鄒江冰，袁進，蔣琳蘭

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010)

紫果西番蓮葉提取物抗焦慮作用及其機制*

鄒江冰，袁進，蔣琳蘭

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010)

目的 探討紫果西番蓮葉提取物的抗焦慮作用及其機制。方法 60只小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組和提取物大、中、小劑量組共5組。提取物大、中、小劑量組分別灌胃紫果西番蓮提取物 800，400，200 mg·kg-1·d-1，陽性對照組給予地西泮2 mg·kg-1·d-1，空白對照組灌胃等容積1%羧甲基纖維素鈉，各組連續(xù)給藥7 d。以高架十字迷宮(EPM)實驗為動物模型，考察紫果西番蓮葉的抗焦慮活性；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法對擴增產(chǎn)物進行分析。結(jié)果 紫果西番蓮葉醇提物(400，800 mg·kg-1·d-1)能增加小鼠在開臂內(nèi)運動時間和次數(shù)百分率，并且提高小鼠在開場中央?yún)^(qū)的次數(shù)；實時熒光定量PCR法分析表明，紫果西番蓮葉醇提物(400，800 mg·kg-1·d-1)能上調(diào)EPM焦慮小鼠腦組織中GABAA受體α2亞型和α3亞型mRNA表達水平。結(jié)論 紫果西番蓮葉醇提物具有明顯的抗焦慮作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)GABAA受體α2亞型和α3亞型mRNA表達水平有關(guān)。

紫果西番蓮葉；焦慮；高架十字迷宮；γ-氨基丁酸A型受體

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性昆明種小鼠60只，級別：SPF，初始體質(zhì)量20～25 g，合格證號：SCXK(粵)2008-0002，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗室SPF動物房。光照節(jié)律12L：12D(7：00～19：00)，室溫(18±2) ℃，相對濕度約50%，動物可以自行攝取標準飼料和清潔飲用水。

1.2 藥物與試劑 紫果西番蓮葉采自廣東梅州五華縣，經(jīng)華南植物研究所韋強老師鑒定為西番蓮屬西番蓮科植物紫果西番蓮(PassifloraedulisSims)的干燥葉；羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose，CMC)；地西泮(上海信誼醫(yī)藥公司，批號：10021122)；Trizol試劑(TaKaRa Code：D9108A)；焦碳酸二乙酯(DEPC，廣州威佳科技有限公司)；DL2000 DNA Marker(大連寶生物有限公司)；EB溶液(上海申能博彩生物公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(nvitrogen)；SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)；Loading Buffer(TaKaRa)。引物合成和測序由上海捷瑞生物科技公司完成。

1.3 儀器 小鼠高架十字迷宮(采用國際通用方法制作[3-4])；NANO DROP 2000；恒壓電泳儀(北京六一儀器廠)；恒溫水浴槽(上海精宏實驗設(shè)備公司)；Gene Q基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)；熒光定量PCR儀(Qiagen公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood)Ⅱ(Bio-Rad公司)。

1.4 溶液的制備 取紫果西番蓮葉粗粉160 g，用15倍量的60%乙醇80 ℃回流提取3次，每次2 h，合并濾液，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥得紫果西番蓮葉醇提物，臨用前用1%CMC進行溶解。地西泮用1% CMC配成0.125 mg·mL-1溶液，4 ℃保存，使用前混搖均勻。

1.5 動物分組與給藥方法 將小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組和紫果西番蓮提取物大、中、小劑量組共5組。其中紫果西番蓮提取物大、中、小劑量組分別按 800，400，200 mg·kg-1·d-1灌胃給藥[5]，陽性對照組給予地西泮2 mg·kg-1·d-1，空白對照組灌服等容積1%CMC。各組連續(xù)給藥7 d，于第 7天在末次給藥1 h后8 ：00～16 ：00進行行為測試。

1.6 小鼠高架十字迷宮(EMP)實驗 高架十字迷宮包括兩個開臂(長30 cm，寬5 cm)與兩個閉臂(長30 cm，寬5 cm，高15 cm)距地面50 cm。迷宮測試前將每只小鼠放入一個45 cm× 35 cm× 20 cm塑料盒中，任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平臺處，使其頭部正對其中1個開放臂，記錄5 min內(nèi)小鼠進入開臂次數(shù)(open arm entry,OE)、閉臂次數(shù)(close arm entry,CE)和迷宮中央?yún)^(qū)內(nèi)的次數(shù)及在開臂與閉臂的運動時間。以進入開臂次數(shù)與總?cè)氡鄞螖?shù)的百分率(open enter percent,OE%)及在開臂內(nèi)運動時間與入臂總時間百分率(open time percent,OT%)代表抗焦慮作用指標。整個行為過程用攝像機攝像。每測試完一只用濕布擦拭迷宮，清除糞便，用干布擦拭干凈后再進行下一只小鼠的測試。

1.7 鼠腦組織中γ-氨基丁酸A型(GABAA)受體α2和α3亞型mRNA表達的檢測 小鼠 EPM行為學(xué)測試結(jié)束后，立即處死，每組分別取5只小鼠的腦組織，無菌條件下分離全腦，將腦組織置于預(yù)冷的研缽中，在液氮條件下?lián)v碎成粉末，按試劑盒說明用TRIzol試劑提取腦組織總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳來鑒定RNA的完整性后，用半定量RT-PCR方法檢測GABAA受體α2亞型和α3亞型mRNA水平的表達，以β-actin作為內(nèi)參照，α2亞型上游引物5′-GCTACGCTTAC-ACAACCTC-3′，下游引物5′-TCATTGACTACACT-CTTCC-3′；α3亞型上游引物5′-CAACTACTTCACC-AAGCGG-3′，下游引物5′-CGGGAAATTTTGTCAACCT-3′ ；PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s，53.6 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，擴增38個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳。Real-time PCR分析：α2亞型上游引物5′-AATCT-GGACTCCTGATACCTTC-3′，下游引物5′-CATTCGG-CTTGGACTGTAAG-3′；α3亞型上游引物5′-AAGT-AGCACAGGATGGCTCACG-3′，下游引物5′-ACATGG-CAAGTAGGTCTGGATGAC-3′ ；Real-time PCR反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用PCR儀軟件分析反應(yīng)結(jié)果，檢測各樣本中的Ct值，以Delta-deltaCt法分析各組GABAA受體α2亞型和α3亞型基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 小鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果 結(jié)果表明，與空白對照組比較，紫果西番蓮醇提物在400，800 mg·kg-1的劑量下可以明顯增加OT%和OE%(P<0.01)，不增加總?cè)氡鄞螖?shù)(總?cè)氡鄞螖?shù)代表大鼠的運動活力)，說明紫果西番蓮葉醇提物在此模型上有明顯的抗焦慮作用。見表1。

表1 5組小鼠總?cè)氡鄞螖?shù)，入開放臂次數(shù)比例和開放臂停留時間比例比較

與空白對照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.01

2.2 RNA電泳結(jié)果 總RNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，28 s和18 s兩條RNA帶清晰可見，28 s條帶亮度約為18 s條帶的2倍，表明RNA有較好的完整性，沒有降解，見圖1。紫外分光光度計檢測RNAA260/A280比值均在1.8～2.2，表明純度符合要求。

圖1 小鼠腦組織總RNA電泳圖

2.3 對小鼠腦組織中GABAA受體α2亞型和α3亞型mRNA的影響 結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，與空白對照組比較，陽性對照組、紫果西番蓮葉提取物大和中劑量組α2亞型和α3亞型目的片段的光亮度都有所增加，與藥效實驗結(jié)果一致。

2.4 Real-time PCR實驗結(jié)果 見圖3，4。

3 討論

紫果西番蓮在巴西民間作為治療焦慮癥的藥物，文獻研究表明，紫果西番蓮提取物與地西泮的不同之處是在抗焦慮的同時，不阻斷記憶過程[6]。

1.陽性對照組；2.提取物大劑量組；3.提取物中劑量組；4.提取物小劑量組；5.空白對照組；6.DL2000 maker ；a.α2目的條帶；b.α3目的條帶；c.β-actin目的條帶

圖2 RT-PCR檢測5組小鼠腦組織中GABAA受體α2亞型和α3亞型 mRNA的影響

1. positive control group; 2. high-dose extract group; 3. medium-dose extract group; 4. low-dose extract group; 5. blank control group; 6. DL2000 maker; a. α2target band；b.α3target band；c.β-actin target band

Fig.2 mRNA expression of GABAA-α2and GABAA-α3receptor in five groups of mice brain by RT-PCR

本研究采用RT-PCR和Real-time PCR兩種方法對紫果西番蓮葉提取物是否通過GABAA型受體α2亞型和α3亞型來發(fā)揮抗焦慮作用進行了探討，結(jié)果顯示800及400 mg·kg-1·d-1的紫果西番蓮葉提取物相對于空白對照組，α2亞型和α3亞型 mRNA的相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示紫果西番蓮提取物的抗焦慮作用與GABAA型受體有關(guān)。

A.擴增曲線；B.溶解曲線；a.空白對照組；b.提取物小劑量組；c.提取物中劑量組；d.提取物大劑量組；e.陽性對照組；與空白對照組比較，*1P<0.01

圖3 Real-time PCR檢測5組小鼠腦組織中GABAA受體α2亞型 mRNA

A.amplification curve; B. dissociation curve; a.blank control group; b. low-dose extract group; c. medium-dose extract group;d. high-dose extract group; e. positive control group; Compared with blank control group,*1P<0.01

Fig.3 mRNA expression of GABAA-α2receptor in five groups of mice brain by real-time PCR

A.擴增曲線；B.溶解曲線；a.空白對照組；b.提取物小劑量組；c.提取物中劑量組；d.提取物大劑量組；e.陽性對照組；與空白對照組比較，*1P<0.01

圖4 Real-time PCR檢測5組小鼠腦組織中GABAA受體α3亞型 mRNA

A.amplification curve; B. dissociation curve; a.blank control group; b. low-dose extract group; c. medium-dose extract group;d. high-dose extract group; e. positive control group; Compared with blank control group,*1P<0.01

Fig.4 mRNA expression of GABAA-α3receptor in five groups of mice brain by real-time PCR

[1] 鄒江冰，孔秋玲，陳龍浩，等.不同產(chǎn)地紫果西番蓮葉中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31(3)：348-349.

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Anxiolytic Effects ofPassifloraedulisExtract and Its Mechanism

ZOU Jiangbing, YUAN Jin, JIANG Linlan

(DepartmentofPharmacy,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Objective To investigate the anxiolytic effects of the ethanol extract ofPassifloraedulisand the related mechanism. Methods Sixty mice were randomly divided into five groups,including blank control group,positive control group,high-dose,medium-dose,and low-dose extract groups. Mice of high-dose,medium-dose,and low-dose extract groups were given 800，400，200 mg·kg-1·d-1of extract of Passilora edulis.Mice of positive control group were given 2 mg·kg-1·d-1of diazepam. Mice of blank control group were given equal volume of 1% sodium carboxyl methyl cellulose.Mice in all groups were treated for 7 consecutive days. Elevated plus-maze (EPM) test was used to assess antianxiety effect ofPassifloraedulisinKunmingmice.Amplified products were analyzed by PCR. Results The ethanol extract ofPassifloraedulis(400 and 800 mg·kg-1·d-1) significantly increased the percentage of the times of mouse entering the open arms and stay duration in the total period and it could increase the time of passing the box.Real-time fluorescence quantification PCR showed that the ethanol extract ofPassifloraedulis(400 and 800 mg·kg-1·d-1) increased the mRNA expression of α2and α3subunits of GABAAreceptor. Conclusion The ethanol extract ofPassifloraedulisexerts anti-anxiety effect in the elevated plus-maze test.The mechanism is related to regulation of the mRNA expression of α2and α3subunits of GABAAreceptor.

Passiloraedulis; Anxiolytic; Elevated plus-maze; GABA receptor

2014-01-26

2014-02-21

*廣東省中醫(yī)藥局科研課題(2010253)

鄒江冰(1974-)，女，湖南新化人，主管藥師，碩士，研究方向：天然藥物及醫(yī)院制劑。電話：020-36652003，E-mail：jbz429@163.com。

蔣琳蘭(1962-)，女，浙江杭州人，主任藥師，碩士，研究方向：天然藥物及醫(yī)院制劑。電話：020-36653476，E-mail：jlinlan@163.com。

R965

A

1004-0781(2015)02-0166-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.006