昝樹婷，楊如意，李 靜，蘇楠楠，周 剛

（安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖241003）

百菌清對(duì)土壤微生物特性和水稻生物量的影響

昝樹婷，楊如意，李 靜，蘇楠楠，周 剛

（安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖241003）

農(nóng)藥是集約化農(nóng)業(yè)保證農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量的重要因素之一，但不合理的施用方法會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、土壤結(jié)構(gòu)破壞和土壤微生物特性改變等一系列問題。許多研究發(fā)現(xiàn)，百菌清對(duì)作物和土壤微生物具有一定的毒害和抑制作用。通過溫室試驗(yàn)探討了百菌清不同施用量對(duì)土壤微生物生物量、呼吸強(qiáng)度、代謝熵和脫氫酶活性的影響，并測(cè)定了水稻生物量。結(jié)果表明，雖然微生物數(shù)量沒有明顯變化，但其活力受到顯著抑制，且施用劑量越高抑制越明顯。試驗(yàn)后期脫氫酶活性逐漸增加，但仍然低于對(duì)照。雖然，百菌清沒有造成水稻生物量下降，但由于研究屬于短期試驗(yàn)，且只施用了1次百菌清，因此其環(huán)境生態(tài)學(xué)影響有可能被低估。

百菌清；基礎(chǔ)呼吸；微生物生物量

農(nóng)藥是殺滅和控制農(nóng)業(yè)病原生物，促進(jìn)作物增產(chǎn)的重要保障，是維持集約化農(nóng)業(yè)的重要因素之一。但是，過量或不合理的施用易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、土壤結(jié)構(gòu)破壞、土壤肥力下降、微生物活性抑制，甚至威脅人類生命安全等一系列環(huán)境、生態(tài)和健康問題。百菌清（chlorothalonil）是一種非內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，對(duì)水稻、玉米、豆類等大宗農(nóng)作物和林業(yè)真菌病害具有良好的防治效果。目前，國內(nèi)外對(duì)百菌清在土壤、水體、作物表面的積累、遷移、轉(zhuǎn)化、降解等環(huán)境行為已有大量報(bào)道［1-3］。而且有研究發(fā)現(xiàn)，百菌清會(huì)造成水稻等作物的氧化脅迫，對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量有一定的抑制作用［4］。作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，微生物在土壤物質(zhì)循環(huán)、有毒物質(zhì)降解、作物生長(zhǎng)等重要的生態(tài)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵功能，微生物特性也可以敏感地指示氣候和土壤環(huán)境的變化，反映土壤質(zhì)量和健康狀況。因此，也可以通過微生物特性的變化衡量和評(píng)價(jià)農(nóng)藥的生態(tài)安全性。農(nóng)藥施用過程中有很大一部分最終進(jìn)入土壤，因此可能會(huì)改變微生物群落的組成和功能。William和Turco發(fā)現(xiàn)，百菌清并沒有對(duì)土壤中的細(xì)菌和真菌群落造成明顯影響，兩類微生物的優(yōu)勢(shì)物種幾乎沒有發(fā)生變化［5］。但也有研究表明，施用百菌清對(duì)反硝化細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌等非目標(biāo)微生物的數(shù)量和活性造成顯著抑制，減少了N2O和CH4的排放［6］。

有大量研究探討了百菌清對(duì)土壤中各種微生物特性的影響，但施用劑量多數(shù)是根據(jù)試驗(yàn)用土的重量進(jìn)行設(shè)計(jì)，且百菌清與土壤直接混勻處理，忽略了在實(shí)際應(yīng)用中多采用表面噴施的事實(shí)。而農(nóng)藥的施用方法與使用頻率是決定其殺菌效力和環(huán)境生態(tài)學(xué)特征的重要因素。本研究按照建議劑量將百菌清配制成溶劑進(jìn)行施用，設(shè)置了3個(gè)濃度水平，探討了百菌清不同施用劑量對(duì)土壤微生物特性和水稻生物量的影響，從而為指導(dǎo)百菌清的合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用土

試驗(yàn)所用土壤取自蕪湖市弋江區(qū)一處水稻田（31° 17′N,118°23′E），該處稻田至少已有20年未施用百菌清。該區(qū)域?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)性氣候，年均氣溫15～16℃，年均降水量約1200mm。土壤為沖積壤土（相當(dāng)于美國農(nóng)業(yè)部土壤分類系統(tǒng)中的Fluvents）。將0～15 cm的表層土帶回實(shí)驗(yàn)室，去除植物殘根和石塊并混合均勻，取少量土壤風(fēng)干并過2mm土篩，用于土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定。土壤質(zhì)地采用“吸管法”測(cè)定，pH采用KCl飽和溶液（2.5∶1水土水，v/m）浸提，玻璃電極法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用K2Cr2O7容量法（稀釋熱法）測(cè)定；總磷和速效磷分別采用HClO4-H2SO4和NaHCO3浸提，鉬銻抗分光光度法測(cè)定；總氮采用半微量開氏法，有效氮采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；總鉀、總銅、總鎘、總鉛分別采用NaOH熔融，HNO3-H2SO4-HClO4熔融火焰原子吸收分光光度法（FAAS）測(cè)定［7］。土壤主要理化性質(zhì)見表1。剩余土壤室溫下放置1周后，用于后續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 盆栽試驗(yàn)

每個(gè)盆缽（直徑22 cm，高19 cm）內(nèi)裝入3.0 kg混勻的土壤。水稻（Oryza sativa L.）種子經(jīng)0.5%的NaC-lO表面消毒10m in后用滅菌的蒸餾水沖洗2次，并置于25℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。每盆播種10粒種子，待幼苗萌發(fā)后再間苗至5株。本試驗(yàn)所用的百菌清為75%的可濕性粉劑（廣東省惠州中迅化工有限公司）。盆栽試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)濃度水平，在水稻生長(zhǎng)1個(gè)月后一次性施加。低濃度百菌清處理為常規(guī)用量，即噴施100m L的600倍液，高濃度處理為等體積的300倍液，對(duì)照施加100m L無菌水，每個(gè)處理均設(shè)4次重復(fù)。土壤持水量通過每天澆水保持在田間持水量的75%。溫室中的氣溫保持在18～32℃，光照為自然光，盆缽的位置每2周調(diào)換1次，減少因溫室中光照、氣溫等條件差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的干擾。

表1 試驗(yàn)用土基本理化性質(zhì)Table1 The physiochemicalpropertiesof the soil

水稻生長(zhǎng)2個(gè)月后進(jìn)行取樣。每盆取根際土300 g，其中250 g用以測(cè)定土壤微生物特性，另外50 g 105℃烘干至恒重用以測(cè)定土壤含水量，所有測(cè)定值均換算成干土的重量。水稻根部用自來水沖洗干凈，并將全株分成地上、地下2個(gè)部分，105℃殺青30min，65℃烘干至恒重測(cè)定生物量。

1.3 土壤微生物生物量（microbial biomass carbon, MBC）測(cè)定

MBC采用氯仿熏蒸法（chloroform fumigationextractionmethod）測(cè)定［8］。稱取相當(dāng)于10 g干土的新鮮土壤，加入40m L 0.5mol/L的K2SO4溶液，振蕩30 m in后通過0.45μm的微孔濾膜進(jìn)行真空抽濾。另取同質(zhì)量的新鮮土壤一份，真空干燥器內(nèi)用氯仿熏蒸48 h，同樣采用上述方法進(jìn)行提取。提取液中的總有機(jī)碳（total organic carbon,TOC）通過總有機(jī)碳分析儀（TOC-Vwp,Shimadzu Scientific,Japan）測(cè)定。按照下列公式計(jì)算MBC值［9］：

其中EC為氯仿熏蒸土壤與未熏蒸土壤的TOC差值，Kec為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取0.45，W為土壤干重。

1.4 土壤基礎(chǔ)呼吸速率（soilbasal respiration,SBR）測(cè)定

對(duì)堿液吸收法稍加修改以測(cè)定SBR［10］。具體操作是，取100 g新鮮土于密閉容器（直徑9.5 cm，高12.5 cm）中25°C黑暗中培養(yǎng)24 h。容器中放一個(gè)2 cm高的支架，一個(gè)裝有20m L濃度為0.1mol/LNaOH溶液的小燒杯置于支架上。土壤呼吸產(chǎn)生的CO2被NaOH吸收，并通過1mol/L的BaCl2進(jìn)行沉淀。多余的堿以酚酞為指示劑，用0.1mol/L的HCl進(jìn)行滴定?？瞻讓?duì)照采用同樣的裝置，但不添加土壤。土壤呼吸速率根據(jù)24 h培養(yǎng)過程中微生物釋放的CO2進(jìn)行定量測(cè)定，單位為μg CO2-C/g·h。微生物代謝熵（qCO2）通過SBR除以MBC進(jìn)行計(jì)算。

1.5土壤脫氫酶活性（dehydrogenaseactivity,DHA）測(cè)定

采用改進(jìn)的比色法測(cè)定脫氫酶活性。以水溶性的無色氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC）作為人工電子受體，TTC還原后生成紅色的三苯基甲臜（triphenylformazan,TPF），其紅色越深表明脫氫酶的活性越強(qiáng)［11］。用0.5mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH值7.6）配制0.5%的TTC，與5 g新鮮土充分混勻，37℃下保溫24 h。保溫結(jié)束后向離心管中加入10m L的甲苯，在150 r/m in的速度下振蕩提取1 h。提取液通過濾紙進(jìn)行過濾，TPF的濃度在485 nm波長(zhǎng)下通過分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定（UV757CRT,上海精密科學(xué)儀器有限公司）。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)以Na2S作為還原劑。

1.6數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用IBM SPSSV.20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（SPSS,Inc.,Chicago,IL）進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)，然后進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。不同處理的均值進(jìn)行LSD多重比較，所有分析均在5%的顯著性水平上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物生物量碳

如圖1所示，本試驗(yàn)3個(gè)處理土壤中的MBC含量在2.19～2.62mg/kg之間。無論低劑量還是高劑量處理組均未對(duì)MBC造成顯著影響。施用百菌清甚至對(duì)MBC有一定刺激作用，且隨著濃度的增加刺激作用更加明顯，處理組分別比對(duì)照增加了5.94%和19.64%。

2.2土壤呼吸和代謝熵

施用百菌清對(duì)土壤呼吸造成了非常顯著的抑制（圖2a,F=21.79,df=2,P＜0.01），且濃度越大抑制程度越高，低劑量和高劑量組的呼吸速率分別下降了31.58%和45.26%，但兩個(gè)處理組之間沒有顯著差異。

代謝熵與基礎(chǔ)呼吸的變化規(guī)律相似，施用百菌清使單位時(shí)間內(nèi)單位重量的土壤微生物產(chǎn)生的CO2顯著下降（圖2b,F=17.99,df=2,P＜0.01）。隨著施用量的增加抑制程度越明顯，但處理組之間沒有顯著差異。

2.3 脫氫酶活性

圖1 施加百菌清對(duì)土壤微生物生物量碳的影響Fig 1 Theeffectsof chlorothalonilapplication on soilmicrobialbiomassC

圖2 施加百菌清對(duì)土壤呼吸和代謝熵的影響Fig 2 Theeffectsof chlorothalonilapplication on soilbasal respiration andmetabolic quotient

如圖3所示，第4周百菌清處理后立即測(cè)定脫氫酶，其活性有所下降，但不明顯。對(duì)照土壤中的脫氫酶活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，并逐漸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。1周后，處理組的脫氫酶活性與對(duì)照相比均顯著降低，下降程度分別達(dá)60.26%和75.72%，且兩個(gè)處理組之間也有明顯區(qū)別。隨后，處理組脫氫酶活性逐漸上升，低劑量組酶活性恢復(fù)的速度要快于高劑量組，但均仍然顯著低于對(duì)照，且施用劑量對(duì)酶活性的影響一直十分明顯。

2.4 水稻生物量

施用百菌清使水稻總生物量有所增加，但未達(dá)到顯著水平；從地上和地下部分的生物量來看，除低劑量處理使水稻地下部分生物量下降外，處理組生物量均有所增加，但同樣未達(dá)到顯著水平。

3 討論與結(jié)論

3.1百菌清對(duì)土壤微生物的影響

圖3 施加百菌清對(duì)脫氫酶活性的影響Fig 3 Theeffectsof chlorothalonilapplication on dehydrogenaseactivity

圖4 施加百菌清對(duì)水稻生物量的影響Fig 4 Theeffectsof chlorothalonilapplication on thebiomass of Oryza sativa L.

導(dǎo)致農(nóng)業(yè)病原生物的耐藥性增加、污染環(huán)境，以及對(duì)非目標(biāo)生物的危害是限制農(nóng)藥使用的重要原因。百菌清是一種廣譜的殺真菌劑，但很多研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)細(xì)菌、放線菌有十分明顯的抑制作用［6,12］，對(duì)真菌的影響反而不明顯［13］。因此，施用百菌清可能會(huì)改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，但并不一定會(huì)影響到群落中的優(yōu)勢(shì)種群［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是低濃度還是高濃度處理，單次施用百菌清不會(huì)顯著降低微生物數(shù)量，反而會(huì)有一定程度的刺激作用。但表征微生物活性的呼吸強(qiáng)度、代謝熵、脫氫酶活性等均出現(xiàn)顯著下降，且濃度越高抑制作用越明顯。Wu等也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，且隨著施用濃度和頻次的增加，百菌清在土壤中持續(xù)的時(shí)間也會(huì)顯著增加，對(duì)微生物活力的抑制趨于增強(qiáng)［14］。雖然，在呼吸速率和代謝熵兩項(xiàng)指標(biāo)上本研究并未發(fā)現(xiàn)高劑量組與低劑量組之間有顯著差異，但是百菌清濃度增加肯定會(huì)延緩其在土壤中的降解，增強(qiáng)對(duì)微生物的毒害水平。因此，合理確定農(nóng)藥使用劑量對(duì)維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生態(tài)功能仍然十分重要。

很多研究也證實(shí)，百菌清會(huì)明顯抑制多種土壤酶的活力［13-14］，這在本研究中也有所體現(xiàn)。脫氫酶是所有酶中種類最多的一類，許多研究將其作為土壤酶活性的典型代表。本研究中，脫氫酶活性的抑制在施用后一周內(nèi)表現(xiàn)最為明顯，隨后逐漸提高，但在整個(gè)研究期限內(nèi)都沒有恢復(fù)到對(duì)照的水平。而且，兩種濃度之間有顯著區(qū)別，高劑量處理的恢復(fù)速度也相對(duì)較慢，這可能跟百菌清濃度高導(dǎo)致在土壤降解較慢，殘存時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)。目前，國內(nèi)外均有不少人在研究通過篩選、馴化或基因工程培育的特殊微生物加速百菌清的降解［15-16］。

3.2 百菌清對(duì)水稻的影響

目前，研究重心主要是農(nóng)藥在環(huán)境中的行為及其微生物效應(yīng)，關(guān)于農(nóng)藥對(duì)作物生理、生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)影響的相關(guān)研究較少。雖然有研究報(bào)道，百菌清對(duì)水稻有毒害作用，造成生物量下降［4］，但本研究未發(fā)現(xiàn)施用百菌清對(duì)水稻生物量產(chǎn)生抑制，甚至還有一定的刺激作用，但這并不能說明百菌清對(duì)水稻的生長(zhǎng)沒有影響。農(nóng)藥造成的氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化作用可能會(huì)引起作物DNA加合物的產(chǎn)生，對(duì)基因表達(dá)造成明顯影響［17］。研究表明，百菌清會(huì)引起番茄細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等基因的轉(zhuǎn)錄量增加，但編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和谷胱甘肽還原酶基因產(chǎn)生沉默［18］，從而不能減緩氧化脅迫作用。水稻的生物量可能取決于百菌清所引起的3個(gè)方面變化的總體平衡。首先，由于病原生物被殺滅本身會(huì)對(duì)水稻的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用；其次，百菌清在生理上確實(shí)會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)生一定的毒害作用，造成氧化脅迫；最后，對(duì)非目標(biāo)微生物的影響也會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)生一定的正或負(fù)的反饋?zhàn)饔?。如張旭紅等發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizal fungi,AMF）可以減弱百菌清對(duì)水稻的毒害作用，但百菌清明顯抑制AMF對(duì)水稻根系的侵染。以上3方面的總效應(yīng)最終決定了百菌清對(duì)水稻的影響類型。

本研究測(cè)定了不同施用劑量下百菌清對(duì)土壤微生物特性的影響，結(jié)果表明微生物數(shù)量的變化不大，但活性明顯受到抑制，尤其是脫氫酶。雖然水稻生物量并未降低，但并不表示水稻沒有受到百菌清的氧化脅迫。由于本研究試驗(yàn)周期較短，且只施用了1次百菌清，因此有可能會(huì)低估百菌清對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的實(shí)際影響。

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Effectsof chlorothalonilapp lication on soilm icrobial propertiesand biomassof Oryza sativa L.

ZAN Shu-ting,YANG Ru-yi,LIJing,SU Nan-nan,ZHOU Gang
(Collegeof EnvironmentalScienceand Engineering,AnhuiNormalUniversity,Wuhu 241003,China)

Pesticides are essential to ensure the production of intensive agriculture,however,inappropriate use can result in severe consequences including pesticide residue,deconstruction of soil texture and changes ofm icrobial properties.Many studies found that chlorothalonil showed adverse effectson crops and soilm icrobes.We conducted a greenhouse experiment to investigate the effectsof different chlorothalonil dosages on m icrobial biomass carbon(MBC),basal respiration,metabolic quotient,dehydrogenase activity (DHA)and biomass of Oryza sativa L.The results indicated that chlorothalonil did not reduce MBC butshowed a dosage dependent suppression onm icrobialmetabolic activities.DHA tended to increase over time butstill lower than the control.A lthough,chlorothalonildid notdecrease the biomass of O.sativa but its environmentaland ecologicaleffects should notbe underestimated as thiswas a short-term experimentw ith one-time application.

chlorothalonil;basal respiration;m icrobialbiomass carbon

Q89;X171.5

A

2095－1736（2015）03－0042－04

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.042

2014-10-20；

2014-11-07

國家自然科學(xué)基金資助（41001368）

昝樹婷，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槲廴旧鷳B(tài)學(xué)及環(huán)境修復(fù)，E-mail:shuting@mail.ahnu.edu.cn；

楊如意，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲廴旧鷳B(tài)學(xué)，E-mail:yangruyi@mail.ahnu.edu.cn。