張文元 楊亞冬 張科技 唐 靚 房國(guó)堅(jiān)

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可梯度降解支架細(xì)胞化后修復(fù)兔前交叉韌帶缺損

張文元 楊亞冬 張科技 唐 靚 房國(guó)堅(jiān)

目的 通過可梯度降解的繩-網(wǎng)支架復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，修復(fù)兔前交叉韌帶(ACL)缺損。方法將聚乳酸∶蠶絲絲素∶聚羥基乙酸纖維按質(zhì)量比7∶6∶5混合，分別捻擰成繩芯與緯編針織成網(wǎng)狀物，滴加Ⅰ型膠原并凍干。將網(wǎng)狀物包裹繩芯，種植兔自體MSCs，植入兔前交叉韌帶(ACL)缺損處，作為實(shí)驗(yàn)組。單純支架置入為對(duì)照組。分別于術(shù)后12、24周，取材，HE染色，并行力學(xué)測(cè)試。結(jié)果 術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組新生韌帶與骨之間產(chǎn)生大量有序的垂直膠原纖維；對(duì)照組形成少量垂直膠原纖維。術(shù)后24周，實(shí)驗(yàn)組形成類似直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)；對(duì)照組則產(chǎn)生許多垂直膠原纖維。力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，術(shù)后12、24周實(shí)驗(yàn)組的最大載荷分別為72.7±23.4N與121.8±34.3N，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 可梯度降解支架復(fù)合自體MSCs能較好地重建兔ACL。

前交叉韌帶 修復(fù) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 梯度降解支架

大部分膝部韌帶損傷發(fā)生在前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)，發(fā)生率一般為1/3000，ACL一旦斷裂無法自愈。目前臨床重建前交叉韌帶使用的材料包括自體移植物、異體移植物和人工合成材料，但都存在無法克服的局限性。其缺陷主要包括：自體移植物來源有限且多有供區(qū)部位并發(fā)癥；異體移植物受來源限制，且有傳播疾病和產(chǎn)生免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)；人工材料重建ACL自20世紀(jì)80年代起逐漸得以在臨床使用，然而盡管短期效果令人滿意，但是長(zhǎng)期隨訪結(jié)果不盡人意，主要原因是材料力學(xué)強(qiáng)度和抗摩擦性質(zhì)都較差，疲勞斷裂發(fā)生率高，還有材料和組織之間的生物相容性較差是阻礙其臨床推廣的主要因素。通過組織細(xì)胞培養(yǎng)使支架材料細(xì)胞化的組織工程技術(shù)為ACL重建提供了新的思路和方法，為再生韌帶組織提供了一條新的途徑[1]。本實(shí)驗(yàn)采用擰捻-針織、繩-網(wǎng)結(jié)合制備可梯度降解的蠶絲絲素-PLA-PGA/膠原支架，并以自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為種子細(xì)胞，構(gòu)建支架-MSCs復(fù)合物。并將支架-MSCs復(fù)合物置入兔ACL缺損處，進(jìn)行ACL修復(fù)重建，并檢測(cè)重建情況。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料與儀器：蠶絲(Bombyx mori silk)由浙江海寧蠶農(nóng)贈(zèng)送。聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)纖維細(xì)絲，上海天清生物材料有限公司生產(chǎn)，呈乳白色，均勻柔韌。纖維連接蛋白(Sigma公司)，Ⅰ型鼠尾膠原(杭州生友生物技術(shù)有限公司)，抗兔CD14-FITC與抗兔CD44-PE(Antigenix America)。主要實(shí)驗(yàn)儀器：掃描電鏡(XL30-ESEM，荷蘭Philips公司)，微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)(QX-W300，上海企想檢測(cè)儀器有限公司生產(chǎn))，冷凍干燥機(jī)(Heto PowerDry LL3000，丹麥生產(chǎn))，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,BD,美國(guó)生產(chǎn))。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新西蘭白兔，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(浙)2009-0039號(hào)。

2.自體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)提取：參照文獻(xiàn)[2]提取，純化，培養(yǎng)。從4月齡新西蘭白兔(體重2.0～2.2kg，雌性)髂后上棘穿刺抽取骨髓，通過密度梯度離心法及貼壁培養(yǎng)法分離、純化、擴(kuò)增而獲得MSCs。分離的BMSCs參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行抗兔CD14-FITC、抗兔CD44-PE的流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞表面標(biāo)記CD14基本為陰性；而CD44呈陽性，表達(dá)均在80%以上。被抽取骨髓后的兔子繼續(xù)飼養(yǎng)，將作為制作韌帶缺損動(dòng)物模型，回植自體MSCs組織工程韌帶實(shí)驗(yàn)之用。

3.蠶絲絲素-PLA-PGA纖維編織支架制備：將蠶絲浸入0.5% Na2CO3溶液中(按1g蠶絲加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的 Na2CO3溶液1000ml比例)煮沸30min，更換Na2CO3溶液，再煮沸30min，去除絲膠。并用95℃去離子水充分沖洗，室溫晾干，得到蠶絲絲素(SF)纖維。按下列順序編織：按PLA、SF、PGA纖維以質(zhì)量比7∶6∶5均勻混合并平行排列(含蠶絲絲素纖維單絲40根、PLA纖維單絲16根、PGA纖維單絲12根，共含三者單絲68根)，記為(×1)，順時(shí)針扭合成1束纖維束，記為(×2)，共含三者單絲136根。再將該纖維束(×2)通過緯編針織成長(zhǎng)條狀網(wǎng)狀物(長(zhǎng)3.00cm×寬0.65cm)，詳見圖1。另外，將絲素-PLA-PGA纖維束(×2)逆時(shí)針扭合、再順時(shí)針扭合成繩芯支架(×8，含544根單絲)。將繩、網(wǎng)支架分別經(jīng)0.1mol/L稀鹽酸(HCl)、蒸餾水、0.1mol/L NaOH、蒸餾水超聲清洗機(jī)洗滌，以清除在紡絲和編織過程中黏附在纖維表面和空隙內(nèi)的雜質(zhì)和污物。5mg/ml濃度的Ⅰ型鼠尾膠原用0.1mol/L NaOH中和后，滴加于繩、網(wǎng)支架上，盡量使其浸透，-60℃冰箱過夜，置于冷凍干燥機(jī)凍干。再將網(wǎng)狀物包裹繩芯(圖2)，用3號(hào)縫合線編織縫合，縫扎緊，即為繩-網(wǎng)支架，環(huán)氧乙烷消毒備用。

圖1 緯編針織示意圖

圖2 網(wǎng)狀物包裹繩芯的復(fù)合支架

4.支架-MSCs復(fù)合物制作：采用培養(yǎng)液將纖維連接蛋白配制成200μg/ml溶液。將網(wǎng)-繩支架浸入該蛋白溶液中，4℃靜置24h，常溫晾干。以注射方式將第3代自體MSCs懸液(2×107個(gè)細(xì)胞/毫升，約0.3ml用量/支架)注入支架，使細(xì)胞充分滲入支架孔隙中，并使細(xì)胞懸液在支架上達(dá)到飽和狀態(tài)，體外培養(yǎng)7天，隔天換液，制作支架-自體MSCs復(fù)合物。置入動(dòng)物前清洗掉殘余培養(yǎng)液。

5.前交叉韌帶(ACL)缺損動(dòng)物模型制作及支架-MSCs復(fù)合物的植入：參照文獻(xiàn)[4]制作ACL缺損動(dòng)物模型(圖3)。先前已抽過骨髓的新西蘭白兔，3%戊巴比妥鈉1.1ml/kg(即33mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，取雙膝內(nèi)側(cè)髕旁切口暴露關(guān)節(jié)，切斷并完全去除正常ACL，沿原ACL走向，用直徑2.7mm鉆頭分別鉆股骨和脛骨骨隧道，將支架-MSCs復(fù)合物穿經(jīng)骨隧道，于膝關(guān)節(jié)屈曲30°狀況下拉緊移植物，兩端鉆骨橋打結(jié)固定，檢查前抽屜及Lachman試驗(yàn)陰性后，逐層間斷縫合切口。患肢不固定，單籠飼養(yǎng)。術(shù)后每只兔子連續(xù)耳緣靜脈注射青霉素(50萬U/d)3天。實(shí)驗(yàn)組10只(20膝，置入支架-自體MSCs復(fù)合物)，MSCs均為自體分離回植；對(duì)照組10只(20膝，單純置入支架)。

圖3 ACL手術(shù)模型示意圖

6.前交叉韌帶缺損修復(fù)重建情況觀察：分別于移植術(shù)后12與24周，各隨機(jī)處死一半動(dòng)物。新生ACL連同脛骨及股骨取材，每組于一個(gè)時(shí)間點(diǎn)取2個(gè)標(biāo)本用于組織學(xué)檢測(cè)，8個(gè)標(biāo)本用于拉力實(shí)驗(yàn)。(1)新生韌帶-骨愈合的組織學(xué)觀察：觀察骨隧道內(nèi)移植物界面愈合情況。取材新生前交叉韌帶連同脛骨、股骨，脫鈣，沿骨隧道縱向剖開，修整，石蠟包埋，沿骨隧道縱向切片，HE染色。觀察骨隧道和新生韌帶間界面愈合的組織學(xué)變化。(2)新生ACL的力學(xué)性能檢測(cè)：取實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)，保留股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端各約3cm，去除膝關(guān)節(jié)標(biāo)本周圍軟組織及縫線，保留新生ACL。將股、脛骨端分別固定于試驗(yàn)機(jī)牽引臺(tái)兩端，股骨與脛骨輕度傾斜，拉力經(jīng)過韌帶軸線。試驗(yàn)過程滴加生理鹽水保持標(biāo)本濕潤(rùn)。先行預(yù)拉伸3次后，行拔出或拉斷試驗(yàn)，拉伸速度50mm/min，測(cè)試最大抗拉載荷(最大拔出或斷裂載荷)，觀察股骨-移植物-脛骨復(fù)合體是斷裂還是被拔出。

結(jié) 果

1.MSCs在支架材料上增殖、生長(zhǎng)的掃描電鏡觀察情況：復(fù)合培養(yǎng)48h，MSCs細(xì)胞附于支架生長(zhǎng)，增殖良好，細(xì)胞大多呈梭形，形態(tài)較佳，呈立體狀生長(zhǎng)，并分泌基質(zhì)(圖4)。

圖4 MSCs在支架上培養(yǎng)48h的掃描電鏡觀察(×500)

2.大體觀察：在大體觀察方面，術(shù)后1～3天，動(dòng)物的飲食、精神、活動(dòng)稍差，而后狀態(tài)良好，傷口愈合良好，未見感染與死亡。

3.新生韌帶-骨愈合的組織學(xué)觀察：術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組新生韌帶與骨之間產(chǎn)生許多有序的垂直膠原纖維(Sharpey′s fiber) (圖5A)，并有類軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，形成間接止點(diǎn)，說明已經(jīng)出現(xiàn)軟骨化骨過程。而對(duì)照組新生韌帶組織細(xì)胞排列較紊亂，罕見形成垂直膠原纖維(圖5B)。術(shù)后24周，實(shí)驗(yàn)組從新生韌帶向骨方向形成類似于韌帶-纖維軟骨-鈣化軟骨-骨4個(gè)區(qū)域的直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)(圖5C)。而對(duì)照組新生韌帶與骨之間產(chǎn)生許多有序的垂直膠原纖維(圖5D)，形成間接止點(diǎn)。

圖5 術(shù)后兩組病理切片(HE染色,×400)A.術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組;B.術(shù)后12周對(duì)照組;C.術(shù)后24周實(shí)驗(yàn)組;D.術(shù)后24周對(duì)照組；圖中箭頭所示為垂直膠原纖維

4.生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果：術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組新生韌帶均從骨隧道拔出(拔出率100%)；實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的最大抗拉載荷分別為72.7±23.4N、39.2±15.5N，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.38，P<0.01)。術(shù)后24周，實(shí)驗(yàn)組大多從骨隧道拔出(拔出率75%)，而對(duì)照組均拔出(拔出率100%)；實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的最大抗拉載荷分別為121.8±34.3N、67.4±26.2N，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.56，P<0.01)。

討 論

韌帶組織工程對(duì)力學(xué)性能有特殊的要求，天然蠶絲絲素纖維力學(xué)強(qiáng)度高，生物相容性好[5]。將絲素纖維經(jīng)螺旋纏繞成繩索狀后，具有很強(qiáng)的耐疲勞性能[6]。但也存在種子細(xì)胞主要附于繩狀支架表面，難以滲入支架內(nèi)部的問題，阻礙了新生組織長(zhǎng)入，有必要加以改進(jìn)。緯編針織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有更高的孔隙率，能為細(xì)胞生長(zhǎng)與組織向內(nèi)生長(zhǎng)提供更多的空間[7]。本實(shí)驗(yàn)通過擰捻-針織、繩-網(wǎng)結(jié)合進(jìn)行，將網(wǎng)狀物包裹繩芯而成支架，兼顧力學(xué)性能與細(xì)胞生長(zhǎng)。這樣既能保證支架的優(yōu)異的力學(xué)性能，又能使種子細(xì)胞較好地在支架上生長(zhǎng)，利于支架-MSCs復(fù)合物的構(gòu)建。

蠶絲絲素纖維具有緩慢的降解速度，單純以蠶絲絲素纖維制作支架，可能存在不能及時(shí)騰出足夠空間而影響組織再生等問題。PGA具有高降解速度及親水性良好，PLA具有高強(qiáng)度，支架整體的降解速率可以通過調(diào)節(jié)PLA與PGA的比例而得到較好的控制[8～10]。膠原、PGA先降解，PLA次之，蠶絲最后降解。研究表明蠶絲-PLA-PGA纖維混合繩狀支架的力學(xué)性能優(yōu)異，并具有良好的生物相容性[11]。

MSCs具有分化為成骨、軟骨、肌腱及韌帶等細(xì)胞的多向分化潛能，理論上有利于移植后形成韌帶-骨愈合的致密結(jié)締組織、纖維軟骨、鈣化纖維軟骨、骨的四區(qū)為特征的直接止點(diǎn)[12]。理想的韌帶組織工程種子細(xì)胞應(yīng)具有以下特性：來源廣，數(shù)量充足，增殖能力強(qiáng)，可大量擴(kuò)增并且具備特定的生物學(xué)功能，分泌具有合適構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)。Ge等[13]通過體外細(xì)胞培養(yǎng)比較內(nèi)側(cè)副韌帶成纖維細(xì)胞、ACL成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、MSCs幾種細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：MSCs增殖率和分泌膠原總量是最高的，并且3種細(xì)胞都表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型膠原，α-肌動(dòng)蛋白，都不表達(dá)Ⅱ型膠原，表明與其他幾種細(xì)胞相比，MSCs可能是較理想的種子細(xì)胞。有研究表明，MSCs能促進(jìn)ACL重建后腱-骨愈合作用，縮短腱骨愈合時(shí)間，可形成類似正常的直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)，而非瘢痕連接的間接止點(diǎn)[14,15]。MSCs可分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原、腱糖蛋白C以及一些對(duì)韌帶修復(fù)有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子與組織酶，符合韌帶生物學(xué)特征，是韌帶組織工程較理想的種子細(xì)胞[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周可形成間接止點(diǎn)，術(shù)后24周可形成類似于直接止點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。對(duì)照組術(shù)后12周，新生韌帶組織細(xì)胞排列較紊亂，術(shù)后24周可形成間接止點(diǎn)。在力學(xué)性能方面：術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組新生韌帶均從骨隧道拔出；術(shù)后24周，實(shí)驗(yàn)組大多從骨隧道拔出，而對(duì)照組均拔出。在最大抗拉載荷方面，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與成年兔正常ACL均有較大差距。因此，支架材料與構(gòu)建及種子細(xì)胞的選擇等問題尚需進(jìn)一步研究。

1 Leong NL, Petrigliano FA, McAllister DR.Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction[J]. J Biomed Mater Res A, 2014,102(5):1614-1624

2 張文元,楊亞冬,房國(guó)堅(jiān),等.兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離生長(zhǎng)及凍存技術(shù)研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(6):651-653

3 楊亞冬,張文元,房國(guó)堅(jiān),等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原檢測(cè)及其變化特點(diǎn)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(3):455-458

4 魏學(xué)磊,李峰,林霖,等.轉(zhuǎn)基因兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)異體跟腱重建前交叉韌帶生物力學(xué)特性的影響[J].醫(yī)用生物力學(xué),2008,23(2):103-106

5 Chen K,Sahoo S,He P,etal. A hybrid silk/RADA-based fibrous scaffold with triple hierarchy for ligament regeneration[J]. Tissue Eng Part A,2012,18(13-14):1399-1409

6 Li X, Snedeker JG. Wired silk architectures provide a biomimetic ACL tissue engineering scaffold[J]. J Mech Behav Biomed Mater,2013,22:30-40

7 陶沙,張佩華,郭正,等.組織工程人工肌腱支架的制備工藝及降解性能[J].東華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2009,35(2):153-156,185

8 Mandal BB,Kundu SC.Biospinning by silkworms:Silk fiber matrices for tissue engineering applications[J].Acta Biomater,2010，6(2):360-371

9 Cao D, Liu W, Wei X,etal. In vitro tendon engineering with avian tenocytes and polyglycolic acids: a preliminary report[J]. Tissue Eng,2006,12(5):1369-1377

10 Surrao DC, Waldman SD, Amsden BG.Biomimetic poly(lactide) based fibrous scaffolds for ligament tissue engineering[J]. Acta Biomater, 2012,8(11):3997-4006

11 張文元,楊亞冬,李穎,等.蠶絲-聚乳酸-聚羥基乙酸纖維混合編織繩狀支架的生物學(xué)性能[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013,30(5):667-670

12 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL,etal. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,418(6893):41-49

13 Ge Z, Goh JC, Lee EH.Selection of cell source for ligament tissue engineering[J]. Cell Transplant,2005,14(8):573-583

14 周維鋒,童松林,徐建杰,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的生物力學(xué)研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2013,29(7):931-933

15 黃相杰,姜紅江,孟鵬.兔骨髓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(9):39-41

16 Spoliti M, Iudicone P, Leone R,etal.In vitro release and expansion of mesenchymal stem cells by a hyaluronic acid scaffold used in combination with bone marrow[J].Muscles Ligaments Tendons J,2013,2(4):289-294

(修回日期：2015-02-13)

Gradient Degraded Scaffold Seeded with Mesenchymal Stem Cells Repairing Anterior Cruciate Ligament in Rabbits.

ZhangWenyuan，YangYadong，ZhangKeji，etal.

InstituteofBioengineering，ZhejiangAcademyofMedicalSciences，Zhejiang310013，China

Objective To use a gradient degraded wire-mesh scaffold compound autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) repairing rabbit anterior cruciate ligament(ACL) defect. Methods After polylactic acid(PLA)∶silk fibroin(SF)∶polylactic acid(PGA) fibers(mass ratio 7∶6∶5) being mixed, they were twisted into a rope core and knitted into mesh respectively, then the rope core was wrapped with the mesh to obtain wire-mesh binding scaffold.Autologous MSCs were seeded in the binding scaffold to produce scaffold-MSCs complexe.The complexe was implanted in defect of ACL in rabbits, as experimental group.Only scaffold was implanted, as control group.12 and 24 weeks postoperatively,the animals were sacrificed for HE staining of longitudinal sections of neo-ACL together with tibia or femur and biomechanical testing of newborn ACL-bone. Results Twelve weeks postoperatively, many Sharpey′s fibers were generated to form indirect stop point in experimental group. While in control group,cells lineage was disorder, and rare Sharpey′s fibers were formed.Twenty four weeks postoperatively,a structure similar to direct stop point of four areas from newborn ACL to bone was formed in experimental group.While in control group, many Sharpey′s fibers were generated to form indirect stop point.Biomechanical testing of newborn ACL-bone results showed that: 12 and 24 weeks postoperatively, the maximum load of newborn ACL-bone in experimental group were 72.7±23.4N and 121.8±34.3N,respectively,and there were statistical significance(P<0.01) compared with the control group.Conclusion The gradient degraded wire-mesh scaffold seeded with MSCs can make ACL defect get a well repair.

Anterior cruciate ligament; Repair; Mesenchymal stem cells; Gradient degraded scaffold

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY13H060004)，浙江省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科群項(xiàng)目生物醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科群(XKQ-010-001)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014ZDA005，2013KYA045)

310013 杭州，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所(張文元、楊亞冬、張科技、房國(guó)堅(jiān))；浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所(唐靚)

張文元，電子信箱：zhangwy61@163.com

R318

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.011

2015-02-02)