鄭宗林，王廣軍，鄭曙明

（1.西南大學水產(chǎn)動物繁育和健康養(yǎng)殖研究中心，重慶榮昌402460；2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東廣州510380）

作為目前國際上公認的性能優(yōu)越、效果良好、幾 乎無殘留的殺菌劑，二氧化氯（ClO2）已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為了第4 代安全高效的消毒劑［1］。1983 年，美國的環(huán)保部門，食品藥品管理部門（FDA）以及農(nóng)林牧漁管理部門等先后批準二氧化氯可作為消毒劑在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領域使用［2］。目前，在國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，二氧化氯作為治療和預防疾病的消毒劑，因其對魚、蝦蟹、貝類等具有療效好，毒性低，刺激性小，以及對水產(chǎn)動物致病菌以及芽胞等具有較強的殺滅能力等優(yōu)點，已得到廣泛應用［3］。相關報道主要集中于水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物疾病防治方面的探討，如對鰱魚、黃顙魚魚種、長薄鰍幼魚、羅非魚、黃鱔等的毒性試驗，及對鮭科魚類受精卵的影響等［2－5］。此外，還有對觀賞魚類，如錦鯉、血鸚鵡、孔雀魚和月光魚等報道［6－7］。然而，有關二氧化氯對草魚疾病防治方面的研究鮮見深入報道［8］。有鑒于此，本文主要研究了二氧化氯在草魚精養(yǎng)池中按不同劑量、不同方式施用后，探討其對池塘中異養(yǎng)菌群的種類和數(shù)量變化情況方面的影響，以期為二氧化氯在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的大規(guī)模推廣和應用提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚及藥品 試驗用草魚購自重慶市長壽區(qū)龍容宸水產(chǎn)養(yǎng)殖場，平均體重為（150.0g±2.6g），共計4 000尾。試驗藥品二氧化氯購買自山東兆冠藥業(yè)有限公司，呈粉末狀，穩(wěn)定性二氧化氯含量維持在8%左右。

1.1.2 試驗用飼料儀器 試驗所用的飼料購自重慶市永川通威生產(chǎn)的全價沉性顆粒飼料，粗蛋白（CP）含量為28%。通用型采水器購自青島聚創(chuàng)環(huán)保設備有限公司，底泥采集器為北京冠測精電儀器設備有限公司產(chǎn)品，VITEK－Ⅱ型全自動微生物分析系統(tǒng)購自上海楓岳商貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 選擇規(guī)格一致的草魚共4 000尾，分別放入面積為1 000 m2的4口養(yǎng)殖池中，每口池塘放養(yǎng)1 000尾。水深維持在1.4m 左右，分別記為1＃，2＃，3＃和4＃。在1＃池塘中中采用潑灑的方式添加3 750g／hm2的二氧化氯，在2＃中采用掛帶的方式添加3 750g／hm2的二氧化氯，在3＃中采用潑灑的方式添加7 500g／hm2的二氧化氯，在4＃中采用掛帶的方式添加7 500g／hm2的二氧化氯。其中，潑灑為全池帶水潑灑，掛袋為在食臺和池塘四角使用紗布包裹懸掛水中30cm 水下，每10d施用1次；試驗開始第1天，第10天和第20天共計施用3次。

1.2.2 試驗周期及管理 試驗從2014年6月22日開始，至2014年7月25日結束。試驗開始前，先將草魚暫養(yǎng)于池中3d后開展正式試驗。試驗持續(xù)時間共計30d。在試驗期間每天早（8：00）、中（13：00）、晚（18：00）各投喂1次，每次的飼料投喂量占草魚體重的4%～6%。

此外，在試驗初（6月25日）、試驗中（7月5日）和試驗結束（7月25日）時，分別記錄4個試驗組的水質情況。直接測量每個魚塘中的溫度、溶氧。對帶回實驗室的水樣，采用納氏試劑比色法（GB 7479）測定水體中的氨氮情況。用碘量法（GB 7489）測定水中溶解氧的含量。采用N－（1－萘基）－乙二胺比色法（GB 13580.7）測定水體中的亞硝酸鹽含量。采用酚二磺酸光度法（GB 7480）測定水體中硝酸鹽氮的含量。水體中磷酸鹽含量的測定使用離子色譜法（HJ669－2013）。

1.2.3 試驗樣品的采集和處理 水樣采集的具體方法為：用通用型采水器在1＃、2＃、3＃和4＃池塘的3處不同位置分別采集表層水樣，迅速放入已經(jīng)滅菌的容量瓶中，蓋好后帶回實驗室進行水樣處理。用吸管從容量瓶中吸取1mL的水樣，再加入9 mL的滅菌雙蒸水進行稀釋。再分別從4個試驗組稀釋后的水樣中，吸取0.1mL，放置于培養(yǎng)基中進行涂布。其中，選擇細菌數(shù)合適的稀釋度平板，對水體中細菌數(shù)量進行觀察和統(tǒng)計。

底泥采集的詳細步驟：用底泥采集器在1＃、2＃、3＃和4＃池塘的3處不同位置分別采集底泥，迅速放入已滅菌的培養(yǎng)器皿中，并蓋好帶回實驗室進行處理。用已消毒的刀片刮取約厚度為3cm 左右的底泥樣，分別放入4個不同的研缽中磨碎。用天平量取1g左右的底泥樣品，再加入9mL的滅菌雙蒸水進行稀釋。后續(xù)試驗方案同水樣處理方法。

1.2.4 試驗用培養(yǎng)基的制備 本試驗所采用培養(yǎng)基的詳細配方為：硫酸鎂0.05g，牛肉膏2.50g，氯化鈉5.00g，磷酸氫二鉀0.20g，葡萄糖1.00g，蛋白胨5.00g，酵母膏2.50g，瓊脂粉15.00g。加水調(diào)至1 000mL，調(diào)pH 為7.2～7.4，在120℃高溫滅菌30min即成。

1.2.5 細菌菌落的鑒定和計數(shù)

1.2.5.1 細菌菌落種類的鑒定 參照書籍《一般細菌常用鑒定方法》、《伯杰氏鑒定細菌學手冊》制定需氧菌鑒定程序，按照鑒定程序進行鑒定；采用法國梅里埃公司VITEK－Ⅱ型全自動微生物分析系統(tǒng)和VITEK－ANA 厭氧菌鑒定板鑒定厭氧菌。

1.2.5.2 細菌菌落計數(shù) 細菌菌落的計數(shù)主要采用平板計數(shù)法。所用平板在27℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。接著，對單克隆總數(shù)在30個～300個的平板進行有效計數(shù)，并以計數(shù)平板上的單克隆總數(shù)作為0.1mL稀釋樣品中的總活菌數(shù)。

1.2.5.3 細菌菌落多樣性指數(shù)的計算 主要采用香農(nóng)－威納指數(shù)（Shannon－wiener index）用于細菌菌落多樣性分析。以此來計算水體中細菌多樣性指數(shù)，具體公式如下：

H＝－∑PilnPi

其中，Pi為第i屬細菌的種數(shù)與分離到的細菌總種數(shù)的比值，即Pi＝ni／N；ni為第i 屬細菌的種數(shù)；N 為分離到的細菌總數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0for windows進行One－way ANOVA 分析和LSD 比較。結果以平均數(shù)±標準差（ˉx±SD）表示。

2 結果

2.1 池塘水質理化因子和底泥總有機碳含量的測定

主要測定了水體中的溫度、溶解氧（DO）、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和磷酸鹽含量，詳細結果見表1。由于二氧化氯施用方式不同，1＃～4＃中，溫度、溶解氧（DO）、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和磷酸鹽含量有顯著的差異，各自呈現(xiàn)不同的變化趨勢。其中，3＃（二氧化氯的含量為7 500g／hm2，采用潑灑方式）的水體溶氧顯著高于其余各組。氨氮、硝態(tài)氮、亞硝氮和磷酸鹽指標均是3＃最低，但氨氮、硝態(tài)氮、磷酸鹽指標中3＃與1＃和4＃相比均沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2 草魚精養(yǎng)池水體和底泥中總活菌數(shù)與氣單胞菌的變化情況

2.2.1 草魚精養(yǎng)池水體中總活菌數(shù)與氣單胞菌的變化情況 草魚精養(yǎng)池水體中細菌菌落總數(shù)的變化情況見圖1，由圖1可知，在整個試驗周期過程中，由于二氧化氯濃度的不同以及不同潑灑方式的差異，池塘中水體菌落總數(shù)也存在較大差異。其中，2＃的活菌總數(shù)在3次試驗中均最高，但1＃、3＃和4＃中異養(yǎng)菌數(shù)量差異不明顯。水體中氣單胞菌的數(shù)量變動趨勢與總活菌數(shù)相似，呈現(xiàn)2＃中氣單胞菌數(shù)量最多。1＃、3＃和4＃中氣單胞菌數(shù)量低于2＃，但彼此間差異不顯著。

表1 試驗塘水質理化因子及底泥總有機碳的含量Table 1 The physical and chemical factors of water and total organic carbon of sediment in test pond

圖1 二氧化氯對池塘水體活菌總數(shù)的影響Fig.1 Effects of chlorine dioxide on the total number of viable bacteria in the pond water

2.2.2 草魚精養(yǎng)池底泥中總活菌數(shù)和氣單胞菌屬數(shù)量的變動 池塘底泥中總活菌數(shù)量的變動和氣單胞菌屬數(shù)量的變動分別見圖3和圖4。由圖3和圖4可知，底泥中總活菌數(shù)和氣單胞菌的數(shù)量變動趨勢和池塘中水體中總活菌數(shù)和氣單胞菌的數(shù)量變化趨勢類似。均表現(xiàn)為2＃中氣單胞菌數(shù)量最多。而1＃、3＃和4＃中氣單包菌數(shù)量低于2＃，但彼此之間的差異仍不顯著。

圖2 二氧化氯對池塘水體氣單胞菌菌數(shù)的影響Fig.2 Effects of chlorine dioxide on Aeromonas number in the pond water

2.3 草魚精養(yǎng)池水體和底泥中異養(yǎng)菌的組成情況

草魚精養(yǎng)池水體和底泥中異養(yǎng)菌細菌不同種類的組成情況見表3。由表3可知，在草魚精養(yǎng)池水體中的主要異養(yǎng)菌主要有：氣單胞菌屬、黃單胞菌屬、黃桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬和變形菌屬等。其中，假單胞菌、氣單胞菌和腸桿菌是主要的優(yōu)勢菌種，而黃單胞菌屬、黃桿菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬等種類則出現(xiàn)較少。

在草魚精養(yǎng)池底泥中的主要異養(yǎng)菌主要有：假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、變形桿菌屬、色桿菌屬、黃桿菌屬和腸桿菌屬組成，其中芽胞桿菌和腸桿菌為池塘底泥中的優(yōu)勢異養(yǎng)菌。

圖3 二氧化氯對池塘底泥中總活菌菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of chlorine dioxide on the total number of viable bacteria in the pond sediment

圖4 二氧化氯對池塘底泥中氣單胞菌菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of chlorine dioxide on Aeromonas number in the pond sediment

表2 池塘中分離出細菌的種類和數(shù)量Table 2 Type and quantity of bacteria isolated from pond

2.4 草魚精養(yǎng)塘中二氧化氯的不同使用方案對池塘水體和底泥中異養(yǎng)菌數(shù)量組成的影響

在草魚精養(yǎng)池中添加不同劑量的二氧化氯后，水體中主要的菌群分別為氣單胞菌、假單胞菌、腸桿菌和其他類型菌群。由圖5可知在可辨別的細菌種類中，水體中氣單胞菌的數(shù)量最多，其次為假單胞菌，腸桿菌的數(shù)量相對最少。其中，氣單胞菌的比例維持在31%～38%之間，在2＃中氣單氣單胞菌的數(shù)量最高，在4＃中最低。假單胞菌在1＃～4＃中，含量均維持在20%左右，且各試驗組見的差異不顯著。腸桿菌的變化范圍位于8%～17%之間。其中，在試驗2＃中的含量最低，為8%左右，而在3＃中達到17%左右。

在草魚精養(yǎng)池中添加二氧化氯后，底泥中主要的菌群為：芽胞桿菌和腸桿菌。具體變化趨勢如圖6所示。芽胞桿菌的含量位于35%～50%之間，其中，在2＃中，芽胞桿菌含量達最低值，為35%左右，而在1＃和3＃中的含量相對較高，分別為49%和50%。腸桿菌的數(shù)量相對較低，位于10%～20%之間，在2＃中腸桿菌含量最低，為10%左右，而在3＃中含量最高，達20%。

圖5 二氧化氯對池塘水體菌株數(shù)量的影響Fig.5 Effects of chlorine dioxide on the number of strains in pond water

圖6 二氧化氯對池塘底泥菌株數(shù)量的影響Fig.6 Effects of chlorine dioxide on the number of strains in sediment of pond

2.5 池塘水體和底泥中細菌群落多樣性的分析

在草魚精養(yǎng)池中添加不同劑量的二氧化氯后，池塘水體和底泥中細菌群落的多樣性情況如圖7所示。由圖7可知，在4個二氧化氯的處理組中，試驗2＃無論是在水體中，還是底泥中的細菌群落多樣性均最高，且底泥中細菌群落多樣性顯著高于水體（P＜0.05）。而在其他試驗組（1＃、3＃和4＃）中，底泥中的群落多樣性高于水體，但二者之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 二氧化氯對草魚養(yǎng)殖水體中水質的影響

二氧化氯作為治療和預防疾病的消毒劑，因其對魚、蝦蟹、貝類、蛙類等具有療效好，毒性低，刺激性小，還可以改善水質狀況，不傷害水體中浮游生物的豐度等特性，已在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中得到了廣泛的應用［6－9］。在本試驗中，3＃（潑灑式添加，用量7 500 g／hm2）的水體溶氧顯著高于其余各組，氨氮、硝態(tài)氮、亞硝氮和磷酸鹽指標均是3＃最低，表明在草魚養(yǎng)殖水體中添加一定劑量的二氧化氯可增加水體中溶氧，降低水體中氨氮濃度，促進草魚生長，究其原因在于二氧化氯是一種不穩(wěn)定的化合物，在水中可分解成HClO2、Cl2和O2，增加養(yǎng)殖水體中氧氣的濃度，澄清水體，沉淀懸浮物［10］。此外，還可對其中的藻類異養(yǎng)菌、鐵細菌、硫酸鹽還原菌等都有比較好的殺滅效果［11］。

圖7 二氧化氯對池塘水體和底泥細菌多樣性的影響Fig.7 Effects of chlorine dioxide on the pond water and sediment bacterial diversity

3.2 二氧化氯對草魚養(yǎng)殖水體和底泥中異養(yǎng)菌數(shù)量變動的影響

二氧化氯作為第四代消毒殺菌劑相對于漂白粉、生石灰、高錳酸鉀等傳統(tǒng)消毒劑來說具有殺滅性強，使用劑量小，毒性消失快等優(yōu)點［12］。在本試驗中，無論是在養(yǎng)殖水體中，還是底泥中，1＃（潑灑式添加，用量3 750g／hm2）和2＃（掛袋式添加，用量3 750g／hm2）中異養(yǎng)菌的數(shù)量要高于3＃（潑灑式添加，用量7 500g／hm2）和4＃（掛袋式添加，用量7 500g／hm2），該結果表明，在草魚養(yǎng)殖水體中，二氧化氯濃度的高低決定了水體中異養(yǎng)菌數(shù)量的多少。此外，掛袋式添加二氧化氯對養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)菌數(shù)量的影響要小于潑灑式。這一結果與王丹生和朱慶紅等的研究結果類似［13］。

3.3 二氧化氯對草魚養(yǎng)殖水體和底泥中異養(yǎng)菌區(qū)系組成的影響

在本試驗結果中，草魚池塘水體中假單胞菌、氣單胞菌和腸桿菌是主要優(yōu)勢菌，而其他的種類出現(xiàn)較少［14］。底泥異養(yǎng)菌中，芽胞桿菌和腸桿菌屬優(yōu)勢菌。該結論與張峰峰等的研究結果類似［10］。此外，本研究中池塘水體和底泥中細菌群落多樣性的分析結果顯示，除4＃外，水體中細菌群落的多樣性指數(shù)顯著低于底泥。而水體和底泥中細菌多樣性指數(shù)在2＃較高，原因在于二氧化氯分子外層具有一對未成對的活潑的自由電子，具有很強的氧化能力，能使微生物蛋白質中的氨基酸氧化分解，導致氨基酸鏈斷鏈，蛋白質失去功能，從而使微生物死亡［2，13］；抑制微生物蛋白質的合成，破壞微生物，達到迅速滅菌消毒作用［15］。而二氧化氯的在草魚養(yǎng)殖水體中的最適添加量尚待深入探討。

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