徐 海, 鮑 熹, 王義偉, 盧 宇, 許夢薇, 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院/國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇南京 210014）

轉(zhuǎn)運真核表達盒的重組T7噬菌體構(gòu)建

徐 海, 鮑 熹, 王義偉, 盧 宇, 許夢薇, 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院/國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇南京 210014）

為了構(gòu)建轉(zhuǎn)運真核表達盒的重組T7噬菌體,并分別在體外、體內(nèi)條件下檢測其標簽蛋白質(zhì)EGFP的表達。以T7噬菌體基因組左側(cè)578 bp處為插入位點,取上游400 bp和下游200 bp片段作為左右同源臂,并在其中插入表達EGFP基因的真核表達盒(EEB）,構(gòu)建同源重組質(zhì)粒pUC-L-EEB-R。將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化T7噬菌體宿主細菌BL21,在噬菌體繁殖過程中完成同源重組,PCR篩選重組T7-EEB噬菌體。提取該重組噬菌體基因組轉(zhuǎn)染Vero細胞后體外檢測EGFP蛋白質(zhì)表達,純化的噬菌體免疫小鼠后體內(nèi)檢測EGFP蛋白質(zhì)表達。結(jié)果顯示,通過同源重組方法成功構(gòu)建了攜帶真核表達盒的重組T7噬菌體,PCR檢測和酶切鑒定均證明表達盒已正確插入。T7-EEB基因組轉(zhuǎn)染真核細胞可見明顯的EGFP蛋白質(zhì)表達,免疫小鼠后活體熒光檢測到EGFP蛋白質(zhì)信號,在小鼠肝臟、脾臟組織中RT-PCR檢測到EGFP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。表明同源重組方法可以用于構(gòu)建重組T7噬菌體,噬菌體能夠轉(zhuǎn)運真核表達盒并實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達。

同源重組；DNA疫苗；真核表達；T7噬菌體

DNA疫苗是20世界90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗,是指將含有編碼靶抗原基因的質(zhì)粒載體導入宿主,通過宿主細胞表達抗原從而誘導機體產(chǎn)生免疫反應。該免疫途徑不僅能激發(fā)體液免疫反應,還能誘導高水平的細胞免疫,尤其是細胞毒性T淋巴細胞(CTL）反應,在疾病的防治中具有較大優(yōu)勢[1-2]。

DNA疫苗有多種免疫途徑：肌肉、皮內(nèi)、皮下及靜脈等注射,也可通過基因槍發(fā)送至細胞內(nèi)[3]。不同DNA導入方式會引起輔助性T淋巴細胞(Th）向不同方向極化,產(chǎn)生免疫應答的機制與效果不同[4-5]。這種差異除了DNA疫苗本身抗原的特異性以外,其主要原因是DNA疫苗給藥后,絕大多數(shù)的DNA在轉(zhuǎn)運到靶細胞前被機體的酶類降解失活,裸露質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)的效率低下,從而導致免疫效果不夠理想[6-7]。因此,提高DNA疫苗轉(zhuǎn)運至靶細胞的效率,是研制高效DNA疫苗的一個方向。目前,通過PLGA、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物等可生物降解材料包裹DNA疫苗來提高效率[8-9]。

T7噬菌體是感染腸桿菌的烈性噬菌體,其顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能耐受極端的理化環(huán)境,在體液環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)完整從而有效保護衣殼內(nèi)部的基因組不受損傷[10]。噬菌體顆粒的不對稱性有利于募集T細胞,使其被免疫細胞識別、吞噬、降解；該過程能夠有效地將噬菌體基因組直接轉(zhuǎn)運到免疫細胞內(nèi)部,是轉(zhuǎn)運DNA疫苗的優(yōu)良運輸工具。通過同源重組方法將真核表達盒插入到T7噬菌體基因組非編碼區(qū),使其隨噬菌體基因組復制而復制,構(gòu)建出遺傳穩(wěn)定的重組噬菌體。利用重組T7噬菌體作為真核表達盒的轉(zhuǎn)運工具,既能保護DNA不受酶類物質(zhì)的降解破壞,又能誘發(fā)細胞吞噬從而直接將DNA送入免疫細胞內(nèi)部提高抗原遞呈的靶向性。本研究在T7噬菌體基因組左側(cè)非編碼區(qū)插入表達EGFP標簽蛋白質(zhì)的真核表達盒,建立構(gòu)建轉(zhuǎn)運真核表達盒重組噬菌體的方法,并驗證EGFP蛋白質(zhì)的表達情況,為T7噬菌體用于DNA疫苗的轉(zhuǎn)運奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株與質(zhì)粒：T7 Select 415-1b Cloning Kit購于Merck公司；pUC-19、pEGFP-N1質(zhì)粒由國家獸用生物制品工程技術研究中心實驗室保存。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體2000為Invitrogen公司；其余試劑均為分析純。

主要儀器：超高速離心機購自美國Beck-man公司；BTX電轉(zhuǎn)化儀、PCR儀購自大連寶生物公司；Geldoc-It Imaging System購自美國UVP公司；熒光顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2 試驗小鼠

6周齡ICR小鼠購于南京醫(yī)科大學試驗動物中心,飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院實驗動物中心。

1.3 插入位點的選擇

利用DNAstar軟件比較T7 Select 415-1b與T7野生型噬菌體基因組,選擇缺失位點用于真核表達盒的插入。

1.4 同源重組質(zhì)粒載體構(gòu)建

以T7 Select 415-1b噬菌體基因組為模板,PCR擴增插入位點左側(cè)400 bp(L）和右側(cè)150 bp(R）基因片段作為同源臂,并將其插入pUC-19質(zhì)粒載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-L-R。以真核表達載體pEGFP-N1為模板,PCR擴增真核啟動子(Pcmv）、EGFP、polyA尾巴等元件并進行順序拼接成完整真核表達盒(Eukaryotic expression box,EEB）,將其插入重組質(zhì)粒pUC-L-R構(gòu)建同源重組質(zhì)粒載體pUC-LEEB-R,酶切鑒定正確的克隆送樣測序鑒定。

1.5 重組噬菌體構(gòu)建與鑒定

將同源重組質(zhì)粒pUC-L-EEB-R導入T7噬菌體宿主E.coliBL21,挑取單菌落重組BL21細菌,過夜培養(yǎng)。T7 Select 415-1b噬菌體稀釋至103PFU/ml,分別取10 μl T7噬菌體和BL21重組菌,加到1 ml LB培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)3 h。共培養(yǎng)液做10倍比稀釋,雙層瓊脂夾心法測定滴度,挑取單克隆噬菌體斑,用EGFP上、下游引物做菌落PCR鑒定,篩選陽性噬菌體斑即為同源重組噬菌體,命名為T7-EEB,提取重組噬菌體基因組酶切鑒定。

1.6 EGFP表達與鑒定

1.6.1 體外表達鑒定 將處于對數(shù)生長期的Vero細胞經(jīng)胰酶消化后用無抗生素含10%胎牛血清(FCS）的MEM培養(yǎng)液輕輕吹下,調(diào)整細胞密度到1 ml 1.0×106個,然后均勻分布于6孔細胞培養(yǎng)樣板,用不含抗生素的培養(yǎng)基調(diào)整體積到2 ml每孔,于二氧化碳培養(yǎng)箱37℃過夜培養(yǎng)。參照Invitrogen公司脂質(zhì)體2000操作說明,將提取的重組T7-EEB噬菌體基因組、同源重組質(zhì)粒載體pUC-L-EEB-R分別轉(zhuǎn)染Vero細胞,培養(yǎng)24 h后熒光顯微鏡觀察。

1.6.2 體內(nèi)表達鑒定 15只小鼠隨機分為3組,每組5只,即pUC-L-EEB-R質(zhì)粒免疫組、T7-EEB重組噬菌體免疫組和空白對照組。于0周免疫組小鼠左后腿肌肉注射鹽酸布比卡因50 μl(0.5 mg/ml）預處理,3 d后同部位注射pUC-L-EEB-R質(zhì)粒DNA 100 μl(1 μg/μl）和T7-EEB重組噬菌體顆粒100 μl(1×1011PFU/ml）；14 d后同等劑量加強免疫1次。分別于首免疫和二免后7 d經(jīng)活體成像系統(tǒng)(南京大學生命科學學院協(xié)助）檢測EGFP表達情況；并在二免后14 d處死小鼠,采集肝臟、脾臟提取總RNA,RT-PCR檢測EGFP基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果

2.1 插入位點及構(gòu)建流程

對比T7 Select 415 1b噬菌體與野生型T7噬菌體基因組,發(fā)現(xiàn)T7 Select 415 1b基因組有4個缺失位點,其中在左側(cè)578～579 bp有2 168 bp缺失,適合插入外源基因。選擇578 bp處作為插入位點,以同源重組的方式將真核表達盒導入,操作流程見圖1。

圖1 同源重組示意圖Fig.1 A schematic diagram of homologous recombinanation

2.2 同源重組質(zhì)粒鑒定

構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒載體pUC-L-EEB-R分別用左側(cè)同源臂5′端XhoⅠ和右側(cè)同源臂3′端BamHⅠ雙酶切鑒定,觀察到長度約2 200 bp的預期條帶,測序結(jié)果進一步證實所構(gòu)建的載體與設計一致。表明該同源重組質(zhì)粒載體pUC-L-EEB-R構(gòu)建成功(圖2）。

圖2 同源重組質(zhì)粒載體酶切鑒定Fig.2 Identification of homologous recombinant vector by enzyme digestion

2.3 重組噬菌體篩選與鑒定

挑取待鑒定噬菌斑,用針對EGFP基因的上下游引物做菌落PCR,5個噬菌斑擴增出3個720 bp目的條帶,初步篩選到插入真核表達盒的重組噬菌體T7-EEB(圖3）。擴繁T7-EEB重組噬菌體并提取基因組,以位于T7 Select 415 1b噬菌體基因組左側(cè)3 805位的SmiⅠ位點進行酶切鑒定。T7 Select 415 1b基因組酶切獲得3 800 bp目的條帶,而T7-EEB基因組酶切獲得5 000 bp目的條帶,條帶大小符合預期(圖4）。通過菌落PCR初步篩選到陽性重組噬菌體,酶切鑒定確定該重組噬菌體成功插入真核表達盒。

圖3 重組噬菌體PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant phage by PCR

2.4 T7-EEB噬菌體基因組體外表達

構(gòu)建的真核表達盒能夠在真核細胞中表達EGFP標簽蛋白質(zhì)(圖5）。同源重組質(zhì)粒pUC-L-EEB-R(圖5A）轉(zhuǎn)染效率較高,視野內(nèi)可見多個細胞表達；T7-EEB基因組(圖5B）分子量較大,轉(zhuǎn)染效率較為低下,僅單個細胞可見蛋白質(zhì)表達；細胞空白對照(圖5C）未見顯色,沒有蛋白質(zhì)表達。

圖4 噬菌體基因組酶切鑒定Fig.4 Identification of phage genome by enzyme digestion

2.5 T7-EEB介導體內(nèi)表達

首次免疫后7 d經(jīng)活體成像系統(tǒng)檢測EGFP蛋白質(zhì)表達情況,T7-EEB免疫小鼠能夠檢測到EGFP蛋白質(zhì)發(fā)射信號,而pUC-L-EEB-R免疫后未能檢測到信號(圖6A）；在二次免疫后7 d,T7-EEB和pUC-L-EEB-R免疫小鼠均能檢測到信號(圖6B）,空白對照均未檢測到信號(圖6A和圖6B）。說明T7-EEB免疫后EGFP蛋白質(zhì)的表達比pUCL-EEB-R免疫后更加迅速。

二次免疫后取小鼠肝臟、脾臟提取總RNA,RTPCR檢測編碼EGFP蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果(圖7）顯示,電泳條帶可見T7-EEB免疫組mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于pUC-L-EEB-R免疫組,空白對照未能擴增出目的條帶。

圖5 EGFP真核表達Fig.5 Eukaryotic expression of EGFP

圖6 免疫小鼠活體熒光檢測Fig.6 Fluorescence images of immunized mice

3 討論

圖7 mRNA轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測Fig.7 Detection of mRNA transcription by RT-PCR

T7噬菌體載體Novagen公司獨家產(chǎn)品,是一種烈性噬菌體,在胞漿內(nèi)組裝子代粒子,成熟的噬菌體通過細胞裂解而釋放。該T7噬菌體載體對比野生型T7噬菌體其基因組左側(cè)578 bp處有約2 000 bp缺失,理論上可用于插入外源基因而不影響T7噬菌體生物學性狀。本研究將攜帶真核表達盒的質(zhì)粒導入T7噬菌體宿主細菌BL21,在噬菌體繁殖時完整基因組與質(zhì)粒的同源重組,進而篩選出插入真核表達盒的重組噬菌體。T7噬菌體繁殖迅速,每個宿主細胞釋放約200個子代噬菌體粒子,本構(gòu)建方法沒有引入有效的篩選標記,如何提高篩選幾率決定該方法的可操作性。本研究中以極低的感染復數(shù)感染宿主細胞,增加T7噬菌體在宿主細菌中的循環(huán)次數(shù)進而提高同源重組幾率。重組T7噬菌體由于復制負擔增加,在平皿上表現(xiàn)出較小的噬斑形態(tài),挑選形態(tài)較小的噬斑進行菌落PCR鑒定能夠提高篩選陽性率。本研究從5個單噬斑中篩選到3個疑似陽性克隆,證明同源重組方法構(gòu)建重組噬菌體具有可行性。

利用完整噬菌體粒子作為真核表達盒的轉(zhuǎn)運載體是一個比較新的途徑。在這個過程中,克隆到噬菌體基因組中的真核表達盒攜帶保護性抗原基因,以完整的噬菌體粒子免疫動物,在噬菌體被免疫細胞吞噬、裂解后釋放出的真核表達盒利用宿主細胞表達元件啟動保護性抗原的表達。Clark等[11-13]用包含乙肝表面抗原表達盒的完整的λ噬菌體顆粒免疫動物發(fā)現(xiàn)其免疫保護效果是裸露的核酸疫苗的10倍左右。噬菌體轉(zhuǎn)運真核表達盒與傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA疫苗傳遞系統(tǒng)相比在對核酸酶的穩(wěn)定性方面有明顯優(yōu)勢；而且噬菌體顆粒被免疫細胞吞噬,抗原遞呈效率更高。本研究中,基因組的體外瞬時轉(zhuǎn)染證明噬菌體攜帶的真核表達盒可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達,由于T7-EEB基因組分子量遠大于pUC-LEEBR,其轉(zhuǎn)染效率較低所表達的EGFP蛋白量也相對較少。相反,T7-EEB免疫組相比pUC-L-EEB-R免疫組,其EGFP表達更為迅速、表達量更高,間接說明噬菌體顆粒轉(zhuǎn)運真核表達盒作為DNA疫苗免疫的新途徑效率更高效果更好。

噬菌體進入體內(nèi)會很快被循環(huán)系統(tǒng)清除,但是在脾臟可以檢測到存活的噬菌體,其存活周期可以達到14～21 d[14]。在噬菌體治療過程中,兔子口服噬菌體后血漿中能檢測到活性噬菌體,并且能夠檢測到針對噬菌體衣殼蛋白質(zhì)的特異性體液免疫反應[15]。本研究中所用T7噬菌體衣殼蛋白質(zhì)p10B還可以用于外源多肽的表面展示,可在其表面展示抗原表位激發(fā)體液免疫反應,而基因組中嵌合的真核表達盒可以表達蛋白質(zhì)激發(fā)細胞免疫反應,可以進一步升級該系統(tǒng)達到體液、細胞免疫的雙重激發(fā)。因此,基于該理念開發(fā)噬菌體疫苗并且可以通過口服途徑進行免疫,將會是一種具有良好前景的疫苗研發(fā)策略。

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(責任編輯：袁 偉）

Construction ofrecombinantbacteriophageT7deliveringeukaryotic expression box

XU Hai, BAO Xi, WANG Yi-wei, LU Yu, XU Meng-wei, HOU Ji-bo

(Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/National Veterinary Biological Medicine Engineering Research Center,Nanjing 210014,China）

To construct a recombinant T7 phage delivering eukaryotic expression box and to detect the EGFP(enhanced green fluorecent protein）tag protein expressionin vivoandin vitro,respectively,a 400-bp fragment(L）located at the upstream of 578 bp of T7 genome and a 200-bp fragment(R）located at the downstream were used as homologous arms. Eukaryotic expression box encoding EGFP protein(EEB）was inserted into left and right arm to construct homologous recombinant plasmid vector pUC-L-EEB-R.Plasmid vector was transformed into bacterium BL21 where homologous recombinant took place during the T7 phage propagation.EGFP protein expression was identified by phage genome transfection and phage particle immunization.PCR and restriction enzyme digestion analysis demonstrated that eukaryotic expression box was inserted into T7 phage genome correctly.Visible EGFP protein expression was detected bothin vivoandin vitro.In mice liver and spleen,mRNA transcription ofEGFPgene was detected by RT-PCR as well.These results indicate that homologous recombinanation is capable to construct recombinant T7 phage which could deliver eukaryotic expression box and achieve protein expression.

homologous recombination；DNA vaccine；eukaryotic expression；T7 phage

Q939.48

A

1000-4440(2015）01-0117-05

徐 海,鮑 熹,王義偉,等.轉(zhuǎn)運真核表達盒的重組T7噬菌體構(gòu)建[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2015,31(1）：117-121.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.018

2014-08-07

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX(11）4073]

徐 海(1982-）,男,江蘇揚州人,碩士研究生,主要從事預防獸醫(yī)學方面的研究。(Tel） 13645161013；(E-mail）hai_x @126.com

侯繼波,(E-mail）houjibo@jaas.ac.cn