冶貴生，馬玉花，張 爽，張曉芬，韓志輝，鄒 勇，賈躍寧

（1.青海大學農牧學院，青海西寧810016；2.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100）

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是一種革蘭陽性芽胞桿菌，在污水、食物等中均有分布，是一種重要的人畜共患傳染病的病原［1］，也是一種引起食物中毒的重要病原菌［2］。隨著四環(huán)素類抗生素的廣泛使用，四環(huán)素耐藥性細菌也日漸增多，大腸埃希菌［3］、沙門菌［4］、鏈球菌［5］等多種細菌均表現(xiàn)出對四環(huán)素類藥物的耐藥性。四環(huán)素類藥物可與細菌核糖體30S亞基結合從而中斷細菌蛋白質的生物合成，而細菌對四環(huán)素產生耐藥性可通過表達核糖體保護蛋白、外排泵等方式進行［6］。

近年來產氣莢膜梭菌的耐藥性日趨嚴重，國外學者已經開展了產氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥性以及四環(huán)素耐藥基因檢測等方面的研究［7－10］。產氣莢膜梭菌對四環(huán)素耐藥相關的基因有tetA（P）、tetB（P）和tetM等［11］，其中tetA（P）基因編碼產氣莢膜梭菌外排泵蛋白，其在產氣莢膜梭菌主動外排抗藥性過程中起著重要作用，而目前國內關于產氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥基因的研究開展的相對較少。因此，本實驗通過PCR技術擴增A 型產氣莢膜梭菌青海分離株tetA（P）基因，軟件分析tetA（P）基因序列，預測TetA（P）蛋白親水性、二級結構、三級結構、功能位點及跨膜區(qū)，以期為進一步研究A 型產氣莢膜梭菌TetA（P）蛋白主動外排抗藥功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 A 型產氣莢膜梭菌青海分離株由青藏高原動物疾病研究室保存。

1.2.1 主要試劑 FT 培養(yǎng)基為北京陸橋技術有限責任公司產品；Ex Taq DNA聚合酶為寶生物工程（大連）有限公司產品；DNA Marker、細菌質粒提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank中登錄的產氣莢膜梭菌tetA（P）基因序列（登錄號：AB054980.1），設計tetA（P）基因寡核苷酸引物，預期長度為1 263bp。引物 序 列 為：tetA （P）－F：5′－ATGGTTAATAAACTTTCAG－3′、tetA （P）－R：5′－TTAATTATTTTCTTCATAATC －3′。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 取超低溫保存的A 型產氣莢膜梭菌分離株菌液，室溫解凍，無菌操作吸取5μL 接種于FT 培養(yǎng)基中，酒精燈融化石蠟無菌封口，37℃厭氧培養(yǎng)16h～17h。

1.2.3 質粒DNA 的提取 收集3mL 37℃厭氧培養(yǎng)的A 型產氣莢膜梭菌于1.5 mL 離心管中，12 000r／min室溫離心3 min，棄上清，后續(xù)操作步驟按試劑盒說明書依次進行。

1.2.4 tetA（P）基因的PCR 擴增 PCR 反應體系：PCR 緩沖液5μL，dNTPs 4μL，tetA（P）－F 1 μL，tetA（P）－R 1μL，質粒DNA 1μL，DNA 聚合酶0.5μL，滅菌超純水37.5μL。PCR 擴增條件：95℃4min；95℃1min，46℃50s，72℃1min 30s，30個循環(huán)；72℃10min，4℃保存。

1.2.5 tetA（P）基因分析、蛋白結構預測 將PCR擴增產物送公司測序，利用生物軟件對tetA（P）基因 進 行 基 因 分 析，根 據(jù)Garnier－Robson［12］、Chou－Fasman［13］方法分析tetA（P）蛋白的二級結構，根據(jù)Kyte－Doolittle［14］方法分析蛋白的親水性，通過Predictprotein、TMHMM 和I－Tasser服務器預測tetA（P）蛋白的修飾位點、跨膜區(qū)和三級結構。

2 結果

2.1 質粒DNA 提取

提取的產氣莢膜梭菌分離株質粒DNA 經電泳檢測，結果表明，質粒DNA 條帶雖然亮度較淡，但基本能夠滿足作為PCR 擴增的模板（圖1）。

2.2 tetA（P）因擴增結果

分離株tetA（P）基因PCR 擴增產物經10g／L瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，tetA（P）基因擴增良好，大小與預期片段大小長度相符，陰性對照所在泳道無條帶（圖2）。

圖1 質粒DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA

2.3 tetA（P）基因序列分析

2.3.1 核苷酸序列分析 采用DNAStar軟件分析tetA（P）基因核苷酸序列，結果表明（表1）tetA（P）基因核苷酸序列長度為1 263nt，A、T 和A＋T 含量較高。

2.3.2 氨基酸序列分析 采用DNASTAR 軟件推導TetA（P）蛋白氨基酸序列并分析，結果表明，TetA（P）蛋白氨基酸序列長度為420aa，分子質量為45 967.68u，堿性氨基酸和酸性氨基酸的含量較少（表2）。

2.3.3 分離株與參考菌株tetA（P）基因核苷酸序列和氨基酸序列比較結果 將A 型產氣莢膜梭菌青海分離株tetA（P）基因與參考產氣莢膜梭菌EHE－NE18菌株tetA（P）基因（登錄號：JN689220.1）、產氣莢膜梭菌Wakayama菌株tetA（P）基因（登錄號：AB054980.1）和產氣莢膜梭菌CW92菌株tetA（P）基因（登錄號：L20800.1）的核苷酸序列與氨基酸序列進行比較，結果表明（圖3～圖5）分離株tetA（P）基因與EHE－NE18、Wakayama、CW92 參考菌株tetA（P）基因的核苷酸序列同源性依次為100%、99.8%和98.7%，氨基酸序列同源性依次為100%、100%和98.3%。

圖2 tetA（P）基因PCR 擴增Fig.2 PCR identification of tetA（P）gene

表1 tetA（P）基因核苷酸序列分析結果Table 1 Analysis of nucleotide sequence of tetA（P）gene

表2 TetA（P）蛋白氨基酸序列分析結果Table 2 Analysis of amino acid sequence of TetA（P）

圖3 tetA（P）基因核苷酸序列同源百分比Fig.3 Homology percentage of tetA（P）nucleotide sequence

圖4 TetA（P）蛋白氨基酸序列同源性百分比Fig.4 Homology percentage of tetA（P）amino acid sequence

圖5 tetA（P）基因核苷酸序列同源性比較Fig.5 Homology comparison of tetA（P）nucleotide sequence

2.4 TetA（P）蛋白二級結構預測

Garnier－Robson方法分析結果表明（圖6），TetA（P）蛋白二級結構中α螺旋分布較均勻，β折疊分布較多且均勻，β轉角和無規(guī)則卷曲分布較少，其中無規(guī)則卷曲在肽段N－端和中部分布相對較多。Chou－Fasman方法預測結果顯示（圖6），TetA（P）蛋白二級結構中α螺旋分布少，只有4處且連續(xù)氨基酸較短，β折疊分布較多且均勻，β轉角分布區(qū)段較Garnier－Robson法多。

2.5 TetA（P）蛋白親水性預測

Kyte－Doolittle方法分析結果顯示，TetA（P）蛋白的疏水性氨基酸分布區(qū)域較多，且存在7處較大的連續(xù)分布區(qū)，說明該蛋白的疏水性較高，可能是一種跨膜蛋白（圖7）。

2.6 TetA（P）蛋白跨膜區(qū)分析

TMHMM 預測結果顯示，TetA（P）蛋白具有10個跨膜螺旋的結構，且N－端和C－段均在膜內（圖8）。

2.7 TetA（P）蛋白功能位點分析

Predictprotein預測結果顯示，TetA（P）蛋白含有4 個N－糖基化位點，分別為156－159位NFSV、253－256 位NLSS、313－316 位NFSL、376－379 位NISV；1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，為71－74位RKLS；5個蛋白激酶C 磷酸化位點，分別為70－72位SRK、158－160位SVR、196－198位TFK、203－205位TFK、326－328位TFR；1 個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，為49－52位TTLE；1個酪氨酸激酶磷酸化位點，為127－133位KDLDEIY；12個N－豆寇?；稽c，分別為78－83位GGVLTG、90－95 位GSISSF、106－111 位GLGSTF、114－119 位GSLEAW、136－141 位GAQAGQ、143－148 位GAFIGI、252－257 位GNLSSV、267－272 位GMILSF、356－361 位GQMNSL、362－367 位GQILGG、371－376位GIIATN、382－387位GIACTS。

2.8 TetA（P）蛋白三級結構預測

I－Tasser服務器對TetA（P）蛋白三級結構進行預測后，結果表明，tetA（P）蛋白存在4種結構模型，這4種模型的C－score值均在［－5，2］的置信區(qū)間，空間結構主要是由α－螺旋和無規(guī)則卷曲形成，模型1相對于其他3 個模型而言，C－score值最大，可信度較高，說明所肽鏈可能進行了正確的折疊（圖9）。

圖6 TetA（P）蛋白二級結構Fig.6 Second structure of TetA（P）protein

圖7 TetA（P）蛋白親水性Fig.7 Hydrophilicity plot of TetA（P）protein

圖8 TetA（P）蛋白跨膜區(qū)Fig.8 Transmembrane domain of TetA（P）protein

圖9 TetA（P）蛋白三級結構Fig.9 Tertiary structure of TetA（P）protein

3 討論

主動外排功能是細菌在進化過程中形成的一種防御機制，是細菌產生耐藥性的重要途徑。當細菌面臨抗生素壓力時會啟動與藥物外排相關的基因從而將藥物排出菌體細胞，這也是大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等對四環(huán)素、β－內酰胺類等抗生素產生多重耐藥的重要原因［15］。將產氣莢膜梭菌可能編碼ABC轉運蛋白的基因克隆到野生型菌株中，可降低諾氟沙星和環(huán)丙沙星在菌體內的積累。

TetA（P）蛋白作為產氣莢膜梭菌與四環(huán)素耐藥相關的外排泵蛋白，其編碼基因一般定位于菌體質粒上［16］，TetA（P）蛋 白 可 調 節(jié) 四 環(huán) 素 的 主 動 外排［17］。A 型產氣莢膜梭菌青海分離株tetA（P）基因長度為1263個核苷酸（含起始密碼子和終止密碼子），編碼420個氨基酸。核苷酸序列同源性比對結果說明分離株與EHE－NE18參考菌株無突變位點，與Wakayama參考菌株有2處突變位點，與CW92參考菌株有16處突變位點。氨基酸序列同源性分析顯示分離株與EHE－NE18、Wakayama參考菌株均無氨基酸突變，其中與Wakayama參考菌株雖有核苷酸序列的突變，但由于密碼子具有簡并性的特點，致使分離株與Wakayama參考菌株TetA（P）蛋白的氨基酸序列未見差異。另外，A 型產氣莢膜梭菌青海分離株TetA（P）蛋白疏水性氨基酸數(shù)量較多，蛋白的疏水性較高，該蛋白具有跨膜蛋白的特征，且分離株TetA（P）蛋白具有10 個跨膜螺旋結構，但這與Bannam TL 等［18］報道的產氣莢膜梭菌TetA（P）蛋白含有12個跨膜區(qū)有所不同。

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