陳密，盧云，周梅，羅攀，崔海東，郭蓮軍

(1.湖北省英山縣人民醫(yī)院藥劑科，英山 438700；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥理系，武漢 430030)

蝙蝠葛諾林堿對家兔體外頸內(nèi)動脈舒張作用

陳密1，盧云2，周梅2，羅攀2，崔海東2，郭蓮軍2

(1.湖北省英山縣人民醫(yī)院藥劑科，英山 438700；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥理系，武漢 430030)

目的 探討蝙蝠葛諾林堿對家兔體外頸內(nèi)動脈血管平滑肌的舒張作用。方法 清潔級健康成年家兔，采用機械方法損傷體外血管內(nèi)皮，通過觀察標本對1 mol·L-1乙酰膽堿的舒張反應，以確定血管內(nèi)皮是否損傷。然后觀察蝙蝠葛諾林堿對家兔頸內(nèi)動脈血管平滑肌的舒張作用及與血管內(nèi)皮的關系。結果 蝙蝠葛諾林堿對甲氧胺、氯化鉀及組胺所致的家兔頸內(nèi)動脈收縮均有明顯的擴張作用，在內(nèi)皮完整的血管，最大舒張分別為89%，90%和80%，而在內(nèi)皮損傷的血管，最大舒張分別為75%，74%和78%，其作用與血管內(nèi)皮損傷無明顯關系(P>0.05)，而對5-羥色胺所致的收縮，其舒張作用具有一定的內(nèi)皮依賴性，在相同劑量，對內(nèi)皮完整血管的舒張作用比內(nèi)皮損傷血管要明顯，兩者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 蝙蝠葛諾林堿能有效舒張家兔體外頸內(nèi)動脈血管平滑肌，其舒張作用無明顯的血管內(nèi)皮依賴性。

蝙蝠葛諾林堿；動脈，頸內(nèi)；血管內(nèi)皮；舒張作用

頸內(nèi)動脈是供應腦組織血液的主要血管之一，頸內(nèi)動脈的舒張和收縮功能明顯影響腦組織的血液供應。據(jù)報道，頸內(nèi)動脈血管病變與腦缺血性卒中的關系非常密切[1-2]。60%以上的腦卒中是由于頸動脈病變，特別是狹窄造成。目前，臨床上對于癥狀性同側頸動脈狹窄度達到70%以上患者，一般都考慮使用動脈內(nèi)膜切除術治療，對于輕中度狹窄患者，仍以藥物治療為主，因此積極尋找有效擴張頸動脈，改善頸內(nèi)動脈舒縮功能的藥物，是非常必要的。蝙蝠葛諾林堿(daurinoline)是蝙蝠葛根莖中分離提取的單體物質(zhì)，其化學結構和理化特性均已鑒定，屬于雙芐基異喹啉類生物堿。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛諾林堿對多種收縮血管物質(zhì)如甲氧胺、5-羥色胺等所致的家兔基底動脈收縮具有明顯的擴張作用，能明顯改善小鼠軟腦膜微循環(huán)[3-4]。筆者在本實驗中應用體外血管環(huán)標本，用人工機械方法損傷血管內(nèi)皮，進一步探討蝙蝠葛諾林堿對在血管內(nèi)皮完整和內(nèi)皮損傷模型上家兔頸內(nèi)動脈血管平滑肌舒張作用，為該化合物的開發(fā)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 成年健康新西蘭大白兔，清潔級，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄兼用；華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0007，合格證號：00018520。正常飼養(yǎng)環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 蝙蝠葛諾林堿，微黃色粉劑，純度≥95%，由同濟醫(yī)學院藥理系提供，用1 mol·L-1鹽酸溶解后，以1 mol·L-1氫氧化鈉將pH調(diào)至6.4，避光，置冰箱內(nèi)備用。甲氧胺(武漢遠大制藥集團有限公司，白色粉末，相對分子質(zhì)量 247.7)，實驗前用去離子水溶解，并稀釋至所需濃度，乙酰膽堿(acetylcholine，Ach，批號：UFC06534)，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT，批號：20030922)、組胺(histamine，His，批號：MFCD00005210)、苯腎上腺素( phenylephrine，PE ，批號：59-42-7)均為白色粉劑，購于Sigma公司。NE Kreb's液的組成成分(mol·L-1)： 氯化鈉(118)、氯化鉀(4.5)、二水氯化鈣(2.5)、七水硫酸鎂(1.0)、碳酸氫鈉(2.5)、磷酸二氫鉀(1.0)、葡萄糖(6.0)，以上化學試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器 XWT-206臺式平衡記錄儀(中國上海大華儀表廠)，HSS-1(S)超級水浴恒溫儀(成都儀器廠)。JZ100型肌張力傳感器(高碑店新航機電設備公司)。HV-4血管環(huán)灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.4 標本制備與實驗分組 兔被擊昏后，迅速取出雙則頸內(nèi)動脈，置于通入混合氣體(95%氧氣+5%二氧化碳)的K-H液培養(yǎng)皿中，剪去血管周圍的脂肪和結締組織，用100 μL微量注射器抽取K-H液將動脈內(nèi)的殘余血液沖洗干凈，一側血管剪成環(huán)長3～4 mm，作為血管內(nèi)皮完整標本，另一側血管將棉絲穿入頸內(nèi)動脈來回搔刮3或4次，以達損傷血管內(nèi)皮，同樣剪成環(huán)長3～4 mm，(即去內(nèi)皮血管標本)，然后將標本固定在用不銹鋼細絲制作的“L”型小鉤，另一端與肌張力傳感器相連，置于容積為10 mL含K-H液的恒溫浴槽中通入混合氣體，恒溫(37.0±0.5) ℃，靜息張力0.01 N，平衡30 min，用腎上腺素預激，觀察血管收縮功能，以檢測標本的活性(收縮幅度<0.4 g淘汰)，然后按文獻[5]中用Ach(1 μmol·L-1)驗證去內(nèi)皮是否成功，沖洗標本3次，平衡2 h后開始實驗，平衡期間15 min更換營養(yǎng)液一次。將上述處理血管標本隨機(每只家兔左、右兩側頸內(nèi)動脈，一側血管內(nèi)皮損傷，另一不作損傷處理，即為內(nèi)皮完整)分為①內(nèi)皮完整+甲氧胺組；②內(nèi)皮損傷+甲氧胺組；③內(nèi)皮完整+氯化鉀組；④內(nèi)皮損傷+氯化鉀組；⑤內(nèi)皮完整+5-HT組；⑥內(nèi)皮損傷+5-HT組；⑦內(nèi)皮完整+組胺組；⑧內(nèi)皮損傷+組胺組。

1.5 給藥方法與觀察指標 待實驗標本穩(wěn)定后，各組分別加入甲氧胺(3×10-5mol·L-1)、KCl(3×10-5mol·L-1)、5-HT(3×10-5mol·L-1)、His(7×10-5mol·L-1)，使其達到最大收縮反應并穩(wěn)定15 min后，按半對數(shù)摩爾濃度累積給藥法加入蝙蝠葛諾林堿10-9～10-4mol·L-1，觀察其對血管的舒張作用。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5版統(tǒng)計軟件進行分析，血管張力用收縮反應的百分率表示，數(shù)值用均數(shù)±標準誤表示，組間比較經(jīng)方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對甲氧胺所致兔頸總動脈收縮的舒張作用 結果顯示蝙蝠葛諾林堿可劑量依賴性舒張血管，對內(nèi)皮完整的血管舒張作用較去內(nèi)皮血管較為明顯，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管的最大舒張分別為89%和75%。結果見圖1。

圖1 蝙蝠葛諾林堿對甲氧胺所致家兔頸內(nèi)動脈收縮的舒張作用

Fig.1 Vasodilation of daurinoline on methoxamine-induced vasoconstriction of internal carotid artery of rabbits

2.2 對氯化鉀所致兔基底動脈收縮的量效曲線的影響 蝙蝠葛諾林堿分別在內(nèi)皮完整血管和去內(nèi)皮血管中的舒張效果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管的最大舒張分別為90%和74%。結果見圖2。

圖2 蝙蝠葛諾林堿對氯化鉀所致家兔頸內(nèi)動脈收縮的舒張作用

Fig.2 Vasodilation of daurinoline on KCl-induced vasoconstriction of internal carotid artery of rabbits

2.3 對5-HT所致兔基底動脈收縮的量效曲線的影響 結果見圖3。蝙蝠葛諾林堿對5-HT(3×10-5mol·L-1)所致的家兔去內(nèi)皮和內(nèi)皮完整頸內(nèi)動脈收縮具有劑量依賴性舒張作用，且對內(nèi)皮完整的血管舒張作用更為明顯，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖3。

與內(nèi)皮損傷組比較，*1P<0.05

Compared with endothelium injury group，*1P<0.05

Fig.3 Vasodilation of daurinoline on 5-HT-induced vasoconstriction of internal carotid artery of rabbits

2.4 對組胺所致兔基底動脈收縮的量效曲線的影響 在家兔內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮的頸內(nèi)動脈，蝙蝠葛諾林堿對His(7×10-5mol·L-1)所致的收縮具有劑量依賴性舒張作用，且作用無明顯內(nèi)皮依賴性。內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管最大舒張分別為80%和78%。結果見圖4。

Fig.4 Vasodilation of daurinoline on histamine-induced vasoconstriction of internal carotid artery of rabbits

3 討論

頸內(nèi)動脈是將血液由心臟輸送至腦部的主要血管。文獻報道電刺激家兔頸動脈引起頻率依賴性收縮，此作用可被哌唑嗪阻斷，機械性或化學性除去血管內(nèi)皮后可明顯增強血管對電刺激的收縮反應。可卡因處理后能抑制去甲腎上腺素再攝取及代謝，使內(nèi)皮完整的血管比去內(nèi)皮的血管收縮性更強，亞甲藍是一種鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，只有在內(nèi)皮完整時才能增強血管對電刺激的收縮反應，這些表明頸內(nèi)動脈平滑肌上存在腎上腺素能受體，血管內(nèi)皮對血管收縮起重要作用[6]。本結果顯示蝙蝠葛諾林堿對腎上腺素能受體激動劑甲氧胺所致血管收縮有明顯的舒張作用，此作用是非內(nèi)皮依賴性的。

細胞外高鉀離子(K+)可使細胞膜超極化，激活血管平滑肌細胞膜上的電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDCC)，使細胞外鈣離子(Ca2+)內(nèi)流而增加胞內(nèi)Ca2+濃度，引起血管收縮。KCl可能是直接作用于血管平滑肌而引起血管收縮，其血管收縮作用與內(nèi)皮無關[7]。本研究結果顯示，蝙蝠葛諾林堿可劑量依賴性舒張KC1所致的血管收縮，對內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮血管環(huán)均呈濃度依賴性舒張；內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組相比差異無統(tǒng)計學意義，進一步表明蝙蝠葛諾林堿具有非內(nèi)皮依賴性的舒張血管的作用。

5-HT、組胺均為縮血管物質(zhì)，可結合血管平滑肌細胞膜上相應的5-HT和組胺受體，受體被激活后，均通過耦聯(lián)的Gq蛋白活性放大作用激活磷脂酶C而促進二酰甘油和三磷酸肌醇生成，后者誘導肌漿網(wǎng)Ca2+釋放，同時激活細胞膜上受體操縱性鈣通道(receptor-operated calcium channel，ROCC)使外Ca2+內(nèi)流，引起血管收縮[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛諾林堿對5-HT所致血管收縮的舒張作用，內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組比較，前者作用更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義，其詳細機制有待深入研究。而對組胺所致的縮血管作用，無明顯內(nèi)皮依賴性，提示其作用可能通過影響受體操縱的外Ca2+內(nèi)流途徑舒張血管。

綜上所述，本研究結果表明，蝙蝠葛諾林堿對多種縮血管物質(zhì)所致的家兔頸內(nèi)動脈收縮，具有劑量依賴性舒張作用，主要為非內(nèi)皮依賴性血管舒張效應，即對內(nèi)皮損傷的頸內(nèi)動脈仍有良好的舒張作用。

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Vascular Smooth Muscle Relaxation Effect of Daurinoline on Isolated Rabbit Internal Carotid Artery

CHEN Mi1, LU Yun2, ZHOU Mei2, LUO Pan2, CUI Haidong2, GUO Lianjun2

(1.DepartmentofPharmacy，thePeople’sHospitalofYingshan，HubeiProvince,Yingshan438700，China; 2．DepartmentofPharmacology，SchoolofBasicMedicalSciences，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China)

Objective To examine the effect of daurinoline on endothelial-dependent and-independent vasorelaxation in the rabbit internal carotid arterial (ICA) ring. Methods Internal carotid artery was isolated from specific pathogen-free adult rabbits.The blood vessel endothelium was injured by mechanical method.Diastole reaction of the sample to 1 mol·L-1acetyl choline was observed to determine injury of the blood vessel endothelium.Relaxant effect of daurinoline on internal carotid artery smooth muscle was detected. Results Daurinoline significantly relaxed internal carotid artery constricted by methoxamine, KCl and 5-histamine.In the aortic rings with intact endothelium, maximal relaxation was 89%, 90% and 80%, respectively, and the maximal relaxation was 75%, 74% and 78% in isolated aortic rings with endothelium injury, respectively.The relaxant effect had no relationship with endothelium injury (P>0.05).However, in 5-hydroxytryptamine induced constriction, the relaxant effect of daurinoline was associated with integrity of endothelium; the relaxant effect of the same dose of daurinoline was significantly greater on artery with intact endothelium than on artery with endothelium injury (P<0.05). Conclusion Daurinoline has relaxation effect on rabbits internal carotid artery smooth muscle.The relaxation action is not obviously associated with the endothelium integrity.

Daurinoline; Artery, carotid, internal; Endothelium; Relaxation

2014-01-13

2014-07-15

陳密(1974-)，男，湖北英山人，副主任藥師，學士，從事醫(yī)院藥學工作。電話：(0)13995917758，E-mail：chenmi356@hotmail.com。

郭蓮軍( 1953-)，女，湖北天門人，教授，博士生導師，研究方向： 心腦血管藥理。電話： 027-83691763，E-mail：Ljguo@hust.edu.cn。

R965

A

1004-0781(2015)02-0150-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.002