孟慧芝，孫 濤，岳志芹，王文斌

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島266000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷030801）

豬流感（Swine influenza，SI）是由A 型流感病毒引起的一種急性、高度接觸性的呼吸道傳染病。根據(jù)表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，A 型流感分為18個(gè)H 亞型和11個(gè)N亞型［1－2］。目前，在豬體內(nèi)分離到的流感亞型眾多，廣泛流行于我國(guó)豬群中的有H1N1、H3N2［3］等不同血清亞型。劉麗萍等［4］曾在2012年－2013年以類禽型H1N1（EAH1N1）和2009甲型H1N1（pdm／09 H1N1）抗原對(duì)我國(guó)大多數(shù)省份豬群抗體做了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)豬流感 H1N1 抗體陽(yáng)性率為55.52%和13.92%。雖然豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）在豬與豬的傳播中有限，但均能引起豬的較高發(fā)病率，而且已經(jīng)證實(shí)1918年古典SIV 和2009年新型SIV 都能感染并致人死亡，甚至在人與人之間傳播［5－6］，但在人類之間傳播的分子機(jī)制目前未知，因此對(duì)豬流感的持續(xù)監(jiān)測(cè)，不僅對(duì)畜牧業(yè)有重大的經(jīng)濟(jì)意義，其公共衛(wèi)生意義更不容忽視。

本文擬利用自行設(shè)計(jì)的條形碼引物，對(duì)2009年自山東豬場(chǎng)分離到的一株H1N1流感病毒進(jìn)行全基因組快速擴(kuò)增和測(cè)序，并與古典豬流感、禽源豬流感、人源豬流感比對(duì)，并對(duì)其遺傳演化關(guān)系進(jìn)行分析，從分子水平上探究該病毒來(lái)源，為進(jìn)一步研究SIV 抗原變異和遺傳演化關(guān)系積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及載體 豬源分離株：A／swine／Shandong／01／2009（H1N1）由山東出入境檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室保存；9日齡～11日齡SPF 雞胚由山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及pMD－18T 克隆載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 Rneasy Mini Kit是QIAGen公司產(chǎn)品；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EX－Taq聚合酶、SolutionⅠ連接酶、Agarose Gel DNA Extration Kit試劑盒、Plasmid Purification Kit試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；血凝抑制抗體，豬流感H1／H3亞型陽(yáng)性血清，血凝抑制抗原，96 孔血凝板為哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離及血凝抑制試驗(yàn)

1.2.1.1 病毒分離 將該株病毒采用常規(guī)雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)，無(wú)菌傳代3次，經(jīng)培養(yǎng)收獲的病毒用雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝效價(jià)測(cè)定。

1.2.1.2 血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）血凝試驗(yàn)采用常規(guī)微量法進(jìn)行，取收獲的培養(yǎng)物尿囊液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)1 mL／L 公雞紅細(xì)胞的凝集活性；將有血凝活性的培養(yǎng)物，使用NDV 標(biāo)準(zhǔn)血清、H1N1 標(biāo)準(zhǔn)血清、H3N2 標(biāo)準(zhǔn)血清等進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。

1.2.2 病毒全基因的RT－PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Hsu M T 等［8］發(fā)現(xiàn)的流感病毒每個(gè)基因兩端均有的共同分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)參考Hoffman E 等［9－10］所 設(shè) 計(jì) 條 碼 引 物 序 列，利 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成11對(duì)引物，送Invitrogen公司合成（表1）。

表1 設(shè)計(jì)的引物和預(yù)期目的片段大小Table 1 Primers used and size of expected products

1.2.2.2 病毒RNA 提取 與cDNA 的合成 取500μL的雞胚尿囊液，按QIAGen RNA 提取試劑盒操作步驟提取RNA，每份病毒RNA 樣品溶解于50μL的RNase free水，12 000r／min離心2min，立即開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄，以U12 5′－AGCAAAAGCAGG－3′為引物，參照寶生物工程（大連）有限公司1st strand cDNA Synthesis Kit cDNA 試劑盒使用說(shuō)明加入試劑，RT 反應(yīng)條件為：30℃10 min，42℃40 min，70℃15min，冰上冷卻。

1.2.2.3 毒株各個(gè)基因擴(kuò)增條件 PCR 擴(kuò)增程序：94℃4 min；94℃30s，聚合酶PB2－1、PB2－2、PB1－1、PB1－2、PA－1、PA－2 分 段 引 物 退 火 溫 度 為50.5℃，72℃延伸1.5 min；其他引物57℃退火，72℃延伸7min，30個(gè)循環(huán)［9］；72℃終延伸10min。取7μL PCR 產(chǎn)物在10g／L 瓊脂糖凝膠上電泳檢查結(jié)果。

1.2.3 連接與轉(zhuǎn)化 PCR 產(chǎn)物的回收按Agarose Gel DNA Purification Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將各自膠回收的PCR 產(chǎn)物與pMD－18T 載體1∶3比例16℃過(guò)夜連接后，取10μL加入200μL的感受態(tài)細(xì)胞懸液，42℃熱激1.5min，冰上迅速冷卻，加入1mL不含Amp LB液體培養(yǎng)基混勻，37℃振蕩培養(yǎng)1h，取50μL菌液涂布于含氨芐的LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)狀況良好的單個(gè)菌落，再接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.4 測(cè)序及比對(duì) 經(jīng)鑒定為陽(yáng)性菌落挑克隆培養(yǎng)菌液送寶生物測(cè)序，拼接序列。利用 MEGA 5.05軟件 將本株的8段基因與不同年份的豬流感、禽流感、人流感的代表株進(jìn)行比對(duì)后，繪制基因進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血凝抑制試驗(yàn)

接種11日齡雞胚，盲傳至第3 代，48h 后收集尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，血凝效價(jià)為26～29，選擇血凝效價(jià)為29的尿囊液稀釋16倍進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示，NDV、H3為陰性，H1為陽(yáng)性，血凝抑制效價(jià)為25。血凝抑制試驗(yàn)與核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果一致，確認(rèn)為是H1亞型。

2.2 RT－PCR 結(jié)果

RT－PCR 擴(kuò)增出的11個(gè)目的片段與預(yù)期大小相符。測(cè)序后，利用MEGA5.05軟件拼接，獲得除3′和5′最末端引物設(shè)計(jì)區(qū)域以外的整個(gè)基因組的核苷酸序列。1 0g／L的凝膠電泳條帶見(jiàn)圖1。

圖1 8個(gè)基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT－PCR results of 8genes

2.3 測(cè)序結(jié)果與同源性比較

參考A 型流感病毒H1N1 亞型的8 個(gè)基因節(jié)段兩端共有的分子結(jié)構(gòu)序列，設(shè)計(jì)通用條碼引物，擴(kuò)增得到了包含8個(gè)節(jié)段的A 型流感病毒的全長(zhǎng)cDNA。測(cè)序結(jié)果表明其全基因大小為13 136bp（GenBank 登錄號(hào)為KM368310－KM368317）?？v觀整個(gè)進(jìn)化樹(shù)，H1N1豬流感病毒年份不一，地區(qū)不同，或同一年份不同地區(qū)，隔一段時(shí)間就會(huì)監(jiān)測(cè)到基因重組。祁賢等［11］研究發(fā)現(xiàn)，A／California／07／2009的PB2和PA 基因由禽傳到豬群后已經(jīng)進(jìn)化了10年左右；而PB1在人群中進(jìn)化了30年后，又在豬群中進(jìn)化了約10年。而2009年新型豬流感獨(dú)立的形成一個(gè)小分支，由系統(tǒng)進(jìn)化圖可知本株的8段基因與近5年在人和豬中流行的11株A 型流感相近，HA 的同源性為98.1%～99.7%，NA 基因的同源率達(dá)98.6%～99.8%，與美國(guó)疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的8 個(gè)片段同源性結(jié)果比較：核苷酸同源性高達(dá)99.1%～99.6%，氨基酸同源性達(dá)97.6%～99.5%。Blast分析發(fā)現(xiàn)此毒株與2009年－2010 年 的200 條H1N1 毒 株 同 源 性 達(dá)99%以上，表明2009A（H1N1）流感毒株多，遺傳變異低，范圍廣。近3年來(lái)，2009新型流感H1N1 偶爾發(fā)生漂移。

圖2 SIV8個(gè)基因（PB2、PB1、PA、HA、Np、NA、M、NS）的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of SIV 8genes（PB2，PB1，PA，HA，Np，NA，M，NS）

序列分析進(jìn)化樹(shù)表明：本株的HA、NP、NS 3個(gè)基因與4株豬流感聚在一起，其中包括古典豬流感代表株A／swine／Wisconsin／1／1957（H1N1），說(shuō)明這3個(gè)基因來(lái)自古典豬流感，PB2、M、PA 和NA與多株禽流感毒株形成一個(gè)大的分支，PB1與人流感A／Auckland／588／2000（H3N2）聚到一起，這與Gavin［12］等推測(cè)2009年新型豬流感的基因來(lái)源一致。此外，在聚合酶基因進(jìn)化樹(shù)分析上，本株與新近流行的A／swine／Illinois／A01158996／2013相近，但M、NS基因與之有一定遺傳距離。說(shuō)明2009年以后并非新型豬流感完全取代了近代流行的豬流感，A／swine／Jiangsu／s16／2011即是一個(gè)很好的實(shí)例。

3 討論

目前，很多學(xué)者［13－14］通常擴(kuò)增部分序列，研究流感病毒的分型及流行病學(xué)特征。但全基因擴(kuò)增測(cè)序?qū)α鞲胁《痉肿舆M(jìn)化研究以及準(zhǔn)確追蹤病毒起源仍具有重要意義。Hsu M T 等［8］發(fā)現(xiàn)，流感病毒每個(gè)基因片段的5′端前13個(gè)核苷酸，3′端前12個(gè)核苷酸均高度保守，且RNA 分子環(huán)化形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)。本研究即依據(jù)流感病毒各基因共有的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增條碼引物，獲得了13 136bp的全基因組序列。但聚合酶基因擴(kuò)增時(shí)，PB2、PB1和PA 3種聚合酶基因因其長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可能擁有較為復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在57℃退火時(shí)很難完全變性，擴(kuò)增成功率僅為40%～50%［15］，因此本研究中對(duì)聚合酶基因采用分段擴(kuò)增方式，拼接得到了3個(gè)聚合酶基因的全序列。

蛋白序列分析可見(jiàn)：本株A／swine／Shandong／01／2009（H1N1）的PB1－F2蛋白，12位都有一個(gè)終止密碼子的存在，阻斷氨基酸的翻譯，NS1 蛋白由于660位的核苷酸G－A 出現(xiàn)終止密碼子TGA 也被截?cái)?，這與Garten R J等［6，11］分析的毒株情況一致。但具體原因有待進(jìn)一步的探索。金剛烷胺類藥物對(duì)A 型流感病毒的M2蛋白具有阻礙功能作用，抑制病毒增殖［6］，此流感病毒（M2）帶有S31N 遺傳標(biāo)記，具有抗金剛烷胺的抗病毒藥物的作用，對(duì)奧塞米韋和扎那米韋敏感。HA 切割位點(diǎn)處氨基酸序列為PSIQSR／GLF，無(wú)多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，符合非致病性切割位點(diǎn)的特征。

特異位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，病毒宿主特異性受多基因的影響，HA 基因的226位成為影響病毒宿主特異性的主要因素，L226對(duì)唾液酸（SAα2，6gal）有較高的親和力，主要感染豬和人類呼吸道上皮細(xì)胞，而病毒Q226 有較低的SAα2，6gal親和力和低感染水平，傾向于特異性結(jié)合禽上皮細(xì)胞，而226為甲硫氨酸M，可同時(shí)結(jié)合禽流感和人流感受體。本株226位為Q［7］，是2009 年新型流感病毒的一個(gè)典型特征。此外聚合酶在禽流感病毒適應(yīng)哺乳動(dòng)物起了關(guān)鍵作用，PB2基因的627位氨基酸殘基是決定宿主特異性的主要因素［16］，通常禽源流感病毒PB2基因627位是谷氨酸E，人流感病毒該位置為賴氨酸（K），蛋白分析發(fā)現(xiàn)本毒株為E，說(shuō)明本株P(guān)B2基因來(lái)源于禽流感，這與進(jìn)化樹(shù)分析一致。PB1基因的375 位氨基酸涉及甲型流感病毒宿主范圍的特異性［17］，同 時(shí)，PB1 蛋 白 通 常 在 流 感 病 毒375 位 為 絲氨酸S時(shí)，毒株便具有潛在感染人的能力，其公共衛(wèi)生防護(hù)不容忽視。

綜上所述，本毒株A＼swine＼Shandong＼01＼2009（H1N1）序列完整，HA、NP、NS來(lái)源于古典豬流感譜系，PB2、M、PA 和NA 來(lái)源于禽流感譜系，PB1來(lái)源于人流感H3N2，是多種譜系的混合體，人類從未感染過(guò)此類病毒，可能缺乏免疫保護(hù)能力，從而顯示出其較強(qiáng)的致病能力。

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