楊 劍，牛曉藝，譚紅連，黃 明，梁萬(wàn)文，胡庭俊＊

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530021）

炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和機(jī)能障礙。通常炎癥是有益的，但更多時(shí)候?qū)?dòng)物機(jī)體有害。炎癥反應(yīng)能夠成為一些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，嚴(yán)重時(shí)甚至可以危及生命。因此，對(duì)于抗炎藥物的研究顯得極其重要。糖皮質(zhì)激素（如地塞米松），具有極強(qiáng)且迅速的抗炎作用，對(duì)于哮喘炎癥、葡萄膜炎、肺炎以及手術(shù)后炎癥反應(yīng)均有良好的抗炎效果［1－3］。但是其不良反應(yīng)的報(bào)道也逐漸增多，如精神異常、過(guò)敏性皮疹等癥狀［4］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥及其制劑也具有較好的抗炎作用，極具開(kāi)發(fā)潛力。有文獻(xiàn)表明，黃芩苷和鹽酸小檗堿在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的抗炎作用［5－8］?！叭S連”合劑是由黃芩、黃連、連翹等按中獸醫(yī)理論組方的中獸藥新制劑，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室自主研制，主要活性成分為黃芩苷、鹽酸小檗堿、連翹苷等。本課題組前期研究表明，“三黃連”合劑對(duì)于海豚鏈球菌引起的羅非魚(yú)鏈球菌病有一定的預(yù)防與治療作用。研究其抗炎作用，可為開(kāi)發(fā)中獸藥新復(fù)方“三黃連”合劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重為20g～25g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7d。小鼠單核－巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 地塞米松磷酸鈉注射液為鄭州卓峰制藥有限公司產(chǎn)品；黃芩、連翹等藥材飲片購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)南寧市山草堂中藥材店；脂多糖LPS為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；二甲基亞砜為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品；TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA 試劑盒為上海勁馬生物科技有限公司產(chǎn)品；0114型打孔器為寧波得力公司產(chǎn)品；MCO－5AC二氧化碳培養(yǎng)箱為日本三洋株式會(huì)社產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡為日本尼康產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)為蘇凈安泰公司產(chǎn)品；168－1130型酶標(biāo)儀為美國(guó)BIO－RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 “三黃連”合劑的制備 “三黃連”合劑（0.5 g／mL），廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室自制。制備方法：按照復(fù)方比例稱(chēng)取中藥材共50g，加入500mL蒸餾水浸泡0.5h，后100 ℃水浴1h，過(guò)濾，保留濾液；濾渣再加入500mL蒸餾水繼續(xù)水浴，過(guò)濾取濾液，重復(fù)2次；將3次過(guò)濾所得濾液合并，3 000r／min離心30min，取上清于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至300mL；加入950mL／L酒精使混合液中酒精濃度為800mL／L，靜置24h，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收酒精，濃縮至100mL，為“三黃連”合劑；經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝眉?xì)胞維持液稀釋至所需濃度。

1.2.2 體內(nèi)抗炎試驗(yàn) 取50只健康昆明系小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。空白對(duì)照組灌胃30mL／kg生理鹽水，“三黃連”合劑高、中、低劑量組分別灌服30、15、7.5mL／kg“三黃連”合劑，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液10ml／kg（換算為地塞米松的注射含量為25mg／kg）。各組均連續(xù)用藥5d。根據(jù)參考文獻(xiàn)方法［9］，最后一次給藥1h后，將0.04mL二甲苯均勻涂于小鼠右耳兩面，左耳作為對(duì)照。致炎后20min將小鼠稱(chēng)重后脫頸椎法處死，沿耳廓線剪下兩耳，用直徑6mm 的打孔器分別在兩耳的同一部位打下左右耳片，隨即用電子天平稱(chēng)重，以?xún)啥亓恐钭鳛檠仔阅[脹度，并計(jì)算耳腫脹率，公式如下：小鼠耳腫脹度＝左耳重量－右耳重量；耳腫脹率＝［（左耳重量－右耳重量）／右耳重量］×100%。同時(shí)摘取各小鼠的胸腺、脾臟、肝臟和腎臟，稱(chēng)重后計(jì)算小鼠的胸腺、脾臟、肝臟、腎臟指數(shù)。

1.2.3 體外抗炎試驗(yàn)

1.2.3.1 “三黃連”合劑的細(xì)胞毒性作用 采用MTT法對(duì)“三黃連”合劑的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法調(diào)整濃度為4×105cells／mL，100μL／孔，接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)過(guò)夜?？瞻讓?duì)照組加入100μL細(xì)胞維持液；LPS組中LPS終濃度為1μg／mL；高、中、低劑量藥物組中“三黃連”合劑終濃度 分 別 為2.00 mg／mL、1.00 mg／mL 和0.50 mg／mL；藥物處理1h后加入終濃度為1μg／mL LPS處理。培養(yǎng)20h后每孔加入10μL 5mg／mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上清，加入100μL DMSO，避光反應(yīng)10min后測(cè)定OD 490nm值。

1.2.3.2 NO 含 量 測(cè) 定 根 據(jù)“三 黃 連”合 劑 對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果，判斷“三黃連”合劑的安全劑量范圍。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法調(diào)整濃度為4×105cells／mL，96孔板培養(yǎng)，100μL／孔，于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中37℃過(guò)夜。設(shè)置空白對(duì)照組、不同濃度藥物組，每組5個(gè)重復(fù)。藥物組各組中分別加入“三黃連”合劑，使終濃度分別為2.00、1.00、0.50mg／mL，藥物作用1h后，以終濃度為1μg／mL LPS刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24h；培養(yǎng)結(jié)束后，吸取培養(yǎng)上清，加入等量的Griess試劑，測(cè)定OD 490nm值。

1.2.3.3 細(xì)胞因子的測(cè)定（TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8）

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105cells／mL，96 孔板培養(yǎng)，100 μL／孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。設(shè)置空白對(duì)照組、不同濃度藥物組，每組5個(gè)重復(fù)。藥物組各組中分別加入“三黃連”合劑，使終濃度分別為2.00、1.00、0.50 mg／mL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下作用1h后，以終濃度為1μg／mL LPS刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24h；培養(yǎng)結(jié)束后吸取上清，各指標(biāo)測(cè)定方法參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定OD 450nm值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ˉx±SD形式表示，數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件處理，Duncan法分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)抗炎試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 “三黃連”合劑對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響 各組小鼠耳腫脹度及耳腫脹率結(jié)果如表1。陽(yáng)性對(duì)照組及“三黃連”合劑高、中劑量組對(duì)小鼠的耳腫脹度和耳腫脹率均小于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01）。低劑量組小鼠的耳腫脹度和耳腫脹率均小于空白對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。高劑量藥物組小鼠的耳腫脹度及耳腫脹率均小于陽(yáng)性對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.1.2 “三黃連”合劑對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 肝臟指數(shù)：陽(yáng)性對(duì)照組的肝臟指數(shù)極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），而“三黃連”合劑各個(gè)劑量組與空白對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）（圖1）。

腎臟指數(shù)：各組的腎臟指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）（圖2）。

脾臟指數(shù)：陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的脾臟指數(shù)小于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01），“三黃連”合劑各劑量組與空白對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）（圖3）。

胸腺指數(shù)：陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的胸腺指數(shù)小于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01），“三黃連”合劑中劑量組小鼠胸腺指數(shù)大于空白對(duì)照組，且差異顯著（P＜0.05）。“三黃連”合劑高、低劑量組胸腺指數(shù)與空白對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

2.2 體外抗炎試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

各處理組OD 490nm值與空白對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），表明LPS對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響，高、中、低濃度（2.00、1.00、0.50mg／mL）的“三黃連”合劑在24 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)（圖5）。

2.2.2 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO 的影響 采用NaNO2制備不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液并測(cè)定NO2－，根據(jù)濃度及OD 490nm值進(jìn)行線性分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝0.002 1x＋0.058 2（R2＝0.998 7）。Griess法檢測(cè)待測(cè)樣細(xì)胞培養(yǎng)上清的OD 490nm值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組的NO 生成量（圖6）。LPS組的NO生成量極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），各濃度藥物組及藥物＋LPS組的NO 生成量與空白對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；空白對(duì)照組、各濃度藥物組和藥物＋LPS組的NO 生成量均小于LPS組，且差異極顯著（P＜0.01）。高、中、低濃度組的NO生成量隨著藥物濃度的增加而降低，提示“三黃連”合劑在0.5 mg／mL～2.0 mg／mL 濃度范圍內(nèi)可抑制RAW264.7細(xì)胞NO生成，且呈濃度依賴(lài)關(guān)系。

2.2.3 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子生成的影響

2.2.3.1 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF－α生成的影響 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF－α的影響結(jié)果如圖7。LPS組TNF－α的生成量升高，與空白對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），而各個(gè)濃度”三黃連”合劑組均抑制了TNF－α的產(chǎn)生，與LPS組相比均差異極顯著（P＜0.01），并且呈濃度依賴(lài)關(guān)系。

表1 “三黃連”合劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 1 Effects of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on xylene－induced ear edema in mice

圖1 “三黃連”合劑對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.1 Effect of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on liver index in mice

圖2 “三黃連”合劑對(duì)小鼠腎臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on renal index in mice

圖3 “三黃連”合劑對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響Fig.3 Effect of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on spleen index in mice

圖4 “三黃連”合劑對(duì)小鼠胸腺指數(shù)的影響Fig.4 Effect of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on thymus index in mice

圖5 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用Fig.5 The toxic effects of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on RAW264.7cells

圖6 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響Fig.6 Effects of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on NO secretion in RAW264.7cells

圖7 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF－α的影響Fig.7 Effects of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on TNF－αsecretion in RAW264.7cells

2.2.3.2 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL－8生成的影響 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)細(xì)胞樣品的OD 450nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到各個(gè)重復(fù)樣本的IL－8濃度，各組比較結(jié)果見(jiàn)圖8，LPS組細(xì)胞生成的IL－8濃度顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），低濃度（0.5mg／mL）和中濃度（1.0mg／mL）組與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；空白對(duì)照組及各個(gè)濃度藥物組IL－8濃度均小于LPS組，且差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明“三黃連”合劑在0.5 mg／mL～2.0 mg／mL 范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的IL－8的生成具有抑制作用，且呈濃度依賴(lài)關(guān)系。

2.2.3.3 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL－6生成的影響 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣所測(cè)得的OD 450nm值進(jìn)行運(yùn)算，得到各個(gè)重復(fù)樣本的IL－6濃度，各組比較結(jié)果見(jiàn)圖9，LPS組的IL－6含量高于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01），而各個(gè)濃度藥物組與空白對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；各個(gè)濃度藥物組與LPS組相比差異顯著（P＜0.01或P＜0.05）。提示“三黃連”合劑在0.5mg／mL～2.0mg／mL濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL－6的生成具有抑制作用，且呈濃度依賴(lài)關(guān)系。

2.2.3.4 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL－1β生成的影響 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣的OD 450nm值進(jìn)行運(yùn)算，得到各個(gè)重復(fù)樣本的IL－1β濃度，各組比較結(jié)果見(jiàn)圖10，LPS組RAW264.7細(xì)胞生成的IL－1β量顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），而低濃度組（0.5 mg／mL）IL－1β生成量也顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；三個(gè)濃度”三黃連”合劑組IL－1β生成量雖小于LPS組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖8 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL－8的影響Fig.8 Effects of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on IL－8secretion in RAW264.7cells

圖9 “三黃連”合劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL－6的影響Fig.9 Effects of Chinese herbal compound“San Huang Lian”on IL－6secretion in RAW264.7cells

3 討論

3.1 體內(nèi)抗炎試驗(yàn)

二甲苯常用于小鼠耳廓腫脹模型的建立。將其涂抹于小鼠耳部，導(dǎo)致耳部毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增強(qiáng)，從而引起耳部水腫，誘發(fā)小鼠耳部炎癥，是研究藥物抗炎活性的常規(guī)方法之一。根據(jù)耳廓腫脹度及耳廓腫脹率可以判斷出藥物的抗炎效果。目前采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型檢測(cè)抗炎活性的藥物以單味中藥、中藥生物活性成分及中藥復(fù)方居多，現(xiàn)已有報(bào)道的有蒲公英提取物、新中獸藥復(fù)方連藤、金銀花、銀翹藥對(duì)、腦舒膠囊、黃芩苷等［10－13］，均取得了良好的效果。在體內(nèi)抗炎試驗(yàn)中，采用二甲苯致耳廓腫脹模型來(lái)檢驗(yàn)“三黃連”的體內(nèi)抗炎作用，“三黃連”合劑高、中劑量組小鼠的耳腫脹度和耳腫脹率均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗小鼠耳廓腫脹的作用，其中，高劑量組的抗炎效果甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松的作用。

臟器指數(shù)是藥理學(xué)和病理生理學(xué)研究的重要依據(jù)。脾臟和胸腺是機(jī)體的重要免疫器官，地塞米松可使小鼠的胸腺和脾臟萎縮，顯著影響機(jī)體的免疫功能。對(duì)體內(nèi)抗炎試驗(yàn)的小鼠進(jìn)行剖檢，小鼠的臟器均未見(jiàn)異常；統(tǒng)計(jì)分析肝臟、腎臟、脾臟和胸腺等臟器指數(shù)，結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組肝臟指數(shù)高于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01），表明地塞米松對(duì)肝臟有負(fù)面影響。而脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)則分別極顯著或顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。胸腺指數(shù)方面，除了中劑量組顯著升高（P＜0.05）外，其余各處理對(duì)胸腺指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，具有極強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用，是臨床非常常見(jiàn)的藥物，但是長(zhǎng)期大劑量使用又會(huì)引起不良反應(yīng)，例如降低機(jī)體對(duì)病原體的抵抗力而誘發(fā)或加重感染、誘發(fā)皮質(zhì)功能亢進(jìn)綜合征等［14］，本試驗(yàn)中由于使用地塞米松劑量較大，甚至引起了小鼠胸腺和脾臟的萎縮。而“三黃連”合劑與地塞米松相比抗炎效果更好，不良反應(yīng)少，對(duì)小鼠的免疫功能及肝、腎的解毒功能基本無(wú)影響。

3.2 體外抗炎試驗(yàn)

采用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞作為炎癥模型來(lái)研究“三黃連”合劑的體外抗炎作用。通過(guò)MTT 實(shí)驗(yàn)確定了“三黃連”合劑的安全濃度范圍，即0.5 mg／mL～2.0mg／mL。NO 是機(jī)體重要的炎性介質(zhì)，在炎癥每個(gè)階段都會(huì)產(chǎn)生并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明［15］，NO能夠通過(guò)抑制NF－κB的激活從而發(fā)揮抗炎作用，而NO 在高濃度狀態(tài)下可激活NF－κB，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子TNF－α和IL－1β的產(chǎn)生，并且這一過(guò)程還能形成正反饋，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)愈加持久和劇烈，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的損傷，因此抑制NO 的合成能夠使炎癥癥狀得到改善。

TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－8是炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子。TNF－α主要由LPS激活的單核－巨噬細(xì)胞分泌，在機(jī)體受到有害刺激最早期分泌，可反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)烈程度。有學(xué)者認(rèn)為［16］，TNF－α是急性胰腺炎（AP）炎癥級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)，也可能是AP炎癥過(guò)程中促使IL－6釋放的重要因素。高濃度TNF－α可導(dǎo)致發(fā)熱，放大炎癥反應(yīng)，引起組織損傷甚至致死性休克。在炎癥、惡性腫瘤和創(chuàng)傷過(guò)程中TNF－α和IL－6的變化相似，都有顯著增高的趨勢(shì)，使得這三種疾病可能轉(zhuǎn)換，加重炎癥的發(fā)生［17］。IL－1β是由活化的巨噬細(xì)胞和其他多種組織細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞等產(chǎn)生的一種激素樣多肽，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中起到重要作用。它能夠促進(jìn)T 細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖分化，對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有趨化和增強(qiáng)作用，還能夠誘導(dǎo)IL－2、IL－6 和TNF等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IL－6是淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞在刺激下產(chǎn)生的一種糖蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增殖分化、刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期蛋白等方式參與炎癥反應(yīng)過(guò)程。IL－6水平過(guò)高或者持續(xù)時(shí)間過(guò)久對(duì)機(jī)體有害。研究表明IL－6能夠通過(guò)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的功能和延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞的生命周期進(jìn)而發(fā)揮炎癥促進(jìn)作用［18］。也有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)阻斷IL－6信號(hào)傳導(dǎo)可以有效治療自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病例如炎性腸疾病模型、糖尿病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，因此“Anti－IL－6／Anti－IL－6R 治療策略”成為目前治療炎性疾病的新途徑［19］。IL－8主要來(lái)源于單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中能夠趨化中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞；中性粒細(xì)胞與IL－8接觸后能夠定位游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物，達(dá)到殺菌和損傷細(xì)胞的目的。體外試驗(yàn)表明［20］，IL－8能與中性粒細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞的變形反應(yīng)、呼吸暴發(fā)反應(yīng)、釋放溶酶體、形成超氧化物，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

“三黃連”合劑主要由黃芩、連翹等組成，文獻(xiàn)表明，這兩種中藥材及其主要活性成分在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出抑制炎癥反應(yīng)的作用。黃芩苷對(duì)LPS或者IFNγ刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO 水平升高具有抑制作用，其機(jī)制是通過(guò)抑制iNOS蛋白的表達(dá)，同時(shí)黃芩 苷 對(duì) 于LPS 刺 激 引 起RAW264.7 細(xì) 胞 中 的TNF－α升高具有抑制作用，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系［21］。連翹能夠降低LPS刺激下的細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的水平包括TNF－α、IL－1β和IL－6［22］。

體外抗炎試驗(yàn)中LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO量顯著升高，而“三黃連”合劑處理后細(xì)胞生成的NO減少，表明“三黃連”合劑對(duì)炎癥反應(yīng)有抑制作用。LPS刺激RAW264.7細(xì)胞也使細(xì)胞中的促炎性細(xì)胞因子（TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－8）水平極顯著升高（P＜0.01），“三黃連”合劑處理能夠抑制這一過(guò)程，尤其是導(dǎo)致TNF－α、IL－6和IL－8水平極顯著或顯著的下降（P＜0.01或P＜0.05）；雖然“三黃連”合劑處理后IL－1β水平下降，但與LPS組相比差異不顯著（P＞0.05），這可能跟“三黃連”合劑中連翹苷含量相對(duì)較少，未達(dá)到足夠的濃度，而降低IL－1β的功能主要由連翹苷表現(xiàn)出來(lái)有關(guān)。

“三黃連”合劑（30、15、7.5mL／kg）對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹具有很好的抗炎作用，且對(duì)小鼠的臟器指數(shù)無(wú)影響?！叭S連”合劑在0.5mg／mL～2.0mg／mL濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)毒性，對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中的NO、TNF－α、IL－6和IL－8的水平升高有抑制作用。“三黃連”合劑對(duì)于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中的以上幾種炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子分泌的抑制作用可能與抑制其相應(yīng)的基因表達(dá)有關(guān)，也可能是由于作用于上述炎癥因子間的調(diào)節(jié)途徑，阻斷相關(guān)的通路，從而降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的炎性介質(zhì)和促炎性細(xì)胞因子的含量，減輕炎癥反應(yīng)?！叭S連”合劑成分復(fù)雜，抗炎機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，本研究結(jié)果為其應(yīng)用于臨床提供了參考。

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