黃 勇，蘭道亮，陳亞冰，林寶山，黃 偲，李 鍵

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041）

Janeway J C A 等［1］首次發(fā)現(xiàn)與果蠅同源的人的Toll蛋白，并命名為Toll 受體（Toll－like receptor，TLR），Toll樣受體可識別廣泛存在于病原體細(xì)胞表面的分子標(biāo)志，即病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），通過識別病原體及其產(chǎn)物，從而在病原體入侵機(jī)體的早期即啟動天然免疫，提示其在抗感染中的重要作用。激活TLR 不僅可以誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，而且有利于特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生，在天然免疫與獲得性免疫之間起橋梁作用。迄今為止，在哺乳動物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種Toll樣受體，即TLR1～13。

TLR9是哺乳動物細(xì)胞識別細(xì)菌和病毒DNA 中CpG（胞嘧啶－鳥嘌呤核苷酸）的主要受體，通過對CpG DNA的識別，最終引起Th1樣炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）功能性成熟，并刺激各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子［2］。TLR9不僅參與免疫系統(tǒng)“自己”與“非己”的識別，還與惡性腫瘤的發(fā)生和自身免疫紊亂相關(guān)［3］。TLR8主要識別單鏈RNA 和短鏈雙股RNA，從而引起NF－κB介導(dǎo)的各種細(xì)胞因子釋放，參與病毒感染［4－5］。Peng等研究發(fā)現(xiàn)，TLR8通過識別含聚鳥嘌呤的寡核苷酸或TLR的天然配體觸發(fā)TLR8－MyD88－IRAK4 信號活化途徑抑制Tregs 進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［6－7］。

目前，對牛、羊、豬、馬等動物的TLR8、TLR9基因，已經(jīng)有了比較深入的研究［8－10］。但是在牦牛上，對TLR8和TLR9兩個基因的相關(guān)研究報(bào)道卻很少，而牦牛作為高原特有古老物種，對高海拔地帶低氧、缺草、嚴(yán)寒等惡劣條件具有良好適應(yīng)能力，能夠?yàn)槟撩裉峁o可替代的生產(chǎn)資料以及生活資料，是高原畜牧業(yè)最重要的優(yōu)勢畜種。因此，本試驗(yàn)參考GenBank中牛TLR的CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，用RT－PCR方法克隆牦牛TLR8、TLR9基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)構(gòu)建這兩個基因的組織表達(dá)譜，為進(jìn)一步深入研究牦牛TLR8、9基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物及取材 試驗(yàn)動物由成都市青白江區(qū)唐家寺向陽牛市屠宰場提供，屬于麥洼牦牛（四川阿壩，海拔3 400m）。宰后立即采取心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、肌肉、卵巢、乳腺，均放入液氮中送回實(shí)驗(yàn)室，置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶購自天根公司；DNA片段回收純化試劑盒購自AXYGEN 公司；PMD－19TVector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA 合成 每100mg牦牛組織器官，加入1mL Trizol液氮研磨提取總RNA；采用Ferments公司的Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用20μL體系：Oligo dT181μL，5×Reaction buffer 4μL，RibolockTMRNase Inhibitor 1μL，10 mmol／L dNTP Mix 2μL，Reverse Transcriptase 1μL，模板2μg，最后用RNase Free dH2O補(bǔ)足20μL，按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃60min；70℃5min，合成cDNA，置－20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank提供的野牦牛TLR8（登錄號：XM－005891027.1）和牛TLR9（登錄號：NM－183081.1）基因的CDS序列及與人、綿羊等相應(yīng)序列的同源性比對結(jié)果，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對引物（A1、A2）對牦牛TLR8基因進(jìn)行分段擴(kuò)增，2對引物（B1、B2）對牦牛TLR9基因進(jìn)行分段擴(kuò)增。根據(jù)克隆所得序列再設(shè)計(jì)2對引物（A、B）分別用于TLR8和TLR9基因的熒光定量PCR 分析。內(nèi)參引物根據(jù)β－actin序列設(shè)計(jì)（表1）。所有引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.3 目的基因的克隆 牦牛脾臟組織cDNA 為模板，進(jìn)行PCR全長擴(kuò)增。采用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃5min；94 ℃45s，56 ℃45s，72 ℃1.5 min，32個循環(huán)；72 ℃5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳查看擴(kuò)增結(jié)果，Axygen凝膠回收試劑盒回收純化目的產(chǎn)物。將PCR 產(chǎn)物連接pMD19－T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在Amp＋瓊脂平板上涂板，37℃培養(yǎng)后挑選單菌落，菌液PCR 鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往Invitrogen（上海）公司進(jìn)行測序。

1.2.4 目的基因的組織表達(dá)譜分析 采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測牦牛TLR8和TLR9 兩個基因在不同組織的相對表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次，反應(yīng)體系為15μL：SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa 公司）7.5 μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA 1μL，dH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，72℃20s，39個循環(huán)；反應(yīng)在Bio－Rad公司熒光定量PCR儀上進(jìn)行。以β－actin基因作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 PCR 擴(kuò)增獲得的TLR8、9基因序列，拼接獲得cDNA 全長序列；蛋白質(zhì)的基本二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析采用SMART在線網(wǎng)站預(yù)測；并用DNA Star軟件、MEGA5.0軟件及一些在線軟件對所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)的相關(guān)分析。

表1 本試驗(yàn)中用到的引物Table 1 Primers used in the study

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆與鑒定

以牦牛脾臟組織總RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以上引物均獲得了特異性較好的PCR產(chǎn)物，大小和理論預(yù)期一致（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序和序列拼接后，分別獲得了3 102bp（GenBank登錄號為KM359140）和3 090bp（GenBank 登錄號為KM359141）的cDNA序列。

2.2 序列分析

利用EXPASY服務(wù)器分析發(fā)現(xiàn)，TLR8蛋白理論分子質(zhì)量為118.28ku，等電點(diǎn)為5.88，含有108個帶負(fù)電荷的氨基酸（D和E），91個帶正電荷的氨基酸（R和K），其不穩(wěn)定系數(shù)為39.98；TLR9蛋白理論分子質(zhì)量為115.45ku，等電點(diǎn)為9.04，其中帶負(fù)電荷的氨基酸（D 和E）有82個，帶正電荷的氨基酸（D 和E）101個，不穩(wěn)定系數(shù)為44.17。利用在線分析程序SMART（http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）對 蛋 白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析表明，牦牛TLR8具有1個跨膜結(jié)構(gòu)域、多個LRRs功能域、1個LRRCT、1個胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域、1個低復(fù)雜度區(qū)，TLR9具有多個胞外LRR域、1個胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域、1個低復(fù)雜度區(qū)（圖2）。

根據(jù)GenBank 公 布 的TLR8 和TLR9CDS 序列，利用DNAStar子程序MegAlign分別進(jìn)行多序列同源性比對以及采用NJ法分別建立牦牛與其他動物的遺傳進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn)牦牛TLR8基因的CDS區(qū)與野牦牛、黃牛和綿羊之間的CDS序列的同源性都很高，分別為99.9%、98.2%和97.6%；TLR9基因的CDS區(qū)與野牦牛、黃牛和綿羊的CDS序列同源性很高，分別是99.2%、99.2%和95.9%。進(jìn)一步的進(jìn)化樹分析顯示，牦牛TLR8、9與野牦牛的親緣關(guān)系最近，與大鼠和小鼠較遠(yuǎn)（圖3）。

圖1 TLR8、9基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of TLR8and TLR9genes

圖2 牦牛與牛的TLR8（A）和TLR9（B）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析與比較Fig.2 Analysis and comparison of the molecular structures of TLR8（A）and TLR9（B）proteins between yak and cattle

2.3 目的基因的組織表達(dá)譜

結(jié)果顯示，2個基因在各組織中均有表達(dá)，均在腎中的表達(dá)量最高。然而兩者也存在組織間表達(dá)差異，TLR8在肝、脾、肺、小腸、卵巢、乳腺等組織中也有較高表達(dá)，而在心、胃、大腸、肌肉中表達(dá)量較低；TLR9在心、肝、脾、肺、小腸、卵巢、乳腺中較高表達(dá)，在胃、大腸及肌肉中的表達(dá)量最低（圖4）。

3 討論

本研究以牦牛為試驗(yàn)材料，成功的克隆出牦牛TLR8、9兩個基因cDNA 序列，其編碼區(qū)序列長度分別為3 102bp和3 090bp，理論編碼1 033和1 029個氨基酸。利用Expasy在線程序分析，根據(jù)分析結(jié)果TLR8與TLR9蛋白的GRAVY 值分別為－0.133、－0.011，預(yù)測兩者均為親水蛋白；根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)推測，TLR8、TLR9蛋白結(jié)構(gòu)均含有不穩(wěn)定區(qū)域，這些不穩(wěn)定區(qū)域可能與受體或配體的結(jié)合相關(guān)。構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，這兩個基因的核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹與生物進(jìn)化的物種樹及動物分類學(xué)觀點(diǎn)基本一致，說明這兩個基因編碼區(qū)具有高度保守性。通過對蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測可知，牦牛TLR8、9具有數(shù)個不同胞外LRRs。分別對比牦牛與牛的TLR8、TLR9蛋白功能結(jié)構(gòu)域的排布方式（圖2），可以看出，牦牛與牛的TLR9蛋白大小、結(jié)構(gòu)域排列方式幾乎一致，提示TLR9在機(jī)體天然免疫中具有重要作用，且在生物進(jìn)化過程中很保守；而牦牛與牛的TLR8蛋白大小相近，結(jié)構(gòu)域排布方式相似，但仍存在一定差異，這種分子結(jié)構(gòu)的差異是否是造成牦牛與牛之間天然免疫能力不同的原因，還需進(jìn)一步研究。

圖3 TLR8（A）和TLR9（B）的核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TLR8（A）and TLR9（B）gene sequences

圖4 牦牛TLR8（A）和TLR9（B）基因的組織表達(dá)譜Fig.4 The tissue expression profile of yak TLR8（A）and TLR9（B）at mRNA level

本試驗(yàn)采用SYBR GreenⅠ熒光嵌合染料方法檢測了牦牛體內(nèi)TLR 轉(zhuǎn)錄水平，并以內(nèi)參基因β－actin作為校準(zhǔn)，采用相對定量方法測定目的基因mRNA表達(dá)量，保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性又提高了試驗(yàn)效率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，TLR8、9基因在牦牛所測組織中均有表達(dá)，均高表達(dá)于肝、脾、肺等組織，而在腎臟中表達(dá)最高，提示二者可能與腎臟免疫有密切聯(lián)系。Kimura J等［11］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠自身免疫性腎炎的腎小球中，Toll樣受體（TLR1、2、7、8、9、和13）及其NF－κB途徑下游因子（IL1β，IL－6，和TNFα）表達(dá)均上調(diào)。Liu L等［12］指出在多重感染膿毒癥模型中腎細(xì)胞的凋亡與急性腎損傷都依賴于TLR9。另外，這兩個基因在小腸、乳腺以及與生殖相關(guān)的卵巢中具有較高表達(dá)水平。Mantini Y 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠小腸內(nèi)，由絨毛柱狀上皮細(xì)胞的膜Toll樣受體和腺上皮細(xì)胞的可溶性Toll樣受體組成的細(xì)菌配體識別系統(tǒng)，可能有助于宿主防御機(jī)制選擇性清除革蘭陽性菌而不清除革蘭陰性菌。Karki K 等［14］發(fā)現(xiàn)惡性乳腺癌患者血清中，TLR9的表達(dá)隨著疾病進(jìn)程較良性患者顯著減少，而氧化應(yīng)激標(biāo)記物的表達(dá)成反比，說明TLR9可以作為氧化相關(guān)分子模式的傳感器，和識別低分化腫瘤的生物標(biāo)記物，TLR9還可能是炎癥、氧化損傷和乳腺癌之間的關(guān)鍵連接點(diǎn)。Tadeuchi T 等［15］報(bào)道了小鼠陰道TLR8、9 與妊娠維持有關(guān)，在妊娠末期TLR9mRNA 表達(dá)顯著下降，而TLR8幾乎沒有變化。以上報(bào)道說明TLR8、9基因很可能在牦牛常見的腸道疾病以及生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步解決牦牛及高原動物腹瀉，生殖疾病導(dǎo)致繁殖能力低下等難題提供了新的思路。

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