張宇

（黑龍江省林業(yè)監(jiān)測規(guī)劃院，黑龍江 哈爾濱 150080）

水曲柳是我國東北珍貴的“三大硬闊”之一，由于開發(fā)歷史較早，其分布范圍和種群數(shù)量明顯減少，已被國家列為漸危種[1]。對水曲柳胚胎發(fā)生進行系統(tǒng)研究，掌握其生物學特性，是加速水曲柳繁殖又一舉措。在植物離體培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的碳源是培養(yǎng)過程中的重要因素。植物細胞培養(yǎng)一般采用蔗糖、果糖、葡萄糖為碳源，而蔗糖是生長效果最好的[2]。為此，本研究以水曲柳子葉為試驗材料，探討了不同的蔗糖濃度對水曲柳愈傷組織和體細胞胚發(fā)生的影響，以期為水曲柳體細胞胚發(fā)生研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料取自吉林省露水河林業(yè)局50年生發(fā)育良好的水曲柳母樹，將單片子葉作為試驗材料。

1.2 試驗設計

以1／2MS（將所有元素都減半的MS培養(yǎng)基）為基本培養(yǎng)基，附加激素NAA和BA。本試驗采用3種激素濃度和15種蔗糖濃度共計45個處理的設計。3種激素組合為：①5mgL－1NAA和1mg L－1BA；②5mgL－1NAA和2mgL－1BA；③2 mgL－1NAA和5mgL－1BA。蔗糖濃度分別為10、20、30……150gL－1。

1.3 材料接種及培養(yǎng)條件

在室內(nèi)進行種子去翅，置于去離子水中浸泡2～3d，用70%酒精處理30～40s后，再用10%的雙氧水處理10min，然后用無菌的去離子水沖洗4～5次。在超凈工作臺將種子平放，用解剖刀在種子的胚根端及兩側(cè)各切去少許，挑開種皮，取出種胚。將種胚上的胚根切去，取單片子葉接種。采用暗培養(yǎng)，接種后放入紙箱中或用數(shù)層黑布遮蓋置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室的溫度控制在25±2℃，濕度60%～70%之間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔗糖濃度對愈傷組織誘導的影響

在這45個處理中蔗糖濃度達到140gL－1時外植體上無愈傷組織的產(chǎn)生。由圖1可知，3種處理中蔗糖濃度分別為80gL－1，60gL－1和50g L－1時愈傷組織的誘導率最高，分別為20%，16.7%和30%。由圖中還可看出，隨著NAA與BA比例的增高，誘導愈傷組織的最適蔗糖濃度也隨之升高，但其具體是何種關(guān)系還需近一步的分析研究。

圖1 不同蔗糖濃度對愈傷組織誘導的影響

2.2 不同蔗糖濃度對體細胞胚發(fā)生的影響

一般來說，在一定濃度范圍內(nèi)提高滲透壓有利于體細胞胚發(fā)生發(fā)育。本試驗結(jié)果也證實了這一點（圖2）。蔗糖濃度低于2%和高于14%時均不能誘導體細胞胚的發(fā)生。蔗糖濃度在7%時的體細胞胚發(fā)生率明顯高于低濃度蔗糖時的體胚發(fā)生率。然而，與這些觀點不同的是，圖2顯示體細胞胚發(fā)生率有兩個峰值，即當NAA為5mgL－1，BA為1mg L－1和2mgL－1時體胚發(fā)生率的兩個峰值都出現(xiàn)在附加7%和10%蔗糖的培養(yǎng)基中，而當NAA為2 mgL－1，BA為5mgL－1時，峰值出現(xiàn)在附加10%和13%的蔗糖的培養(yǎng)基中。

圖2 不同蔗糖濃度對體細胞胚發(fā)生的影響

2.3 蔗糖濃度對體細胞胚數(shù)量和質(zhì)量的影響

與蔗糖濃度對愈傷組織和體細胞胚的誘導率影響相似，蔗糖濃度的不同使得單個外植體上體細胞胚數(shù)量和質(zhì)量也出現(xiàn)了兩個峰值。在3種激素處理中蔗糖濃度分別為12%、9%和12%時單個外植體上的體細胞胚數(shù)量最多，分別為16個、18個和13個；另一個峰值出現(xiàn)在蔗糖濃度為3%、5%和10%（圖3），但這些體細胞胚相對較小，略黃。

圖3 不同蔗糖濃度對體細胞胚數(shù)量的影響

同時，蔗糖濃度影響體胚的質(zhì)量。試驗發(fā)現(xiàn)，白色胚比例隨蔗糖濃度增加呈上升趨勢，當蔗糖濃度在6%～8%時，白色胚比例可達100%，隨后白色胚比例開始下降，當蔗糖濃度在10%～12%時白色胚比例達到另一個峰值（90%）。

3 結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)中，糖的用量影響著培養(yǎng)物的生長速度和生長量及其代謝水平，是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵之一[3]。在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度較低時有利于愈傷組織的誘導，而較高的蔗糖濃度對直接體細胞胚胎發(fā)生起促進作用。蔗糖濃度較高時愈傷組織誘導率下降這可能是由于高的蔗糖濃度抑制了愈傷組織的誘導，眾所周知蔗糖濃度過高會對細胞的形態(tài)建成起副作用。本試驗表明，當NAA多于BA時，附加7%蔗糖的體細胞胚發(fā)生率最高；而當BA多于NAA時，附加10%蔗糖的體細胞胚發(fā)生率最高，但每個外植體上體細胞胚的數(shù)量和質(zhì)量不是最好的。綜合體細胞胚發(fā)生的各個方面，選定9%～12%的蔗糖濃度最有利于水曲柳體細胞胚的誘導。

[1]中國樹木志編委會.中國主要樹種造林技術(shù)[M].北京：中國林業(yè)出版社，1983：780－784

[2]侯學文，郭勇.接種量及蔗糖濃度對懸浮培養(yǎng)玫瑰茄細胞生長的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2000（4）：51－54

[3]陳麗娟，周嘉運，閉志強，等.蔗糖濃度和激素對粉蕉離體快繁的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2001，14（2）：66－68