鄧春青 馮珊珊

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，我國1992年的血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示：國內(nèi)一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）陽性率為9.75%[1]，屬于HBV感染的高流行區(qū)。HBV感染后容易慢性化，與肝硬化和肝癌的發(fā)生顯著相關(guān)，部分還可轉(zhuǎn)變?yōu)橹匦透窝譡2]。目前在HBV感染的遺傳易感性研究中，疾病關(guān)聯(lián)研究最常用。筆者進(jìn)行HBV感染候選基因的關(guān)聯(lián)研究所需的大樣本量較歐、美等發(fā)達(dá)地區(qū)更具優(yōu)勢。關(guān)鍵之處則在于將收集的大量樣本抽提出DNA并制備成分型所用96孔模板，這無疑是進(jìn)行疾病關(guān)聯(lián)研究的基礎(chǔ)和前提。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象選擇本院傳染科門診及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地區(qū)漢族居民，靜脈抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血：5 mL用于基因組DNA提?。? mL用于病毒標(biāo)志和生化檢測；同時填寫詳細(xì)的臨床資料并輸入計算機(jī)。樣本收集過程按照國家人類基因組研究倫理學(xué)準(zhǔn)則進(jìn)行，獲得了收集對象的知情同意。乙型肝炎依據(jù)2000年西安第十次全國病毒性肝炎會議修訂“病毒性肝炎防治方案”制定標(biāo)準(zhǔn)診斷[3]，另外筆者收集了部分血站獻(xiàn)血員作為正常對照。

1.2 方法

1.2.1 人白細(xì)胞基因組DNA提取 采用Miller鹽析法[4]進(jìn)行。（1）EDTA-K2抗凝全血5 mL，置于50 mL有蓋圓底離心管內(nèi)。（2）加6~8倍體積（約35~40 mL）蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，于4 ℃ 5000 g離心20 min。（3）傾倒上清后于沉淀中加入預(yù)冷的0.1%Triton-X100（約35~40 mL），輕柔混勻沉淀，再次于4 ℃ 5000 g離心20 min，然后棄上清。（4）加入2 mL裂解液于沉淀中，徹底打碎沉淀，然后加入10%SDS 100 μL至終濃度為0.5%，混勻。（5）加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至終濃度為200 μg/mL，混勻，于55 ℃4 h或37 ℃過夜消化。（6）加入6.0M NaCl液0.7 mL，劇烈振蕩20 s。（7）7000 g離心20 min，將上清移至50 mL有蓋圓底離心管內(nèi)。（8）加入2倍體積-20 ℃無水乙醇或95%乙醇，反復(fù)顛倒混勻，直至出現(xiàn)絮狀沉淀，挑出DNA至一eppendorf管中。（9）1 mL 75%乙醇洗滌DNA兩遍。自然晾干，用200 μL TE溶解DNA（4 ℃需要3~7 d）。（10）75%乙醇中的DNA離心，棄上清。（11）凝膠電泳確定所提DNA，UV計測定純度和濃度，于TE中-20 ℃凍存。

1.2.2 模板的制備 （1）將所抽提的DNA樣本定量后加水稀釋至終濃度5~10 ng/μL置于96孔PCR板中。（2）每個96孔PCR板的最后2孔設(shè)為空白對照不加DNA樣本。（3）用鋁箔膠帶封口。（4）于Eppendorf Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)中離心5 min。（5）置-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

歷時將近兩年，去除因各種原因資料不全以及極少數(shù)抽提DNA不理想的樣本，共收集到2561份DNA標(biāo)本，全部制備成96孔模板。其中，男1940例，女621例，年齡21~75歲。

收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎（AHB）15例，乙肝病毒攜帶者（AsC）279例，慢性乙型病毒性肝炎（CHB）1497例，肝癌（HCC）23例，肝硬化（LC）218例，重型乙型病毒性肝炎（SHB）168例，自身免疫性肝炎（AIH）15例，慢性丙型病毒性肝炎（CHC）16例，原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）5例，其他原因所致疾?。∣thers）104例，同時收集正常獻(xiàn)血員（BD）221例，詳細(xì)患者臨床資料見表1。

表1 所選患者臨床資料

圖1 全血基因組DNA

圖2 鋁箔膠帶封口96孔模板

3 討論

乙型肝炎呈世界性流行，不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌。因此，它已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國當(dāng)前流行最為廣泛、危害性最嚴(yán)重的一種疾病。本試驗(yàn)所收集到的HBV感染病例中，急性感染者僅占0.68%（15/2200），其余分別表現(xiàn)為慢性肝炎、乙型肝炎病毒攜帶、肝硬化甚至肝癌等慢性HBV感染狀態(tài)。當(dāng)然，除歸結(jié)于諸多隱性HBV感染外[6]，HBV感染所致較高慢性化程度的本質(zhì)也暴露無疑。筆者收集的病例包括乙肝病毒攜帶者、急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等HBV感染所致的所有疾病譜。而且在收治的所有肝病中，確診有HBV感染的占94.02%（2200/2340），再一次強(qiáng)勢表明HBV感染仍是今后較長時期面臨的主要疾病[5]，因而有關(guān)HBV感染的研究也將任重而道遠(yuǎn)。此外，自身免疫性肝病作為一種發(fā)病機(jī)理不明的疾病與許多疾病有關(guān)聯(lián)，且由于最初的臨床癥狀與病毒性肝炎癥狀相似，臨床上診斷比較困難。因此，準(zhǔn)確及時地監(jiān)測出自身免疫性肝病的特異性自身抗體無疑對診斷以及進(jìn)一步治療具有重要意義。臨床上最典型的自身免疫性肝病包括：原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）和自身免疫性肝炎（AIH）。隨著檢測水平的不斷提高和檢測手段的日趨完善，原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎等諸多自身免疫性肝病的診斷一定會愈來愈受到重視。

以生物學(xué)功能相關(guān)的基因作為候選基因進(jìn)行疾病關(guān)聯(lián)研究，是當(dāng)前宿主遺傳易感性研究的主要策略。關(guān)聯(lián)研究是一種簡單、實(shí)用的分析技術(shù)，就是發(fā)現(xiàn)存在于大量數(shù)據(jù)集中的關(guān)聯(lián)性或相關(guān)性，從而描述了一個事物中某些屬性同時出現(xiàn)的規(guī)律和模式。關(guān)聯(lián)研究不必知道疾病的遺傳模式、表現(xiàn)型比率、不完全外顯率、遺傳異質(zhì)性等，便于設(shè)計及開展，而且大量樣本可產(chǎn)生重復(fù)性良好的結(jié)果。關(guān)聯(lián)研究最重要的是應(yīng)該避免因群體混雜或分層而出現(xiàn)的虛假的陽性關(guān)聯(lián)結(jié)果，為避免這種情況的發(fā)生，可采取一些措施：臨床分型詳細(xì)、適當(dāng)；病例和對照應(yīng)受相同病因作用，排除疾病異質(zhì)性；樣本量足夠大；病例/對照性別、年齡匹配。本試驗(yàn)中筆者所收集到的樣本量足夠大，病例和對照人群來自太原地區(qū)，病例與對照之間的年齡、性別基本匹配，臨床分型嚴(yán)格按照西安全國肝病會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，保證了進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究的需要。

由于分散性的進(jìn)行樣本收集，筆者采取了一定的策略：零星收集標(biāo)本后凍存，然后集中進(jìn)行提取。收集標(biāo)本的同時填寫詳盡的臨床學(xué)資料并錄入電腦，這樣排除了樣本重復(fù)的可能。筆者還將患者既往情況、既往住院病歷從信息科一一調(diào)出核查證實(shí)以確保詳實(shí)地反映患者的疾病狀況尤其是HBV感染狀態(tài)、肝臟功能等，另外，筆者收集標(biāo)本、抽提DNA以及制作模板的過程當(dāng)中，完全按所收集標(biāo)本時間的先后順序依次完成，始終未將患者的診斷考慮在內(nèi)，從而保證了樣本的隨機(jī)性。

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100~200 kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。電泳鑒定提取的DNA如果不成區(qū)帶，而是散開，則說明DNA已經(jīng)被降解成小分子，不能再用來進(jìn)行限制性酶切等基因研究。本試驗(yàn)所抽提人基因組DNA成完整區(qū)帶，濃度較高、純度較好、質(zhì)量相當(dāng)穩(wěn)定，證實(shí)靜脈血仍然是提取基因組DNA的最佳標(biāo)本[7]。商業(yè)化DNA抽提試劑盒以及既往傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法均需要分離外周血白細(xì)胞[8-9]，無法有效提取凍存血樣；實(shí)際操作可行性小，以試劑盒提取大樣本量的DNA花費(fèi)過高，對筆者所收集的如此龐大的病例標(biāo)本來說無疑代價高昂。在初始采用鹽析法提取凍存全血基因組的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)37 ℃過夜消化或加入蛋白酶K后于55 ℃消化4 h兩者之間所提取的DNA有較大差別。無論所提取DNA的濃度、質(zhì)量或者穩(wěn)定性，經(jīng)37 ℃過夜消化后均明顯優(yōu)于55 ℃消化4 h。故此筆者之后基本采取了加入蛋白酶K后于37 ℃過夜消化的方法?？偠灾?，采用鹽析法提取凍存全血基因組DNA方便、經(jīng)濟(jì)，所提DNA質(zhì)量穩(wěn)定，UV計測定純度和濃度后顯示足以滿足PCR擴(kuò)增的需要。以此模板庫為基礎(chǔ)，誕生了許多重要的研究[10-15]。

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