將回神顆粒用生理鹽水稀釋成混懸液灌胃，人的服用劑量為了15 g/d,換算成大鼠劑量為了15 g/d×0.018=0.27 g/d,配成1 mL灌胃液灌服，2次/d。陰性對照組灌服同等體積的生理鹽水，持續(xù)3個月。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前將水桶灌以清水至24 cm高度，水溫控制在23～25℃之間。在池壁上以不同形狀的標(biāo)志物標(biāo)記四個象限的入水點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入表格時分別記錄為東、南、西、北4個標(biāo)記點(diǎn)，以這4個點(diǎn)將水面和水桶分成均等的4個象限。在其中一象限正中離池壁35 cm處放一個直徑為9 cm的圓形平臺，平臺頂?shù)陀谒? cm。迷宮上方的視頻拍攝系統(tǒng)同步記錄小鼠游泳軌跡。第一天實(shí)驗(yàn)前及最后一天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤去平臺，將小鼠放入水池中自由游泳60 s，檢測各組小鼠間的游泳速度有無差異。整個測試持續(xù)6 d，前5天為隱蔽站臺實(shí)驗(yàn)，第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.5 組織取材與指標(biāo)檢測

各自小鼠于末次行為學(xué)測試后進(jìn)行腦組織取材。采用快速斷頭取全腦，用濾紙吸干，稱質(zhì)量。小鼠腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上(4℃)，之后換后固定液，固定好后行石蠟包埋，進(jìn)行病理及免疫組化染色。

1.5.1 HE染色 取大腦海馬處組織標(biāo)本，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯媒浸，55～60℃浸臘，石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木素-伊紅染色，脫水透明、封片。

1.5.2 免疫組化檢測 常規(guī)組織切片脫蠟至水。新鮮配制3%H2O2的甲醇液室溫處理20 min。用0.01 MPBS洗滌5 min×3次，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫，0.01 MPBS洗滌5 min×3次，滴加正常山羊血清工作液，37℃，30 min。棄去血清，勿洗。吸干血清，加入一抗 (根據(jù)預(yù)試驗(yàn)適當(dāng)稀釋，Aβ1-42濃度 1∶400，4℃，40 h。0.01 MPBS洗滌5 min×3次，滴加二抗 (生物素標(biāo)記二抗工作液)，37℃，2 h，0.01 MPBS洗滌5 min×3次，滴加三抗(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，S-A/HRP)，37℃，2 h，0.01 MPBS洗滌5 min×3次，滴加顯色劑DAB底物溶液 (取1 mL雙蒸水，加入DAB試劑盒中的A液一滴，混勻后，再加B、C液各一滴混勻)顯色，顯色時間5～30 min。自來水沖洗，酒精梯度脫水、二甲苯透明、光學(xué)中性樹脂封片。陰性對照:以PBS代替一抗，其它處理同上。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊時用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化每組積分光密度數(shù)據(jù)以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析。對嚴(yán)重偏離正態(tài)分布者采用多樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-walls檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)改變

回神顆粒治療組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高，與模型組比較，第3～5天逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多(均P＜0.05)；治療組穿越平臺次數(shù)與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。說明回神顆粒治療組改善了APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的行為缺陷，增強(qiáng)了其學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

表1 各組小鼠隱藏平臺實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較 （±s，n=10，s）

表1 各組小鼠隱藏平臺實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較 （±s，n=10，s）

注:與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。

組別模型組治療組正常組正常加藥組第1天45.34±24.77 28.14±27.21 42.14±25.42 40.73±23.54第2天37.24±25.14 20.88±23.77 41.20±24.93 37.61±23.21第3天26.98±22.72△△10.40±14.35** 25.55±23.86 18.66±16.58第4天25.38±23.89△△8.88±13.54** 6.95±7.02 5.58±6.07第5天19.06±20.64△△9.09±14.28** 4.37±4.28 4.21±3.45

2.2 各組小鼠海馬區(qū)HE染色結(jié)果

正常組小鼠大腦皮層組織結(jié)構(gòu)清楚，各層神經(jīng)元密集，排列整齊，細(xì)胞核膜、核仁清楚，皮層微血管管壁完整。海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊均勻，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。而模型組小鼠大腦皮層組織結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)元胞體縮小，海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列不均勻，細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙，血管壁不整齊。中藥組海馬核固縮現(xiàn)象明顯減輕，細(xì)胞排列較模型組整齊，形態(tài)較正常，炎性細(xì)胞明顯較少，血管結(jié)構(gòu)正常。詳見圖1-2。

2.3 各組小鼠海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示:Aβ1-42主要表達(dá)在神經(jīng)元，陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈深棕色，著色部位于胞膜和胞質(zhì)，細(xì)胞多呈圓性或錐形，胞體較大，突起明顯。正常組皮層Aβ1-42陽性細(xì)胞數(shù)量少、著色淺，模型組皮層Aβ1-42陽性細(xì)胞較正常組著色加深，二者相比有顯著差異（P＜0.05）。回神顆粒治療組的Aβ1-42陽性細(xì)胞數(shù)量大于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2及圖3-4。

3 討論

回神顆粒是導(dǎo)師陳寶貴教授在長期臨床實(shí)踐中不斷總結(jié)用藥經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上研制而成的治療AD的有效中藥復(fù)方制劑，臨床上有較好的療效[4-5]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，該病為五臟精氣虛衰、瘀血和痰濁所致，是本虛標(biāo)實(shí)之證，治療上需補(bǔ)益五臟之精氣，兼以化瘀祛痰，開竅通絡(luò)?；厣耦w粒，君藥為人參，入脾肺兩經(jīng)，大補(bǔ)元?dú)?，固脫生津安神。石菖蒲入心、肝、脾三?jīng)，開竅豁痰，化濕和中，治神昏、痰厥；鹿角膠溫補(bǔ)肝腎，活血消腫，益氣通神氣，共為臣藥。靈芝入脾腎，增強(qiáng)免疫活性；丹參苦涼入心 肝，消離經(jīng)之血，促進(jìn)血腫吸收；五味子酸溫入肺腎，斂氣滋陰，生津止汗，收斂耗散之精氣，改善智力活動，促進(jìn)基礎(chǔ)代謝，共為佐藥。丹參的苦涼可牽制人參、鹿角膠、石菖蒲的溫燥，五味子的酸斂能抑制石菖蒲、川芎辛散太過。使藥為川芎，活血行氣，上行巔頂，下行血海，引諸藥上通下達(dá)，歸臟腑，入經(jīng)絡(luò)。全方諸藥，補(bǔ)而不滯，溫而不燥，補(bǔ)氣活血，醒腦開竅，化痰祛濁。

圖1 各組小鼠鼠治療至6月齡后腦組織病理變化顯微圖(HE，×100)

圖2 各組小鼠鼠治療至6月齡后腦組織病理變化顯微圖(HE，×200)

圖3 各組小鼠鼠治療至6月齡后腦組織免疫組化圖(Aβ1-42，×100)

圖4 各組小鼠鼠治療至6月齡后腦組織免疫組化圖(Aβ1-42，×200)

表2 回神顆粒對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬CA1區(qū)Aβ1-42表達(dá)的影響（Mean±SD，n=10，個）

AD患者的學(xué)習(xí)記憶能力減退是老年癡呆的核心癥狀，嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。AD病理表現(xiàn)在大腦皮層和皮層下特定腦區(qū)神經(jīng)元和突觸的大量死亡和缺失，導(dǎo)致相應(yīng)腦區(qū)萎縮，如顳葉、頂葉、前額及扣帶回葉萎縮[6]，利用MRI或PET可明顯觀測到與健康人相比出現(xiàn)體積減少、形狀改變等現(xiàn)象[7]。從生化水平分析，在顯微鏡下可明顯觀測到淀粉樣沉積 （senile plaques，SP）和神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)[8]。其中，SP主要組成是Aβ多肽片段，Aβ來于淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）。APP是跨膜蛋白，在神經(jīng)元生長、突觸傳遞等起重要作用[9]。AD中多種蛋白異常均可導(dǎo)致APP被酶剪切至小片段[10]，其中的某些片段如Aβ1-42積累引起淀粉樣沉積[11]。目前，尚缺乏有效的治療方法來阻止或逆轉(zhuǎn)該病的進(jìn)展。中藥復(fù)方回神顆粒在臨床上治療AD具有較好的療效。探討回神顆粒治療AD的機(jī)理，有著十分積極的意義。目前APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠被認(rèn)為是較為理想的AD動物模型，其不僅能模擬AD的自然緩慢發(fā)病過程，又可以出現(xiàn)AD的特征性病理改變老年斑。因此本研究使用APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動物模型，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及中藥復(fù)方回神顆粒對其學(xué)習(xí)記憶能力的干預(yù)作用，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供研究依據(jù)。

本部分實(shí)驗(yàn)經(jīng)免疫組化及HE染色發(fā)現(xiàn)，與同背景同年齡野生型C57BL/6J小鼠相比，APPswe/ PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬區(qū)有明顯的Aβ的沉積。該結(jié)果符合本研究要求。其次，本部分研究發(fā)現(xiàn)回神顆粒（連續(xù)灌胃3個月）能顯著降低APPswe/ PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織 Aβ的沉積，該結(jié)果經(jīng)免疫組化和HE染色均驗(yàn)證。有實(shí)驗(yàn)研究報道某藥物能改善正常老化 C57BL/6J小鼠（17-20月齡）的記憶能力，但是不能改善 12-15月齡5X FAD轉(zhuǎn)基因鼠[12]。因此，本研究選擇連續(xù)3個月給藥治療的方式，同時觀察APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的病理及行為學(xué)變化，研究結(jié)果較為滿意，提示藥物早期干預(yù)的重要性。

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（本文編輯 匡靜之）

Effects of Huishen Granule on Expression of Aβ1-42 in Hippocampus of Double-Transgenic AD Mice

Yu-Ling Zhang1,Bao-Gui Chen2*
（1.Tianjin University of Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;
2.Wuqing TCM Hospital,Tianjin 301700,China）

Objective To explore the therapeutic effect of Huishen granule on early-stage Alzheimer's disease (AD)in transgenosis AD mice.Methods The genotyping of amyloid precursor protein/presenilin 1(APP/PS1)in double-transgenic AD mice were detected by PCR method.The 3-month male transgenic PAD mice and male C57BL/6J wild-type mice with same background were selected as experimental objectives.The ability of learning and memory of the rats were evaluated by escape latency and crossing times of Morris water maze.Themorphology changes in the brains of AD mice were observed by using Hematoxylin-Eosin(HE)staining method.β-amyloid protein 1-42（Aβ1-42)in the area of hippocampus was detected by immunohistochemical method.Results Compared with the model group，the learning and memory ability in the Huishen granule treatmentgroup was increased,the escape latency was shorten and crossing times was increased(P＜0.05);The crossing times in the treatment group were not significantly different from those in the normal group(P＞0.05);The positive area of Aβ1-42 expression hippocampus in the treatment group were reduced(P＜0.05).Compared with the model group，the positive area of Aβ1-42 expression in hippocampus of the model group were increasedobviously(P＜0.05).Conclusion The Huishen granule could significantly improve the learning and memory ability in APP/PS1 double-transgenic AD mice and inhibit the over expression and accumulation of Aβ1-42.

Alzheimer's disease;APP/PSl transgenic mice;Huishen granule;Aβ1-42;ginseng;Acorus gramineus;deerhorn glue

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.007

2015-02-25

全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目［國中醫(yī)藥人教發(fā)（2011）41］。

張玉嶺，女，博士，醫(yī)師，研究方向:中醫(yī)治療腦病。

*陳寶貴，男，主任醫(yī)師，E-mail:niki19860717＠163.com。