韓啟明， 何建新， 譚衛(wèi)琳， 余志才， 邵偉力

(1. 中原工學(xué)院 河南省功能性紡織材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450007； 2. 中原工學(xué)院 紡織服裝產(chǎn)業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 鄭州 450007； 3. 天津工業(yè)大學(xué) 紡織學(xué)院， 天津 300387)

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柞蠶絲素/聚乳酸納米纖維紗的制備及其生物學(xué)性能

韓啟明1,2， 何建新1,2， 譚衛(wèi)琳1,2， 余志才1,2， 邵偉力3

(1. 中原工學(xué)院 河南省功能性紡織材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450007； 2. 中原工學(xué)院 紡織服裝產(chǎn)業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 鄭州 450007； 3. 天津工業(yè)大學(xué) 紡織學(xué)院， 天津 300387)

為制備力學(xué)性能、可加工性、生物學(xué)性能良好的骨組織支架材料，利用雙重共軛靜電紡絲裝置制備了4種不同成分比例的柞蠶絲素(TSF)/聚乳酸(PLA)納米纖維紗線。分別通過SEM、紅外光譜和細(xì)胞體外培養(yǎng)表征了紗線的形態(tài)、二次結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能。結(jié)果表明：TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，成紗條干均勻，毛羽較少，紗線中纖維直徑較細(xì)，力學(xué)性能有所改善。細(xì)胞在體外培養(yǎng)不同時間后，TSF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的復(fù)合納米纖維紗(PLTF)支架材料上的細(xì)胞具有較好的細(xì)胞形態(tài)和較多的細(xì)胞數(shù)量，因此PLTF支架材料能夠作為合適的支架用于骨組織工程。

柞蠶絲素； 聚乳酸； 靜電紡； 納米纖維紗； 生物學(xué)性能

組織工程學(xué)是一門新興學(xué)科，主要研究人體組織和器官的修復(fù)或構(gòu)建，涉及細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)以及材料學(xué)[1-2]等學(xué)科。利用靜電紡絲方法制備的基于納米纖維的仿生支架材料在組織工程中作為替代材料具有較大的潛力，因?yàn)橄啾容^于宏觀、微觀支架材料，靜電紡絲納米纖維支架材料較大的比表面積，高孔隙率以及納米尺特性提供了更好的細(xì)胞與仿生材料界面環(huán)境[3-4]。目前用于制備基于納米纖維的仿生支架材料中的納米纖維結(jié)構(gòu)大都為不同類型的纖維氈，力學(xué)性能差，難以重復(fù)加工。如果能利用靜電紡絲的方法紡出納米纖維紗線[5]，纖維將沿著紗的軸向平行排列，相對于纖維氈具有較好的力學(xué)性能，而且可利用機(jī)織或針織技術(shù)加工成不同形式的結(jié)構(gòu)材料。絲素蛋白是具有生物活性的天然高分子材料[6]，尤其是柞蠶絲素蛋白具有豐富的丙氨酸殘基和Arg-Gly-Asp三肽序列，這種序列可用作生物識別，有利于細(xì)胞的黏附、增殖，使得TSF更適合生物學(xué)應(yīng)用[7-8]。PLA具有較好的生物相容性，在體內(nèi)可降解成乳酸，同時其具有較好的靜電可紡性[9]。在骨生長修復(fù)過程中，成骨細(xì)胞是主要的組織形成細(xì)胞，目前已經(jīng)建立了多種成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜隗w外研究，常用的有MG-63、MC-3T3、原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞等[10-12]。

本文通過自行搭建對稱四噴頭的高壓靜電紡納米纖維紗裝置制備出柞蠶絲素(TSF)和聚乳酸(PLA)不同成分比例的復(fù)合納米纖維紗，為骨組織工程提供了具有一定力學(xué)性能和良好生物性能的支架材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原材料

柞蠶蠶繭，聚乳酸 (PLA，重均相對分子質(zhì)量10 000)；人成骨肉瘤細(xì)胞(MG-63細(xì)胞)，購自中國國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，若丹明-毒傘素，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖檢測試劑盒，購自 Sigma 公司；使用的其他試劑均為分析純，不需要提純。

1.2 制備不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的紡絲溶液

用0.5%的碳酸鈉溶液在98 ℃對柞蠶蠶繭煮練脫膠處理3次，每次35 min。在50 ℃用硫氰酸鋰溶液將脫膠后的柞蠶絲溶解2 h 得到絲素粗溶液，然后將過濾后的絲素粗溶液倒入透析袋(截流相對分子質(zhì)量為8 000～14 000)中透析3 d。將透析后的柞蠶絲素稀溶液在無菌室中室溫下鼓風(fēng)濃縮至溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%后，放入冰箱冷藏一晚后用冷凍干燥機(jī)干燥。按照紡絲溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的配比，分別稱取TSF和PLA加入六氟異丙醇中，在通風(fēng)櫥中室溫下磁力攪拌1周，得到紡絲溶液。

1.3 制備不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的納米纖維紗

按照圖1所示復(fù)合納米紗制備裝置示意圖搭建靜電紡絲裝置，以制備TSF和PLA不同成分比例的納米纖維紗。兩端的注射泵將紡絲溶液勻速地輸送到各噴頭，開啟高壓發(fā)生器后在正、負(fù)間形成高壓電場，噴頭頭端的溶液液滴在高壓電場作用下首先形成泰勒錐，在電場力的進(jìn)一步作用下分散形成多股射流，直到細(xì)化為納米纖維集聚到旋轉(zhuǎn)的金屬喇叭口邊緣，絕緣棒在喇叭口中心開始牽引纖維，先形成倒錐形的纖維網(wǎng)，隨后成紗卷繞到旋轉(zhuǎn)卷繞輥上勻速收集紗線。紡絲電壓為18 kV，紡絲溶液總流量為0.9 mL/h(正、負(fù)噴頭流量比2∶1)，正負(fù)噴頭間距為17.5 cm，噴頭內(nèi)徑為0.5 mm，金屬喇叭轉(zhuǎn)速為100 r/min，紗線收集速度為53 mm/min。

圖1 TSF/PLA復(fù)合納米紗制備裝置示意圖Fig.1 Preparation device schematic diagram of TSF/PLA composite nanofiber yarns

1.4 紡絲液的特性測試

使用DDS-11A型電導(dǎo)率儀和NDJ-8S旋轉(zhuǎn)黏度計對不同種類的溶液進(jìn)行測試。每種溶液測試5次，取其平均值。

1.5 纖維紗表面形貌觀察

采用 JSM-6360 型電子掃描顯微鏡觀察復(fù)合納米纖維紗表面形貌。測試前樣品進(jìn)行鍍金處理，加速電壓為15 kV。

1.6 紅外光譜測試

使用NEXUS670型紅外-拉曼光譜儀對不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的復(fù)合納米纖維紗進(jìn)行紅外光譜分析。測試條件為：室溫20～25 ℃，相對濕度60%以下，分辨率2 cm-1，每個樣品掃描10次。

1.7 力學(xué)性能測試

利用SmileView軟件對不同的復(fù)合納米纖維紗線的SEM照片進(jìn)行處理得到紗線平均直徑。用Instron3365電子強(qiáng)力儀測試不同種類的TSF/PLA納米纖維紗的拉伸性能。每種紗線測試前需重置紗線直徑參數(shù)，所有紗線均在夾持長度10 mm，拉伸速度10 mm/min以及初始張力為0.2 cN的條件下進(jìn)行。每種紗線樣品重復(fù)測定10次，取其平均值。

1.8 細(xì)胞生長情況分析

對培養(yǎng)1、4 d后的細(xì)胞支架材料進(jìn)行熒光染色分析，先用多聚甲醛固定細(xì)胞，Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶液處理細(xì)胞以獲得通透性細(xì)胞，然后用若丹明-毒傘素和DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)分別對細(xì)胞膜、基質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后在熒光顯微鏡(尼康E200)下觀察。

1.9 細(xì)胞增殖活性分析

在預(yù)定培養(yǎng)天數(shù)(1、4和7 d)后，將MG-63細(xì)胞培養(yǎng)在含有MTT(5 mg/mL)的檢測試劑盒中，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。終止培養(yǎng)并去除上清液，每孔添加420 μL DMSO振蕩10 min，各孔移取100 μL溶液至96 孔平底培養(yǎng)板，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇492 nm 波長測定各孔吸光度值。

1.10 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，以監(jiān)測數(shù)據(jù)的可靠性，每組內(nèi)采集的多個數(shù)據(jù)使用重復(fù)測量方差法進(jìn)行分析，組間的數(shù)據(jù)比較分析采用t檢驗(yàn)，當(dāng)p<0.05時獲得的分析值被認(rèn)為可靠，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 TSF/PLA復(fù)合納米纖維紗的形貌

由相同的紡紗條件制備的不同質(zhì)量比的TSF和PLA復(fù)合納米纖維紗的SEM照片如圖2所示?？煽闯?，純的TSF因較差的力學(xué)性能難以連續(xù)成紗，而純的PLA顯示了較好的可紡性。圖3示出不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)紡絲溶液的黏度和電導(dǎo)率。如圖所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PLA純?nèi)芤壕哂休^高的黏度，而電導(dǎo)率較低。純的PLA納米纖維紗具有均勻的捻回分布，納米纖維紗中纖維幾乎沿捻向平行排列，但是納米纖維的直徑較大，約1 000 nm，相應(yīng)的納米纖維紗也具有較粗的直徑(130 μm)。

注：內(nèi)嵌圖像放大倍數(shù)為6 000。圖2 不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的復(fù)合納米纖維紗的SEM圖片(×500)Fig.2 SEM images of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction (×500)

圖3 不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的紡絲溶液的黏度/電導(dǎo)率圖Fig.3 Viscosity/conductivity images of spinning solution with different TSF mass fraction

當(dāng)TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，紡絲溶液黏度迅速降低，而電導(dǎo)率有所增加，纖維成紗直徑顯著降低至500 nm，并且成紗的條干顯著改善(70 μm)，毛羽減少。這是因?yàn)樽跣Q絲素蛋白大分子的側(cè)基上含有很多的極性基團(tuán)，這些側(cè)基在電場中產(chǎn)生電荷增加了紡絲溶液的導(dǎo)電率，另外與PLA大分子的相互作用降低了紡絲溶液的黏度，從而紡絲溶液的射流在更強(qiáng)的電場力作用下能得到更加充分的拉伸。

當(dāng)TSF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過15%后，紡絲液的電導(dǎo)率急劇增加，而黏度幾乎保持穩(wěn)定。在紡絲過程中，纖維不能穩(wěn)定地在喇叭口上集束，牽引出的紗線條干顯著惡化，表面毛羽顯著增多，而納米纖維紗中纖維的直徑分布呈現(xiàn)兩極化趨勢。其原因是隨著電導(dǎo)率的增加，同極射流間的排斥產(chǎn)生了大量的飛花，增加了纖維在喇叭口邊緣的集聚難度。

2.2 紅外光譜分析

TSF/PLA復(fù)合納米纖維紗的紅外光譜如圖4所示。純PLA納米纖維紗在1 759、1 456、1 387、1 269和1 182 cm-1處有特征吸收峰。添加TSF后，復(fù)合纖維紗的紅外吸收光譜圖在1 654、1 544、1 517、1 261和1 229 cm-1處出現(xiàn)了柞蠶絲素蛋白的吸收峰，其中歸屬于α螺旋和無規(guī)卷曲的吸收峰(1 654 和1 544 cm-1)較強(qiáng)，歸屬于β折疊的吸收峰(1 517和1 230 cm-1)較弱。隨著TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，柞蠶絲素蛋白歸屬于α螺旋、無規(guī)卷曲的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而在1 230 cm-1處歸屬于β折疊的吸收峰逐漸被覆蓋，這說明在TSF/PLA復(fù)合納米纖維紗中TSF以α螺旋、無規(guī)卷曲和β折疊結(jié)構(gòu)共存，其中主要的構(gòu)象是α螺旋和無規(guī)卷曲。這是因?yàn)樯淞鲝尼橆^射出后形成的纖維在極短時間內(nèi)集聚成束，絲素大分子沒有足夠時間調(diào)整構(gòu)象。

圖4 不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)復(fù)合納米紗線的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction

2.3 力學(xué)性能分析

在相同紡紗條件下，不同成分比例的紡絲溶液制得的TSF/PLA復(fù)合納米紗線的應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖5所示。純的PLA顯示了較好的力學(xué)性能，添加少量TSF對紗線的力學(xué)性能影響不大，但當(dāng)TSF含量超過15%以后，納米纖維紗的力學(xué)性能顯著下降，這可能是由于紡絲溶液發(fā)生相分離，脆性的TSF破壞了纖維中PLA大分子相的連續(xù)性。另外，惡化的紗線條干也使得紗線的力學(xué)性能下降。

圖5 不同TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的復(fù)合納米纖維紗的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.5 Stree-strain curve of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction

2.4 生物學(xué)性能分析

細(xì)胞的黏附、擴(kuò)散和增殖是評價特定骨材料細(xì)胞相容性和適應(yīng)性的重要參數(shù)。本文實(shí)驗(yàn)選取了力學(xué)性能較好的2種納米纖維紗支架材料，通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT法檢測細(xì)胞在材料表面早期的黏附、增殖，評價了納米纖維紗支架材料的生物學(xué)性能。圖6示出M9-63細(xì)胞在純PLA和PLTF支架材料上培養(yǎng)不同天數(shù)后的熒光顯微鏡照片。

在培養(yǎng)1 d和4 d 后對細(xì)胞進(jìn)行染色處理，蓋玻片上生長的細(xì)胞作為對照組。培養(yǎng)1 d后熒光圖像顯示MG-63細(xì)胞在PLTF(絲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的紗線)支架材料上具有良好的黏附和增殖性，細(xì)胞伸展充分，形狀規(guī)整，可清晰地觀察到細(xì)胞的纖維肌動蛋白和絲狀偽足。MG-63細(xì)胞在蓋玻片和PLA(純的PLA紗線)支架材料上的細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)?shù)黠@低于PLTF支架材料。培養(yǎng)到第4天，PLTF支架材料上的MG-63細(xì)胞已經(jīng)開始出現(xiàn)緊密排列，相互黏連。而PLA支架材料上大部分MG-63細(xì)胞分散分布呈現(xiàn)單細(xì)胞形態(tài)?？偟膩碚f，圖6中的結(jié)果顯示，接種在PLTF支架材料表面成骨細(xì)胞的蔓延，移動和伸展相較于其他支架材料上的細(xì)胞要更快一些，結(jié)果表明PLTF支架具有更好的能力以促進(jìn)細(xì)胞在體外的增殖。

培養(yǎng)在不同支架材料上的MG-63細(xì)胞的MTT數(shù)據(jù)如圖7所示。

由圖7可看出，培養(yǎng)1 d后，所有支架材料的OD(吸光度)值沒有顯著差異(p>0.05)，培養(yǎng)4 d和7 d以后，MG-63細(xì)胞在PLTF上的增殖活性明顯高于對照組和PLA支架(p<0.05)，表明PLTF支架材料中TSF的添加能夠極大地促進(jìn)MG-63細(xì)胞的增殖。有趣的是，在PLA支架材料上培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞增殖活性一直很緩慢，只有在第7天才顯著增加，但均低于PLTF和對照組支架材料，產(chǎn)生的這種差異可能是由于PLA支架材料表面的極性基團(tuán)較少不利于細(xì)胞的黏附與增殖。

圖6 MG-63細(xì)胞在純PLA和PLTF支架材料上培養(yǎng)不同天數(shù)后的熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 Fluorescence microscope images of MG-63 cells cultivated on pure PLA and PLTF scaffold after different days. (a) Coverslip-1 day; (b) Coverslip- 4 day; (c) Pure PLA-1 day; (d) Pure PLA- 4 day; (e) PLTF-1 day;(f) PLTF- 4 day

圖7 通過MTT分析MG-63細(xì)胞在不同支架材料表面增殖情況的直方圖Fig.7 Histogram of MG-63 cells proliferation on different scaffold surface by MTT assay

3 結(jié) 論

本文實(shí)驗(yàn)通過靜電紡絲方法制備了類似于骨中高度取向膠原的柞蠶絲素/聚乳酸PLA/TSF混合納米纖維紗。研究了不同絲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)靜電紡紗線的形態(tài)和力學(xué)性能。加入少量柞蠶絲素，復(fù)合納米纖維紗和紗中纖維的直徑都有明顯降低，其中紗線的直徑由130 μm降至70 μm，纖維的直徑由1 000 nm降至500 nm，紗線的形貌和力學(xué)性能明顯獲得了優(yōu)化。當(dāng)TSF質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過15%后，紡絲溶液開始出現(xiàn)分離，同種紗線中納米纖維呈現(xiàn)2種分布差異，一部分纖維平均直徑500 nm，另一部分平均直徑1 000 nm。總的來說，柞蠶絲素含量為10%的TSF/PLA復(fù)合納米纖維紗具有較細(xì)的纖維直徑(500 nm)，均勻的紗線細(xì)度(70 μm)和較好的力學(xué)性能(37.58 MPa)。生物相容性分析也證明了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TSF靜電紡納米紗線支架材料相比于純的PLA支架材料能提供更好的微觀環(huán)境以仿生自然細(xì)胞外基質(zhì)，可作為理想的骨組織工程支架材料。

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Preparation and biological properties of tussah fibroin/polylactic acid nanofiber yarns

HAN Qiming1,2， HE Jianxin1,2， TAN Weilin1,2， YU Zhicai1,2， SHAO Weili3
(1.HenanKeyLaboratoryofTextileMaterials,ZhongyuanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450007,China; 2.TextileandApparelIndustryCollaborativeInnovationCenterofHenan,ZhongyuanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450007,China; 3.SchoolofTextiles,TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China)

Tussah fibroin (TSF)/polylactic acid (PLA) composite nanofiber yarns with different ratios of TSF to PLA were prepared to fabricate tissue scaffold with great mechanical properties, good processability and biological properties by a double conjugation static-spinning device. The scanning electronic microscopy (SEM) and infrared spectroscopy (FT-IR) and cell culture in vitro were used to characterize the morphology, secondary structure and biological properties of the yarns separately. The result indicates that the yarn with the ratio of TSF to PLA of 1∶9 gains smaller diameter, uniform evenness as well as less hairiness and better mechanical. After being cultured in vitro for different time, the yarn with the ratio of TSF to PLA of 1∶9 as tissue scaffold keep healthy and more cell counts to make the PLTF yarn suitable as appropriate scaffold for bone tissue engineering.

tussah fibroin; polylactic acid; electrostatic spinning; nanofiber yarn; biological property

10.13475/j.fzxb.20141007806

2014-10-29

2015-06-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51203196)；NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1204510)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A540003，14A540006)；鄭州市普通科技攻關(guān)項(xiàng)目(141PPTGG400)

韓啟明(1989—)，女，碩士生。主要研究方向?yàn)榧{米生物材料。何建新，通信作者， E-mail：hejianxin 771117@163.com。

TS 102.1

A