梁 珍 姜 堯 石姣姣 侯春英 張 蕊 楊 楠 劉雁勇 左萍萍

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噬菌體展示技術(shù)篩選小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合多肽

梁 珍 姜 堯 石姣姣 侯春英 張 蕊 楊 楠 劉雁勇 左萍萍

目的 利用噬菌體七肽庫，篩選出與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽。方法 利用噬菌體展示技術(shù)和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞，經(jīng)過多次3輪篩選，每次挑取12個噬菌體單克隆進(jìn)行DNA測序，分析得到多肽序列，并利用免疫組織化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證多肽的特異性。結(jié)果 多肽AF(AGALHQF)與小細(xì)胞肺癌病理組織有較高的親和性。結(jié)論 噬菌體展示技術(shù)篩選的多肽AF可望為小細(xì)胞肺癌靶向治療提供新的方向。

小細(xì)胞肺癌 噬菌體展示技術(shù) 多肽

小細(xì)胞肺癌是肺癌中惡性程度最高的腫瘤之一，每年15%腫瘤患者被確診為小細(xì)胞肺癌[1]。因其倍增時間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)，故患者5年生存率極低，僅為12%[2,3]。化療是治療小細(xì)胞肺癌的基石，但大部分化療由于藥物特異性差，而出現(xiàn)骨髓抑制、嘔吐等不良反應(yīng)[4]。隨著靶向治療的出現(xiàn)，一些針對于小細(xì)胞肺癌生物學(xué)特征的靶向藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床，像基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、沙利度胺等。但是，理想的治療效果鮮少報道[5]。因此，尋找特異性強(qiáng)、敏感度高的靶分子顯得尤其重要。

本研究主要以小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446為靶分子，利用7肽噬菌體庫進(jìn)行體外篩選，從而獲得小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446特異性結(jié)合的多肽，以期為小細(xì)胞肺癌靶向治療提供新的策略。

材料與方法

1.材料: Ph.D.-7TM噬菌體展示肽庫試劑盒(New England Biolabs公司，美國)。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，中國)。RPMI1640培養(yǎng)基和0.25%胰酶(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 北京)。鏈霉素-FITC 和鏈霉素(Sigma公司, 上海)。DAPI和抗熒光衰減封片劑(中山金橋公司, 北京)。

2.方法: (1)細(xì)胞培養(yǎng): 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃恒溫，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80%匯合時，進(jìn)行傳代。(2)特異性篩選: 消化、收集H446細(xì)胞，離心，棄上清，PBS洗3次。封閉緩沖液重懸細(xì)胞，4℃作用1h，離心，棄上清。然后，噬菌體肽庫重懸細(xì)胞，室溫下作用1h。TBST洗去未結(jié)合的噬菌體。之后，用洗脫緩沖液重懸細(xì)胞，室溫下作用15min，離心，留上清，此即未擴(kuò)增的噬菌體。然后，將噬菌體擴(kuò)增，純化，測效價，再進(jìn)行下一輪淘選。(3) DNA測序: 取第3輪未擴(kuò)增的噬菌體鋪至IPTG/X-gal平板，隨機(jī)挑選12個藍(lán)斑進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體DNA，此即為噬菌體DNA模板。取適量模板進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察有無DNA條帶，將觀察到DNA條帶的模板送至上海英俊進(jìn)行測序。根據(jù)DNA序列推導(dǎo)出多肽序列。(4) 多肽特異性驗(yàn)證: 將出現(xiàn)次數(shù)最多的4個多肽序列委托上海吉爾生化公司進(jìn)行合成，并將N端進(jìn)行生物素標(biāo)記。分別取人正常心、肝、脾、肺、腎正常組織及小細(xì)胞肺癌臨床患者病理組織石蠟切片，將其脫蠟至水。25μg/ml鏈霉素中和內(nèi)源性生物素，室溫下將肽(1mg/ml, 稀釋為1∶200)分別于各組織孵育1h。然后與FITC標(biāo)記的鏈霉素(1mg/ml, 稀釋為1∶100)室溫下作用1h。DAPI和抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)合情況。

結(jié) 果

1.特異性篩選：以小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446 為靶細(xì)胞，對Ph.D.-7TM 噬菌體展示肽庫進(jìn)行多次3輪篩選，1、2輪淘選效價測試為1011pfu/ml，均符合要求，3輪淘選為防止產(chǎn)生偏噬，不需擴(kuò)增，直接提取測序，可得到與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446特異性結(jié)合的噬菌體。圖1為3輪洗脫物藍(lán)斑照片。

圖1 噬菌體展示3輪淘選洗脫物藍(lán)斑

2.DNA提?。簩⑻崛〉降腄NA模板進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察發(fā)現(xiàn)大部分模板均出現(xiàn)條帶(圖2)，說明出現(xiàn)的藍(lán)斑都含有DNA。

圖2 DNA模板在瓊脂糖凝膠中電泳情況

3.DNA序列測定：將瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)條帶的DNA模板測序，結(jié)果顯示噬菌體克隆中出現(xiàn)多種氨基酸序列，其中展示如下4種氨基酸序列的噬菌體被富集(表1)。

表1 噬菌體克隆序列分析

4.肽特異性驗(yàn)證：小細(xì)胞肺癌臨床患者腫瘤組織和人心、肝、脾、肺、腎正常組織石蠟切片與各多肽孵育，熒光顯微鏡下觀察結(jié)合情況。多肽AF與腫瘤組織顯著性結(jié)合，而與正常組織極少結(jié)合，顯著優(yōu)于其他多肽，另外3個多肽與正常組織部分結(jié)合，詳見圖3。

圖3 肽AF與小細(xì)胞肺癌臨床患者腫瘤組織和人心、肝、脾、肺、腎正常組織結(jié)合情況A.SCLC腫瘤組織；B.心；C.肝；D.脾；E.肺；F.腎

尋找特異性強(qiáng)的靶分子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)針對性的靶向治療是現(xiàn)今腫瘤治療的一個趨勢。而低分子多肽，因其相對分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)簡單，穿透性強(qiáng)，免疫誘導(dǎo)弱，而越來越廣泛作為靶向載體被人熟知[6]。以腫瘤組織某些異常表達(dá)的分子為靶分子，篩選出能與其特異性結(jié)合的低分子活性肽段，利用氨基酸分子的某些基團(tuán)連接到藥物上，從而提高療效，降低毒性不良反應(yīng)[7,8]。

噬菌體展示技術(shù)，自Smith創(chuàng)建以來，日益完善。在分離特異性與靶分子結(jié)合的多肽或抗體方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的潛力。尤其是當(dāng)靶分子為細(xì)胞時，這種分離的有效性較已知靶分子大大增加。因?yàn)榧?xì)胞表面的結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，這樣有利于篩選出共有序列[9,10]。已經(jīng)有研究者利用這一技術(shù)得到特異性結(jié)合的肽或抗體。Jun等[11]利用噬菌體展示獲得的肽所制備的靶向藥物更好地被腫瘤細(xì)胞攝取?；诖耍删w展示技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于各腫瘤的靶向研究中。

然而，噬菌體展示技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是所篩選出來的靶分子特異性不夠強(qiáng)，最大限度地減少非特異性結(jié)合，而同時提高噬菌體的富集始終是改進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)的目標(biāo)。目前，有研究者通過體內(nèi)篩選，從而最大限度地還原腫瘤生長的環(huán)境[12]；更有研究者利用干細(xì)胞作為靶分子，以提高靶分子的特異性，從而改善了藥物的體內(nèi)分布情況[13]。

本研究初步鑒定肽AF與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和力，同時發(fā)現(xiàn)其能與小細(xì)胞肺癌病理組織強(qiáng)特異性地結(jié)合。此發(fā)現(xiàn)表明可能篩選到一種新的小細(xì)胞肺癌相關(guān)抗原的配體。這將為靶向藥物的制備提供新的靶分子，制備特異性更好的靶向藥物。

1 Siegel R, Ma J, Zou Z,etal. Cancer Statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014, 64(1): 9-29

2 David MJ, Bruce EJ. Small-cell lung cancer[J]. The Lancet, 2005, 366(9494): 1385-1396

3 Hoang T, Schiller DJH. Systemic treatment of small cell lung cancer[J]. American Journal of Cancer, 2002, 1(6):397-408

4 Kalemkerian GP, Akerley W, Bogner P,etal. Small cell lung cancer[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2013,11(1):78-98

5 Rossi A, Maione P, Palazzolo G,etal. New targeted therapies and small-cell lung cancer[J]. Clinical Lung Cancer, 2008, 5: 271-279

6 Terada T, Inui K. Peptide transporters: structure, function, regulation and application for drug delivery[J]. Curr Drug Metab, 2004,5(1):85-94

7 Kulkarni SA, Feng SS. Effects of surface modification on delivery efficiency of biodegradable nanoparticles across the blood-brain barrier[J]. Nanomedicine :Lond, 2011, 6: 377-394

8 Koopaei MN, Dinarvand R, Amini M,etal. Docetaxel immunonanocarriers as targeted delivery systems for HER 2-positive tumor cells: preparation, characterization, and cytotoxicity studies[J]. Int J Nanomedicine, 2011, 6: 1903-1912

9 Du B, Han H, Wang Z,etal. Targeted drug delivery to hepatocarcinoma in vivo by phage-displayed specific binding peptide[J]. Mol Cancer Res, 2010,8:135-144

10 Veleva AN, Nepal DB, Frederick CB,etal. Efficient in vivo selection of a novel tumor-associated peptide from a phage display library[J]. Molecules, 2011, 16(1):900-914

11 Jun Q, Yi Q,Xiu L,etal.specific targeting of A54 homing peptide-functionalized dextran-g-poly(lactic-co-glycolic acid) micelles to tumor cells[J]. Int J Nanomedicine,2015,10:665-675

12 Suresh KS, Emilie R, Udaya T,etal. CD133-targeted paclitaxel delivery inhibits local tumor recurrence in a mouse model of breast cancer[J]. J Control Release, 2013, 171(3): 280-287

13 Yang N, Jiang Y, Zhang H,etal. Targeting docetaxel-PLA nanoparticles eradicate circulating cancer stem-like cells and inhibit liver metastasise[J]. Mol Pharm, 2015, 12(1):232-239

(修回日期：2015-03-20)

Screening of Small Cell Lung Cancer Cells Specific Polypeptide from a Phage Display Peptide Library.

LiangZhen,JiangYao,ShiJiaojiao,etal.

DepartmentofPharmacology,InstituteofBasicMedicalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences&SchoolofBasicMedicine,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China

Objective To obtain the polypeptides, which specifically recognize small cell lung cancer cells (SCLCs) from peptide libraries. Methods After several times of three rounds of biopanning by applying phage display technology in SCLCs H446 cells, we selected twelve clones to extract DNA, and then these DNA were sequenced and deduced to amine acid sequence. Immunohistochemical method was used to identify the specificity of these polypeptides. Results Polypeptide AF specifically recognized SCLC tissue section. Conclusion Polypeptides AF, obtained by phage displayed technology, potentially provides new strategy in the targeting treatment of small cell lung cancer.

Small cell lung cancer (SCLC)；Phage displayed technology；Polypeptides

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展計劃項(xiàng)目(“973”計劃項(xiàng)目)(2010CB934002)

100005 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院藥理室

左萍萍，教授，電子信箱：zuopp@126.com

R9

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.007

2015-03-02)