陳曉娟 肖宗宇 潘琪 侯倩 才鼎 周有婷

腦血管病是威脅全世界人類生命健康的一類疾病，其中缺血性腦梗死作為神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率和致殘率均很高。且隨著人口結(jié)構(gòu)的老齡化和吸煙人口的增加，腦血管病的發(fā)病率有進一步上升的趨勢。傳統(tǒng)的治療方法包括藥物、康復(fù)理療和功能鍛煉等，但效果均不理想。近年來，隨著干細胞（Stem cells，SCs）理論的提出，不少研究者相繼報道從神經(jīng)組織、脂肪組織、骨髓等組織中分離并培養(yǎng)出了各自的干細胞，其中神經(jīng)系統(tǒng)來源的干細胞被稱之為神經(jīng)干細胞（Neural stem cells，NSCs）[1]。近年來，隨著神經(jīng)干細胞研究的不斷深入，部分研究者將骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成功誘導(dǎo)為骨髓源神經(jīng)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs）[2]。BMSCs-NSCs的開發(fā)和應(yīng)用，克服了從成體腦組織中獲取神經(jīng)干細胞和危險性和局限性，也避免了胚胎來源干細胞移植中存在的倫理、免疫排斥、來源有限等問題。骨髓基質(zhì)細胞源性神經(jīng)干細胞的移植治療修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害成為了研究重點，這給腦梗死的細胞移植治療帶來了新思路[1-3]。因此，本研究選用Wistar大鼠骨髓基質(zhì)細胞，運用含bFGF和EGF的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，擬培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞，為骨髓源神經(jīng)干細胞的進一步研究打下基礎(chǔ)，現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年Wistar大鼠，雄性，體重（200±50）g，購于蘭州大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（甘）2013-0002。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶（購自Gibco公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Hyclone公司。B27添加劑購自Invitrogen公司。表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）購自Peprotech公司，小鼠抗Nestin抗體、兔抗GFAP抗體、小鼠抗Galc抗體購自Chemicon公司，小鼠抗MAP2抗體、兔抗β-tubulin Ⅲ抗體購自Abcam公司，兔抗CD133抗體購自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG購自Molecular Probes公司。DAPI封片劑購自Vector Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1 Wistar大鼠骨髓基質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 將所選大鼠無菌條件下取雙側(cè)股骨和肱骨，取5 mL無菌注射器，用10 mL DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，用吸管將骨髓組織懸液反復(fù)吹打均勻，1000 r/min，離心5 min后，以含10% FBS的DMEM/F12含血清培養(yǎng)基重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。骨髓細胞通過直接貼壁法培養(yǎng)，根據(jù)大鼠骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長的特征，采用差異貼壁法，定期更換掉不貼壁的細胞，得到貼壁生長的骨髓基質(zhì)干細胞，48 h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同前，去除未貼壁細胞，并以PBS緩沖液輕輕沖洗2遍。以后每隔72小時換液1次，待原代細胞達到90%融合后，用0.25%胰酶消化進行傳代，通過傳代培養(yǎng)進行純化及擴增。。

1.2.2 Wistar大鼠骨髓源性神經(jīng)球的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法采用無血清懸浮培養(yǎng)法，選擇第四代在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)呈對數(shù)生長期的貼壁骨髓基質(zhì)細胞，用0.25%胰酶消化，吸管反復(fù)吹打制成單細胞懸液，以含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF及使用濃度為1∶50的B27添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，調(diào)整活細胞密度為2×105/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2~3 d換半液1次，并添加半量bFGF、EGF、B27等生長因子。

1.2.3 Wistar大鼠骨髓源性神經(jīng)球的CD133和Nestin檢測 （1）選取在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長的狀態(tài)良好的大鼠骨髓源神經(jīng)球，去除培養(yǎng)基，0.01 mol/L PBS沖洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min；0.01 mol/L PBS沖洗3次；（2）0.3% Triton X-100破膜，室溫10 min；0.01 mol/L PBS沖洗3次；（3）10%正常山羊血清封閉60 min；（4）滴加一抗：兔抗CD133（1∶200）和小鼠抗Nestin（1∶100）置濕盒中4 ℃孵育過夜，去除一抗，0.01 mol/L PBS沖洗3次；（5）滴加二抗：Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）和Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗小鼠IgG（1∶200），37 ℃孵育1 h，去除二抗后，0.01 mol/L PBS沖洗3次；（6）用含DAPI的封片劑（H-1200，Vector Laboratories）對細胞核進行復(fù)染，并封片，熒光顯微鏡下觀察。（7）同時設(shè)陰性對照實驗，以抗體稀釋液代替一抗，結(jié)果鏡下不顯色，為陰性結(jié)果。

1.2.4 Wistar大鼠骨髓源性神經(jīng)球的分化 Wistar大鼠骨髓基質(zhì)細胞在無血清培養(yǎng)條件下，呈球狀聚集生長，選擇生長狀態(tài)良好的大鼠骨髓源神經(jīng)球，經(jīng)0.01%胰酶消化制成單細胞懸液或直接將神經(jīng)球用PBS液清洗，按2×105個活細胞/mL的密度，接種于含血清培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%FBS），置37 ℃，5% CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分化7 d后，行免疫細胞熒光檢測，具體操作步驟如下：（1）去除培養(yǎng)基，0.01 mol/L PBS沖洗2次，用4%多聚甲醛固定30 min；0.01 mol/L PBS沖洗3次，5 min/次；（2）10%正常山羊血清封閉60 min；（3）滴加一抗：小鼠抗 GFAP（1∶500），小鼠抗 MAP-2（1∶100），小鼠抗 β-tubulin Ⅲ（1∶100），小鼠抗Galc（1∶100）置濕盒中4 ℃孵育過夜，去除一抗，0.01 mol/L PBS沖洗3次；（4）滴加二抗：Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗小鼠IgG（1∶200）、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（1∶200），37 ℃孵育1 h，去除二抗后，0.01 mol/L PBS沖洗 3次；（5）用含 DAPI的封片劑（H-1200，Vector Laboratories）對細胞核進行復(fù)染，并封片，熒光顯微鏡下觀察。（6）同時設(shè)陰性對照實驗，以抗體稀釋液代替一抗，結(jié)果鏡下不顯色，為陰性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Wistar大鼠骨髓基質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)觀察 通過倒置相差光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，至第三代時骨髓基質(zhì)細胞形態(tài)較為均一，已經(jīng)得到純化，細胞形態(tài)以長梭形為主，體積較小、大小基本一致，增殖速度較快，經(jīng)多次傳代其細胞形態(tài)、大小及增殖方式不會發(fā)生改變（圖 1）。

圖1 顯微鏡下第四代骨髓基質(zhì)干細胞圖注：細胞呈貼壁生長，梭形，交織成網(wǎng)，放大倍數(shù)：×200

2.2 大鼠骨髓源性神經(jīng)球的誘導(dǎo)培養(yǎng)、鑒定及CD133和Nestin檢測結(jié)果 DMEM/F12培養(yǎng)基中，大部分細胞呈懸浮生長，形成細胞球，細胞球由幾個到幾十個細胞組成，大部分細胞球呈圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長，球體內(nèi)細胞數(shù)量增多，球體增大，但球體內(nèi)細胞增殖速度較慢，約7~9 d傳代1次。經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測，所形成的細胞球呈CD133和Nesitn陽性（圖2）。

圖2 顯微鏡下大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞圖注：大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞呈Nestin（綠色、圖2A）、CD133（紅色、圖2B）陽性，細胞核以DAPI復(fù)染（藍色、圖2C），熒光顯微鏡，標(biāo)尺為50 μm

2.3 大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞的分化 將大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞去除生長因子，并轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其生長方式再次發(fā)生改變，不再呈懸浮生長，而是再次轉(zhuǎn)為貼壁生長，單細胞及神經(jīng)球很快發(fā)生貼壁，貼壁后細胞不再呈圓形，而是伸出突起，呈梭形、多角形及不規(guī)則形等，且其增殖速度較在無血清培養(yǎng)基中為快。分化7 d后，行免疫熒光細胞化學(xué)檢測，可表達星形膠質(zhì)細胞表面標(biāo)志物GFAP、神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2和β-tubulin Ⅲ，少突膠質(zhì)細胞表面標(biāo)志物Galc。其中大部分細胞均呈GFAP陽性，少部分細胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc陽性（圖3）。

圖3 大鼠骨髓源神經(jīng)細胞球免疫熒光檢測圖注：大部分細胞均呈GFAP陽性（圖3A），少部分細胞呈MAP-2（圖3B）、Galc（圖3C）及β-tubulin Ⅲ陽性（圖3D），熒光顯微鏡放大倍數(shù)：×200

3 討論

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)的，具有無限增殖、自我更新及多向分化潛能的細胞[1]，最早由Reynolds等[4]分離得到并提出這一概念，以后的研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個部位存在神經(jīng)干細胞，如腦室、腦室下區(qū)、中腦導(dǎo)水管周圍等[1，5]，它具備無限增殖、自我更新及多向分化潛能，其增殖方式包括對稱分裂和不對稱分裂兩種分裂方式，通過對稱分裂進行自我更新與增殖，產(chǎn)生兩個子代神經(jīng)干細胞；而通過不對稱分裂產(chǎn)生一個神經(jīng)干細胞，另一個為相對成熟的已分化細胞，通過不對稱的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細胞，如神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等。神經(jīng)干細胞不僅存在于動物胚胎時期發(fā)育的腦組織中，在成年動物腦中也存在。神經(jīng)干細胞的主要功能是作為一種后備儲備，它在一定條件下可以進行增殖、遷移和分化并參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)或細胞正常死亡的更新[6-7]。但是成體中樞神經(jīng)損傷后其自我再生能力有限，遠遠不能完成神經(jīng)功能的再生修復(fù)的功能，特別是大面積受損的中樞神經(jīng)組織，僅靠自身的神經(jīng)干細胞修復(fù)是無法實現(xiàn)的。因此，采用外源性干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷成為目前治療的主要策略之一[8-11]。

目前干細胞移植修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞包括胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨髓基質(zhì)細胞、脂肪源神經(jīng)干細胞、骨髓源神經(jīng)干細胞等[12-13]。其中，胚胎干細胞及中樞來源的神經(jīng)干細胞雖在理論上有較高的評價，但用于異體移植時有較大的免疫排斥反應(yīng)，并且存在倫理上的限制，故其不適宜用于臨床。腦源性神經(jīng)干細胞直接從中樞神經(jīng)組織取材，其來源受限，擴增培養(yǎng)困難；胚胎干細胞來源于發(fā)育早期階段的胚胎，能分化成全身的所有組織細胞，是全能干細胞，但是由于倫理的限制和具有誘發(fā)同種異體免疫以及有致瘤性的可能性，目前尚無法臨床推廣應(yīng)用。相比而言，骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為移植修復(fù)治療用細胞則具顯著優(yōu)勢[12]。

骨髓基質(zhì)細胞是一種增殖能力較強的、存在于骨髓非造血組織中的多能干細胞，它來源豐富，取材簡單，培養(yǎng)增殖容易，并且自體移植沒有倫理爭議和免疫排斥的問題。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細胞移植治療研究中，骨髓基質(zhì)細胞已成為較理想的種子細胞來源之一[14]。目前分離純化骨髓基質(zhì)細胞的方法主要有以下四種：全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、熒光激活細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和磁珠分離法（magnetic-activated cell sorting，MACS）[15]。由于目前尚無BMSCs的特異性表面標(biāo)志物，F(xiàn)ACS及MACS方法的應(yīng)用十分局限。袁斌等[16]研究發(fā)現(xiàn)，采用密度梯度離心法分離出的BMSCs增殖速度顯著慢于全骨髓貼壁培養(yǎng)法。在本實驗的預(yù)實驗中，采用梯度離心法進行細胞，亦發(fā)現(xiàn)骨髓細胞的增殖顯著慢于全骨髓貼壁法，且采用梯度離心法分離出的骨髓細胞在培養(yǎng)過程中其形態(tài)不規(guī)則，細胞內(nèi)易出現(xiàn)空泡，分析原因，可能系梯度離心分離液對骨髓細胞的生物學(xué)活性有一定的抑制作用，故在本實驗中，采用了全骨髓貼壁培養(yǎng)法。實驗發(fā)現(xiàn)，若接種后24 h進行換液，部分骨髓基質(zhì)細胞貼壁不牢，經(jīng)換液時細胞量損失較大；若延期至72 h進行換液，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分減少，細胞培養(yǎng)基的酸度增大，細胞的活性會受到一定程度的抑制，因此，本實驗采用首次接種后48 h換液，換液時輕輕晃動培養(yǎng)瓶，并采用PBS緩沖液將未貼壁的雜細胞去除，然后多次傳代處理，骨髓基質(zhì)細胞形態(tài)逐漸變得均一，細胞形態(tài)以長梭形為主，體積較小、大小一致、增殖速度較快，經(jīng)多次傳代其細胞形態(tài)及增殖方式不會發(fā)生改變。

近年來研究表明，骨髓基質(zhì)細胞于體外通過誘導(dǎo)分化可獲得骨髓源性神經(jīng)干細胞[2]。無限增殖和自我更新能力是神經(jīng)干細胞的主要特征之一。本實驗發(fā)現(xiàn)，將Wistar大鼠骨髓基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)入含bFGF、EGF的無血清培養(yǎng)基中后，其生長方式發(fā)生改變，呈懸浮或半懸浮狀態(tài)，呈球狀聚集生長，從生長速度來看，其增殖速度相對較慢，呈現(xiàn)未分化的幼稚狀態(tài)。CD133和Nestin為目前公認的神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物，通過免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)呈球狀聚集生長的細胞球呈CD133和Nestin陽性。多向分化潛能是神經(jīng)干細胞的另一主要特征，其可分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等細胞。在本實驗中，將Wistar大鼠骨髓源細胞球轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)基中后，其生長方式再次發(fā)生改變，不再呈懸浮生長，而是再次轉(zhuǎn)為貼壁生長，單細胞及神經(jīng)球很快發(fā)生貼壁，貼壁后細胞不再呈圓形，而是伸出突起，呈梭形、多角形及不規(guī)則形等。分化7 d后，行免疫熒光細胞化學(xué)檢測，大部分細胞表達星形膠質(zhì)細胞表面標(biāo)志物GFAP，表達星形質(zhì)細胞表面標(biāo)志物GFAP、神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2和β-tubulin Ⅲ，少突膠質(zhì)細胞表面標(biāo)志物Galc。由此可見，成年Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)細胞球具多向分化能力，具備類似神經(jīng)干細胞的多向分化能力，可分化為星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細胞樣細胞。

綜上所述，采用含bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)法，可成功將成年Wistar大鼠骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)為骨髓源神經(jīng)干細胞，這為大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞的進一步研究提供了實驗基礎(chǔ)。

[1] Breunig J J，Haydar T F，Rakic P.Neural stem cells：historical perspective and future prospects[J].Neuron，2011，70（4）：614-625.

[2] Tang Y，Cui Y C，Wang X J，et al.Neural progenitor cells derived from adult bone marrow mesenchymal stem cells promote neuronal regeneration[J].Life Sci，2012，91（19-20）：951-958.

[3] Wang Y Z，Plane J M，Jiang P，et al.Concise review：quiescent and active states of endogenous adult neural stem cells：identification and characterization[J].Stem Cells，2011，29（6）：907-912.

[4] Reynolds B A，Weiss S.Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell[J].Dev Biol，1996，175（1）：1-13.

[5] Sathananthan A H.Neural stem cells in neurospheres，embryoid bodies，and central nervous system of human embryos[J].Microsc Microanal，2011，17（4）：520-527.

[6] Mothe A J，Tator C H.Review of transplantation of neural stem/progenitor cells for spinal cord injury[J].Int J Dev Neurosci，2013，31（7）：701-713.

[7] Neirinckx V，Coste C，Rogister B，et al.Concise review：adult mesenchymal stem cells，adult neural crest stem cells，and therapy of neurological pathologies： a state of play[J].Stem Cells Transl Med，2013，2（4）：284-296.

[8] Lu D，Li Y，Mahmood A，et al.Neural and marrow-derived stromal cell sphere transplantation in a rat model of traumatic brain injury[J].J Neurosurg，2002，97（4）：935-940.

[9] Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke，2001，32（4）：1005-1011.

[10] Weissman I L.Translating stem and progenitor cell biology to the clinic：barriers and opportunities[J].Science，2000，287（5457）：1442-1446.

[11] Volarevic V，Erceg S，Bhattacharya S S，et al.Stem cell-based therapy for spinal cord injury[J].Cell Transplant，2013，22（8）：1309-1323.

[12] Luo J，Zhang H T，Jiang X D，et al.Combination of bone marrow stromal cell transplantation with mobilization by granulocyte-colony stimulating factor promotes functional recovery after spinal cord transection[J].Acta Neurochir （Wien），2009，151（11）：1483-1492.

[13] Kim B G，Hwang D H，Lee S I，et al.Stem cell-based cell therapy for spinal cord injury[J].Cell Transplant，2007，16（4）：355-364.

[14] Chen C J，Ou Y C，Liao S L，et al.Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair[J].Exp Neurol，2007，204（1）：443-453.

[15]楊進.流式細胞儀工作原理及臨床應(yīng)用[J].醫(yī)療設(shè)備信息，2002，2（1）：15-29.

[16]袁斌，馬櫻，閆銘，等.大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的改良培養(yǎng)方法及Hoechst體外標(biāo)記研究[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（1）：61-63.