張宇

（黑龍江省林業(yè)監(jiān)測(cè)規(guī)劃院，黑龍江 哈爾濱 150080）

水曲柳是我國(guó)東北珍貴的“三大硬闊”之一，由于開發(fā)歷史較早，其分布范圍和種群數(shù)量明顯減少，已被國(guó)家列為漸危種[1]。對(duì)水曲柳胚胎發(fā)生進(jìn)行系統(tǒng)研究，掌握其生物學(xué)特性，是加速水曲柳繁殖又一舉措。在植物離體培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的碳源是培養(yǎng)過程中的重要因素。植物細(xì)胞培養(yǎng)一般采用蔗糖、果糖、葡萄糖為碳源，而蔗糖是生長(zhǎng)效果最好的[2]。為此，本研究以水曲柳子葉為試驗(yàn)材料，探討了不同的蔗糖濃度對(duì)水曲柳愈傷組織和體細(xì)胞胚發(fā)生的影響，以期為水曲柳體細(xì)胞胚發(fā)生研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自吉林省露水河林業(yè)局50年生發(fā)育良好的水曲柳母樹，將單片子葉作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以1／2MS（將所有元素都減半的MS培養(yǎng)基）為基本培養(yǎng)基，附加激素NAA和BA。本試驗(yàn)采用3種激素濃度和15種蔗糖濃度共計(jì)45個(gè)處理的設(shè)計(jì)。3種激素組合為：①5mgL－1NAA和1mg L－1BA；②5mgL－1NAA和2mgL－1BA；③2 mgL－1NAA和5mgL－1BA。蔗糖濃度分別為10、20、30……150gL－1。

1.3 材料接種及培養(yǎng)條件

在室內(nèi)進(jìn)行種子去翅，置于去離子水中浸泡2～3d，用70%酒精處理30～40s后，再用10%的雙氧水處理10min，然后用無菌的去離子水沖洗4～5次。在超凈工作臺(tái)將種子平放，用解剖刀在種子的胚根端及兩側(cè)各切去少許，挑開種皮，取出種胚。將種胚上的胚根切去，取單片子葉接種。采用暗培養(yǎng)，接種后放入紙箱中或用數(shù)層黑布遮蓋置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室的溫度控制在25±2℃，濕度60%～70%之間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔗糖濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在這45個(gè)處理中蔗糖濃度達(dá)到140gL－1時(shí)外植體上無愈傷組織的產(chǎn)生。由圖1可知，3種處理中蔗糖濃度分別為80gL－1，60gL－1和50g L－1時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，分別為20%，16.7%和30%。由圖中還可看出，隨著NAA與BA比例的增高，誘導(dǎo)愈傷組織的最適蔗糖濃度也隨之升高，但其具體是何種關(guān)系還需近一步的分析研究。

圖1 不同蔗糖濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同蔗糖濃度對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

一般來說，在一定濃度范圍內(nèi)提高滲透壓有利于體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖2）。蔗糖濃度低于2%和高于14%時(shí)均不能誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生。蔗糖濃度在7%時(shí)的體細(xì)胞胚發(fā)生率明顯高于低濃度蔗糖時(shí)的體胚發(fā)生率。然而，與這些觀點(diǎn)不同的是，圖2顯示體細(xì)胞胚發(fā)生率有兩個(gè)峰值，即當(dāng)NAA為5mgL－1，BA為1mg L－1和2mgL－1時(shí)體胚發(fā)生率的兩個(gè)峰值都出現(xiàn)在附加7%和10%蔗糖的培養(yǎng)基中，而當(dāng)NAA為2 mgL－1，BA為5mgL－1時(shí)，峰值出現(xiàn)在附加10%和13%的蔗糖的培養(yǎng)基中。

圖2 不同蔗糖濃度對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

2.3 蔗糖濃度對(duì)體細(xì)胞胚數(shù)量和質(zhì)量的影響

與蔗糖濃度對(duì)愈傷組織和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率影響相似，蔗糖濃度的不同使得單個(gè)外植體上體細(xì)胞胚數(shù)量和質(zhì)量也出現(xiàn)了兩個(gè)峰值。在3種激素處理中蔗糖濃度分別為12%、9%和12%時(shí)單個(gè)外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量最多，分別為16個(gè)、18個(gè)和13個(gè)；另一個(gè)峰值出現(xiàn)在蔗糖濃度為3%、5%和10%（圖3），但這些體細(xì)胞胚相對(duì)較小，略黃。

圖3 不同蔗糖濃度對(duì)體細(xì)胞胚數(shù)量的影響

同時(shí)，蔗糖濃度影響體胚的質(zhì)量。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白色胚比例隨蔗糖濃度增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖濃度在6%～8%時(shí)，白色胚比例可達(dá)100%，隨后白色胚比例開始下降，當(dāng)蔗糖濃度在10%～12%時(shí)白色胚比例達(dá)到另一個(gè)峰值（90%）。

3 結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)中，糖的用量影響著培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量及其代謝水平，是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵之一[3]。在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度較低時(shí)有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，而較高的蔗糖濃度對(duì)直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生起促進(jìn)作用。蔗糖濃度較高時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率下降這可能是由于高的蔗糖濃度抑制了愈傷組織的誘導(dǎo)，眾所周知蔗糖濃度過高會(huì)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)建成起副作用。本試驗(yàn)表明，當(dāng)NAA多于BA時(shí)，附加7%蔗糖的體細(xì)胞胚發(fā)生率最高；而當(dāng)BA多于NAA時(shí)，附加10%蔗糖的體細(xì)胞胚發(fā)生率最高，但每個(gè)外植體上體細(xì)胞胚的數(shù)量和質(zhì)量不是最好的。綜合體細(xì)胞胚發(fā)生的各個(gè)方面，選定9%～12%的蔗糖濃度最有利于水曲柳體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。

[1]中國(guó)樹木志編委會(huì).中國(guó)主要樹種造林技術(shù)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1983：780－784

[2]侯學(xué)文，郭勇.接種量及蔗糖濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)玫瑰茄細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000（4）：51－54

[3]陳麗娟，周嘉運(yùn)，閉志強(qiáng)，等.蔗糖濃度和激素對(duì)粉蕉離體快繁的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，14（2）：66－68