宮 莉， 李彤輝， 包 雪，劉 野， 劉智輝

（長春工業(yè)大學 化學與生命科學學院，吉林 長春 130012）

0 引 言

天然黃酮類化合物屬于植物細胞的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于中草藥植物中，是自然界藥用植物中主要活性成分之一，具有抗菌、消炎、降血脂及清除自由基和抗氧化能力，對防止疾病、抗衰老、增加機體免疫力、促進人體健康有著積極的意義［1－6］。

北五味子（Schisandra Chinensis）是木蘭科植物五味子的成熟果實，是我國重要的名貴中藥材之一，主要分布于遼寧、吉林、黑龍江等地。其性溫潤，治療作用廣泛，有斂肺生津、補腎寧心、收斂固澀之功效。五味子的果實中除含有多糖、木脂素、揮發(fā)油等成分外，還含有檞皮素、山萘酚等黃酮類化合物［7－10］。目前，有關五味子黃酮提取的研究報導相對較少［9－12］，尤其是有關五味子黃酮提取方法及五味子黃酮的抗氧化活性、抑菌活性等方面的研究尚未見報導。本實驗對五味子黃酮的提取方法、提取工藝條件及其生物活性進行了較全面、細致的研究，以期為五味子的產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供參考。

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料

北五味子成熟果實，采于吉林省長白山區(qū)。

1.2 主要試劑

蘆丁標準品、石油醚、95%乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、鄰苯三酚、Tris－HCl緩沖 液、PBS緩沖溶液、鄰二氮菲、FeSO4、H2O2等。

1.3 主要儀器

WD800微波爐，LG電子電器有限公司；

KQ－25OB超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；RE52－98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AL104電子分析天平，上海梅特勒－托利多儀器廠；

UV762雙光束紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；

LGJ－10冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠。

2 實驗方法

2.1 材料預處理

北五味子果實，60℃恒溫干燥至恒重，粉碎，細粉經(jīng)石油醚60℃索氏回流脫脂3次，每次1h。干燥至恒重，置于真空干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 提取方法的選擇

準確稱取預處理后的五味子干粉5.0g，以料液比1∶30（g／mL）加入60%的乙醇，浸泡30min，分別采用超聲波法［10－11］、微波法［13－14］及常規(guī)的熱回流法［15－16］提取五味子黃酮。每種方法平行做3次，考核3種方法對提取率的影響。

2.3 超聲波法提取條件的優(yōu)化

稱取預處理的五味子干粉5.0g，于250mL三角瓶中，加入乙醇溶液，常溫下攪拌浸泡30min后，采用超聲波法提取五味子黃酮，各條件平行做3次?？己肆弦罕?、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波處理時間、處理溫度等條件對提取率的影響。在此基礎上對提取條件進行正交優(yōu)化，所得黃酮提取液經(jīng)減壓蒸餾濃縮后，冷凍干燥保存。

2.4 黃酮含量測定

采用硝酸鋁顯色法測定提取液中五味子總黃酮的含量。

2.4.1 標準曲線繪制

參考石太淵［10］的方法并有所改進。分別吸取蘆?。?0%乙醇標準溶液（0.1mg／mL）0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL置 于10mL容量瓶中，對應加入5.00、4.80、4.60、4.40、4.20、4.00、3.80mL的70%乙醇，搖勻，分別加入10%亞硝酸鈉溶液0.30mL，搖勻，放置6min。加入4%氫氧化鈉溶液4.00mL，搖勻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，以0.00mL蘆?。掖既芤簽閷φ眨?10nm處測吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程y＝10.18x＋0.001 4，R2＝0.999 88，在0.000～0.012mg／mL濃度范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度具有良好的線性關系。

2.4.2 總黃酮得率的測定

準確吸取五味子總黃酮提取液1.00mL，用70%乙醇稀釋并定容至50mL。取1.00mL待測液于10mL容量瓶中，按2.4.1中的方法，于510nm處測定其吸光度，代入回歸方程，計算出黃酮含量c（mg／mL），并按下式計算黃酮得率（mg·g－1）：

2.5 五味子黃酮抗氧化性能研究

2.5.1 對超氧陰離子自由基（O－2·）清除能力的實驗

參考史禮貌［17］、李鵬婧［18］的研究，采用鄰苯三酚自氧化法，于325nm處，每隔30s測定反應體系的吸光度，分別計算出鄰苯三酚的自氧化速率ΔA0和加入不同質(zhì)量濃度五味子黃酮樣品后的鄰苯三酚自氧化速率ΔAx，以同濃度的Vc做對照?！で宄视嬎闳缦率剑?/p>

2.5.2 對羥基自由基（·OH）清除能力的實驗

參考陳宗保［14］、史禮貌［17］的研究，采用Fenton反應，在6支10mL棕色容量瓶中分別加入1mmol／L的鄰二氮菲溶液1.0mL、pH值為7.4的PBS緩沖溶液2.0mL、1mmol／L FeSO4溶液1.0mL、0.1%（v／v）的H2O21.0mL，搖勻。向其中5支容量瓶中分別加入不同質(zhì)量濃度的五味子黃酮樣品各2.0mL，最后用蒸餾水定容至10mL，搖勻，37℃保溫1h，于510nm處測定未加受試物的吸光度A0和各樣品吸光度Ax，以同濃度的Vc做對照，按下式計算·OH清除率。

2.6 五味子黃酮抑菌性能實驗

參考劉冬梅［19］的研究，采用牛津杯抑菌法，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為實驗菌，考核不同濃度的五味子黃酮水溶液的抑菌效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 五味子黃酮提取方法的選擇結(jié)果

3種方法提取五味子黃酮的實驗結(jié)果見表1。

表1 3種方法提取五味子黃酮的實驗結(jié)果

由表1可知，在3種提取方法中，微波法得率最低，超聲波法和熱回流法得率相對較高，尤其是超聲波法得率最高為37.01mg／g，且用時較短，溫度易于控制。這是由于超聲波產(chǎn)生的機械作用及熱效應等能加速物料中有效成分的擴散和浸出，較熱回流法大大縮短了提取時間，提高了有效成分的提取率和原料的利用率。在提取實驗中還發(fā)現(xiàn)，微波法雖用時短，但溫度升高較快且難以控制，溶劑蒸發(fā)量較大，不僅黃酮得率較低，其生物活性也較其他兩種方法所得黃酮活性弱。

3.2 五味子黃酮提取正交實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將超聲波功率設定為300W，選擇提取溫度、提取時間、乙醇濃度及料液比這4個對實驗影響較大的因素，設計L9（34）的正交試驗，實驗安排、實驗結(jié)果、實驗結(jié)果的方差分析分別見表2、表3和表4。

表2 超聲波提取五味子黃酮的正交試驗因素與水平表

表3 超聲波提取五味子黃酮的正交試驗結(jié)果表

從表3中的極差可以看出，影響總黃酮得率的各因素主次順序為B＞C＞D＞A，優(yōu)化的提取條件為B2C1D3A1。

表4 正交實驗結(jié)果方差分析

從表4中的方差分析結(jié)果可以看出，乙醇濃度對提取率有極顯著影響，提取溫度有顯著影響。根據(jù)F值可以看出，各因素對提取率影響的大小次序為B＞C＞D＞A，這與直觀分析法得出的結(jié)果一致。

按照提取條件為B2C1D3A1的工藝條件進行了3次驗證性試驗，結(jié)果五味子總黃酮平均得率為41.25mg／g，是石太淵［10］等方法的1.87倍，且具有較強的生物活性。

3.3 五味子黃酮抗氧化性能

圖1 五味子黃酮對·的清除作用

由圖1可以看出，提取實驗所得的五味子黃酮對鄰苯三酚自氧化體系中所產(chǎn)生的·的清除作用略低于Vc，但仍表現(xiàn)出良好的抑制作用，其對·的清除率可達相同質(zhì)量濃度Vc的90%，且其清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而明顯升高。

3.3.2 對·OH清除作用

按2.5.2的方法，對所得五味子黃酮進行·OH清除作用測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 五味子黃酮對·OH的清除作用

由圖2可以看出，所得五味子黃酮對Fenton反應體系中所產(chǎn)生的·OH的清除作用明顯高于相同質(zhì)量濃度的Vc，為Vc的1.3倍，說明五味子黃酮對·OH有較強的清除作用。

3.4 五味子黃酮的抑菌性能

將實驗所得五味子黃酮干粉用少量65%乙醇溶解，再用蒸餾水稀釋成1、3、5、10mg／mL的溶液，采用平板－牛津杯抑菌法進行抑菌實驗，加樣量為200μL，結(jié)果表明，當樣品濃度為3mg／mL時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，抑菌效果如圖3所示。

圖3 五味子黃酮抑菌效果圖

這與邊才苗［20］、許瑞波［21］等的研究結(jié)果一致，且抑菌效果隨著五味子黃酮濃度增大而明顯增強。

4 結(jié) 語

超聲波能有效地促進物質(zhì)的溶解和擴散，超聲波法提取植物有效成分具有操作簡便，溫度低，時間短，且有效成分不易被破壞等優(yōu)點，因此，廣泛應用于植物有效成分的提取研究中。五味子黃酮提取實驗結(jié)果表明，五味子黃酮的較優(yōu)提取方法為超聲波輔助法，優(yōu)化后的提取工藝條件為：超聲波功率300W、乙醇濃度65%，提取溫度45℃，提取時間20min，料液比1∶30（g／mL）。黃酮平均得率為41.25mg／g。

抑菌活性實驗表明，五味子黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，且抑菌效果隨著溶液濃度增大而顯著增強。

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