龐麗杰，王文革

（黑龍江省尚志國有林場管理局，黑龍江 哈爾濱150000）

我國每年因森林病蟲害致死樹木4 000多萬株，年均造成損失1 100多億元[1]。目前，對(duì)樹木病害的主要防治手段是采用化學(xué)農(nóng)藥殺菌，而化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜的副作用、殘留問題及污染環(huán)境問題已成為當(dāng)今世界首要解決的問題之一[2]。生物防治是植物病害防治的一種有效方法，特別是近年來利用微生物進(jìn)行植物病害的防治倍受人們的高度重視，在土傳病害[3，4]、葉部病害[5，6]等的生物防治中發(fā)揮了重要的作用，并形成了多個(gè)商品化的品種，在生物農(nóng)藥中占據(jù)了重要的地位。但目前在我國能夠廣泛推廣應(yīng)用的生防微生物制劑種類還極為有限，在大力挖掘本土高效微生物生防菌株的同時(shí)，積極對(duì)國外優(yōu)良菌株的引進(jìn)，是加快我國生物型農(nóng)藥開發(fā)和應(yīng)用的有效途徑。

本研究以從俄羅斯莫斯科國立大學(xué)生物系引進(jìn)的Streptomycessp.（S－msu2）菌株為研究對(duì)象，通過對(duì)常見的林木植物病原真菌的抗菌試驗(yàn)，測定了該菌株的抑菌譜及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌絲的生長及孢子萌發(fā)的抑制能力，旨在為該菌株的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 生防菌株：鏈霉菌Streptomycessp.，代號(hào)為S－msu2，由俄羅斯莫斯科國立大學(xué)生物系提供。

植物病原真菌：樟子松紅斑?。―othistromapini）、楊樹爛皮?。╒alsasordida）、樟子松枯梢?。―iplodiapinea）、落葉松早落?。∕ycosphaerella laricileptolepis）、落 葉松枯 梢?。˙otryosphaeria laricina）、落葉松芽枯病菌（Cladosporiumtenuissimum）。以上菌株由黑龍江省尚志國有林場管理局森防站保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮洗凈，稱取200g切成小塊，加水煮沸20min，用八層紗布過濾，取濾液加蒸餾水定容至1 000mL，加入20g葡萄糖、20g瓊脂，高壓滅菌（PD培養(yǎng)基內(nèi)不需加入瓊脂）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌及病原菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無菌條件下倒入培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約15mL，倒置過夜后，在培養(yǎng)皿中央接入生防菌和病原真菌，每種微生物接種3～4個(gè)平皿，在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，并留菌種。

1.2.2Streptomycessp.（S－msu2）菌株對(duì)林木病原菌抑制效果

（1）采用對(duì)峙培養(yǎng)法測定S－msu2對(duì)樹木病原真菌的拮抗活性。在直徑為9cm的PDA培養(yǎng)基平皿上接入直徑1cm的S－msu2和樹木病原菌菌餅，兩接種點(diǎn)相距3.0cm，病原菌或拮抗菌單獨(dú)接種在PDA平板上作對(duì)照，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，測量抑菌帶的寬度。

（2）采用生長速率法測定S－msu2發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長的抑菌作用。取活化好的S－msu2菌餅3片，接入裝有PD培養(yǎng)基300mL的500mL三角瓶中，25℃、160r·min－1振蕩培養(yǎng)7d。將培養(yǎng)液用8層紗布過濾后，濾液在50℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以10%吐溫80定容至25mL。取濃縮液25mL與100mL 50℃PDA培養(yǎng)基混合倒平板，接種直徑1cm的病原菌菌餅，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d后測量菌落直徑。以10%吐溫80作對(duì)照，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。抑制效果的計(jì)算公式：

抑菌率＝（對(duì)照凈生長量－處理凈生長量）／對(duì)照凈生長量×100%。

（3）S－msu2發(fā)酵液對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的影響[7]。將供試病原菌孢子制備孢子懸浮液（顯微鏡100倍下100個(gè)孢子／視野）再加入S－msu2菌株的發(fā)酵濃縮液，采用載玻片上萌發(fā)法，10h后鏡檢孢子萌發(fā)情況及萌發(fā)孢子芽管的畸形情況。

孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率＝（對(duì)照處理孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）／對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%

1.3 分析方法

采用Excel和SPSS軟件上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 S－msu2菌株對(duì)不同植物病原真菌拮抗譜

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，采用對(duì)峙法培養(yǎng)手段，S－msu2對(duì)實(shí)驗(yàn)選用的8種植物病原真菌都有一定的拮抗能力，但S－msu2與不同病原真菌共培養(yǎng)之間的抑菌帶寬度卻存在著顯著的差異（P＜0.05）。S－msu2對(duì)樟子松枯梢病的病原真菌抑制效果較好，抑菌帶寬度達(dá)到了13.6mm，其次對(duì)B.laricina、C.tenuissimum、V.sordida病原也表現(xiàn)出了較好的抑制效果。而與D.pini之間的抑菌帶寬度最窄，只有4.5mm。S－msu2菌和各種病原真菌作為對(duì)照培養(yǎng)的平板，2個(gè)接種點(diǎn)之間沒有抑菌帶，菌落已經(jīng)交融在一起了。

表1 S－msu2菌株對(duì)不同植物病原菌的拮抗譜

2.2 S－msu2菌株發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長的抑菌效果

為驗(yàn)證菌株S－msu2對(duì)不同植物病原菌的抑制作用是由菌株的營養(yǎng)、空間競爭的效果，還是該菌產(chǎn)生的細(xì)胞外抑菌物質(zhì)的作用效果，進(jìn)一步采用生長速率法測定S－msu2發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑菌作用。從表2數(shù)據(jù)可以看出，S－msu2發(fā)酵液能夠?qū)淠静煌≡z的生長產(chǎn)生抑制作用，且抑菌率也存在一定的差異。對(duì)D.pinea的抑制效果最好，抑制率高達(dá)70.6%，對(duì)楊樹爛皮病的病原菌V.sordida也比較好，抑制率為66.3%，而對(duì)樟子松紅斑病D.pini的抑制效果最差，只有23.6%（表2），但仍然可以表明S－msu2菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能夠分泌細(xì)胞外抑菌物質(zhì)，從而對(duì)病原菌的菌絲生長產(chǎn)生抑制作用。

表2 S－msu2菌株發(fā)酵液對(duì)不同植物病原菌菌絲的抑制結(jié)果

2.3 S－msu2菌株發(fā)酵液對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的影響

表3 S－msu2菌株對(duì)不同植物病原菌孢子萌發(fā)的結(jié)果

表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，S－msu2菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)供試的6種樹木病原真菌的孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，相對(duì)抑制率均超過40%，其中相對(duì)抑制率最高的是對(duì)樟子松枯梢病菌（D.pinea），相對(duì)抑制率高達(dá)75.7%，同時(shí)對(duì)楊樹爛皮病病原菌V.sordida孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率也較高（69.6%），而對(duì)樟子松紅斑病病原菌D.pini孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率最低，只有42.8%。通過顯微觀察，S－msu2菌株發(fā)酵產(chǎn)物能夠引起萌發(fā)孢子的芽管畸變，先端出現(xiàn)膨大、泡狀甚至串珠狀，即使萌發(fā)的孢子，其芽管長度也顯著小于對(duì)照。有些沒有萌發(fā)的病原菌孢子體積膨大，并出現(xiàn)空洞甚至外溢胞內(nèi)原生質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1Streptomycessp.（S－msu2）菌株與供試的6種樹木病原真菌（Dothistromapini、Valsasordida、Diplodiapinea、Mycosphaerellalaricileptolepis、Botryosphaerialaricina、Cladosporiumtenuissimum）平板對(duì)峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)S－msu2對(duì)6種病原真菌均有一定的抑制作用，表明其抗菌譜較寬。

3.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物能夠有效抑制6種樹木病原菌絲的生長和孢子萌發(fā)，特別是對(duì)D.pinea和V.sordida病原真菌抑制效果最為顯著。表明S－msu2菌株作為樟子松枯梢病和楊樹爛皮病的生防菌株具有一定的應(yīng)用潛力。

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