李士偉，關 鋒，李 想

（1.江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122 2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122 3.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇無錫214122）

鐵過載引發(fā)人肝細胞HH4 N-糖鏈表達差異研究

李士偉1,2，關 鋒1,2，李 想3

（1.江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122 2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122 3.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇無錫214122）

肝臟鐵過載是血液系統(tǒng)疾病患者進行骨髓移植后的典型并發(fā)癥之一，長期鐵過載可引發(fā)肝臟細胞凋亡和器官損壞，然而鐵過載的分子調控機理迄今仍不清楚。以培養(yǎng)的枸櫞酸鐵銨過載人肝細胞HH4和正常人肝細胞HH4為研究對象，細胞裂解提取總蛋白，分子篩超濾管分離獲得總糖肽，PNGase F酶解釋放出N-糖鏈，Sepharose 4B除鹽純化N-糖鏈，再利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術比較N-糖鏈變化情況。同時，采用熒光細胞凝集素免疫組化方法驗證糖鏈分析結果。結果在鐵過載人肝細胞和正常細胞中均檢測到16種N-糖鏈，但糖鏈豐度存在明顯差異。與正常人肝細胞相比，鐵過載人肝細胞中高甘露糖型糖鏈的含量降低，而雜合型、復雜型、平分型、巖藻糖化和唾液酸化糖鏈的含量明顯升高。凝集素免疫組化結果顯示鐵過載后細胞對凝集素ConA的親和作用減弱，而對PHA-E、AAL、LCA和MAL-II的親和作用增強，與糖鏈質譜分析結果相一致。研究為進一步探索人肝細胞鐵過載模式下N-糖鏈表達差異的分子機理提供了技術支持。

鐵過載；人肝細胞HH4；MALDI-TOF/TOF-MS；N-糖鏈；凝集素免疫組化

骨髓移植是當前臨床根治急慢性白血病、嚴重型再生不良性貧血、地中海性貧血、淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤等惡性疾患的主要手段［1］，然而越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)骨髓移植后，病人的肝臟出現(xiàn)典型的鐵過載癥狀進而引發(fā)肝損傷［2-3］。早在2000年，國際上已經開始關注和研究作為骨髓移植并發(fā)癥存在的肝臟鐵過載現(xiàn)象，但是迄今肝臟鐵過載的具體分子調控機理仍不清楚。

鑒于先前肝臟鐵過載研究大多集中于基因組學和蛋白質組學方面，本實驗擬利用MALDI-TOF/TOF-MS技術從糖組學角度觀察鐵過載中糖鏈表達的狀態(tài)。糖組學的主要研究對象為糖鏈，通常生物體在內質網中將糖鏈附加到蛋白質或脂質上以形成功能性糖綴合物，這個過程稱之為糖基化。其中，蛋白質的糖基化作用是最普遍和最主要的蛋白質翻譯后加工方式之一，蛋白質的糖基化有助于肽鏈的正確折疊，保護蛋白質免受水解以及影響蛋白質的正確投送和定位［4-5］。研究表明真核生物中約50%以上的蛋白質是被糖基化的，而在人類蛋白質中更高達70%［6］。生物體內糖基化修飾根據(jù)寡糖鏈與蛋白質連接方式的不同主要分為4種：N-連接糖鏈，O-連接糖鏈，糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨和糖胺聚糖［7］。哺乳動物中的糖鏈主要存在于多種膜蛋白、酶、激素、生長因子、抗體和免疫球蛋白中，因此糖鏈可以參與調節(jié)細胞的許多重要功能，如分子及細胞間的相互識別，胞內或胞外信號傳導，免疫應答以及炎癥發(fā)生等［8］。

當前糖組學研究主要利用高相液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）、核磁共振（NMR）以及生物質譜技術對糖鏈進行定性定量分析和結果解析。而生物質譜中的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF-MS)更是因其具有靈敏快捷、圖譜解析簡單、質量檢測上限高、對雜質的包容性強、無需預分離混合物和可分析fmol至pmol范圍內的糖鏈結構等優(yōu)點，被廣泛應用于糖類物質的結構分析中。此外，凝集素作為一類源于各種植物、無脊椎動物和高等動物的糖結合蛋白具有能特異性識別特定糖鏈結構的性質，而以熒光標記凝集素作為探針分子的凝集素組織化學技術能夠直觀顯示細胞中糖蛋白糖鏈結構的差異變化，已被廣泛應用于不同組織或細胞糖綴合物研究。

本研究以枸櫞酸鐵銨（FAC）過載前后的人肝細胞HH4為研究對象，利用MALDI-TOF/TOF-MS技術和凝集素組織化學技術比較分析N-糖鏈譜的變化差異，擬為糖組學水平以及糖蛋白質組學水平上深入研究肝細胞鐵過載的分子機制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

非轉化人肝細胞株HH4獲贈于美國西雅圖Fred-Hutchinson Cancer Research Center(FHCRC)Joachim Deeg教授實驗室。Williams'medium E培養(yǎng)基、HEPES(20mmol/L)和丙酮酸鈉(1mmol/L)購于Gibco公司；胎牛血清和青霉素溶液購于Life Technologies公司；地塞米松(0.04μg/m L)和慶大霉素(50μg/m L)購于美國 Sigma-Aldrich公司；ITS（Insulin-transferrinselenium）購于美國BD公司；

苯甲基磺酰氟（PMSF）和抑肽酶購自Thermo Scientific公司；T-PER組織總蛋白抽提試劑購于美國Thermo公司；BCA蛋白檢測試劑盒和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液購自碧云天生物技術研究所；離心超濾管Am icon Ultra-0.5 10 kD購于美國M illipore公司；檸檬酸鐵銨（FAC）、瓊脂糖凝膠Sepharose 4B、尿素（UREA）、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）、正丁醇、乙醇和2,5-二羥基苯酸乙酯(DHB)購于美國Sigma-Aldrich公司；PNGase F酶購自美國New England Biolabs公司；Sephadax G-25（葡聚糖凝膠柱）購自Amersham Pharmacia Biotech公司；氨基反應性Cyanine3 NHS ester(花青素3-N-羥基琥珀酰亞胺酯)購于Lumiprobe公司；凝集素ConA、PHA-E、AAL、LCA和MAL-II購自Vector公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

HH4細胞在含10%胎牛血清（FBS）、0.1%ITS、0.04μg/m L地塞米松、50μg/m L慶大霉素、20mmol/L的HEPES和1mmol/L的丙酮酸鈉的Williams培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.2.2細胞總蛋白的提取

0、5和10mmol/L枸櫞酸鐵銨分別處理HH4細胞24 h后，胰酶消化收集細胞。冷1×PBS洗細胞3次，加入適量T-PER組織蛋白裂解液、PMSF（工作濃度1%）和抑肽酶（工作濃度1‰）冰浴30min，12000 r/min離心15min，取上清利用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.3 N-糖鏈的釋放

取2mg細胞總蛋白加入到10 kD離心超濾管中13800 r/min離心5m in濃縮。加入8M尿素（8M高濃度尿素使蛋白質變性溶解）、10mM的DTT溶液和20 mM的IAM溶液使蛋白質變性溶解。棄流出液。加入PNGaseF酶解緩沖液，37℃酶解反應12 h。收集樣品冷凍干燥，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 N-糖鏈的除鹽純化

取適量Sephrose4B至微量離心管中，向離心管中加入1∶1的甲醇∶水溶液和5∶1∶1的正丁醇∶甲醇∶水溶液（體積分數(shù)）離心清洗Sephrose 4B。加入500μL的5∶1∶1的正丁醇∶甲醇∶水溶液溶解凍干的糖鏈樣品，上樣至Sephrose 4B中，25℃振蕩反應45m in。5∶1∶1的正丁醇∶甲醇∶水溶液清洗3次后，采用1∶1的甲醇∶水溶液洗脫糖鏈，收集洗脫液冷凍干燥。

1.2.5糖鏈的質譜分析

應用 Bruker Daltonics公司的 UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF-MS解析糖蛋白的N-連接糖鏈。加入5μL的1:1的甲醇：水溶液溶解凍干糖鏈樣品，取2μL糖鏈溶液點樣于MTPAnchorchip 384點的靶板上。晾干后，再加1μL的20mg/m L的基質DHB至樣品板上。以反射陽性離子模式鑒定多糖。一級質譜參數(shù)如下:離子源1，7.50 kV；離子源2，6.75 kV；反射電壓1，29.5 kV；反射電壓2，13.95 kV；LIFT 1，19 kV；LIFT 2，3.7 kV。激發(fā)光源為N2激光（337 nm），分子量檢測范圍為700～4000。用多肽校正混合物作為外標校正質譜儀。檢測時每個樣品在多點采集圖譜，每個圖譜掃描1500次，最后將所有譜圖疊加得到最后的多糖一級圖譜。從一級圖譜中選擇信噪比大于6的質譜峰進行二級質譜分析。

通過軟件FlexAnalysis v3獲得糖鏈質譜圖和原始數(shù)據(jù)。利用軟件Glycoworkbench 2分析并獲得可能性最高的糖鏈結構。

1.2.6熒光細胞凝集素免疫組化

用1μL Cy3（10μg/μL）對應200μg凝集素，在Na2CO3溶液中反應3 h，用Sephadax G-25分離收集標記后的凝集素。將HH4細胞接種于裝有滅菌蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)，待細胞融合約70%時，用0、5和10 mmol/L枸櫞酸鐵銨分別處理HH4細胞24 h。PBS漂洗后，2%多聚甲醛固定15min。再用PBS振蕩漂洗3次。0.2%Triton X-100溶液通透細胞10m in，PBS漂洗3次，5%BSA溶液4℃封閉過夜。每孔分別加入Cy3標記凝集素室溫避光振蕩孵育3 h，PBS振蕩清洗3次。0.5μg/m LDAPI室溫下避光染色15m in，PBS振蕩清洗3次。將蓋玻片倒扣在滴有Glycergel固定劑的載玻片上，利用激光共聚焦顯微鏡（Nikon Eclipse E600）對細胞樣本進行掃描和分析。

2 結果與分析

2.1 HH4細胞鐵過載前后N-糖鏈的質譜分析

本研究借助Am icon Ultra-0.5 10 kD濾膜的分子篩效應對HH4胞內糖鏈進行釋放和分離，使用親水樹脂Sepharose 4B對分離的糖鏈除鹽純化，通過UltrafleXtremeMALDI-TOF/TOF-MS獲得HH4細胞鐵過載前后N-糖鏈的指紋圖譜，最后利用軟件GlycoWorkbench對信噪比高于6的糖鏈質譜峰進行結構信息注釋（圖1）。在此之上，本實驗又對各分子量的糖鏈進行了二級質譜解析，圖2所示為2個隨機挑選的N-糖鏈二級質譜峰圖，分別為m/z 1743.695的高甘露糖型N-糖鏈和m/z 2174.901的巖藻糖化修飾的N-糖鏈。從正常肝細胞HH4和鐵過載肝細胞HH4 N-糖鏈一級質譜圖中可以看出N-連接糖鏈結構主要分布在1200～2600之間，且各實驗組糖鏈指紋圖譜非常相似。結合二級質譜分析結果，確定正常肝細胞HH4和鐵過載肝細胞HH4含有16個相對不同強度的糖鏈結構，各N-糖鏈質譜數(shù)據(jù)以及結構信息如表1所示。為分析正常肝細胞HH4和鐵過載肝細胞HH4N-糖鏈的表達，根據(jù)糖鏈分子量大小、天線的數(shù)目和糖殘基的豐度對N-糖鏈進行了分類比較。如表2所示，本實驗將表1中HH4細胞N-糖鏈分類成高甘露糖型、雜合型、復雜型（包括二天線型、三天線型和四天線型）、平分型、巖藻糖化和唾液酸化，然后分別累加每個實驗組各類型糖鏈的相對強度值并計算各類型糖鏈在對應實驗組中所占比重。結果表明，與正常人肝細胞相比，5mM枸櫞酸鐵銨處理肝細胞和10mM枸櫞酸鐵銨處理肝細胞高甘露糖型糖鏈的含量呈枸櫞酸鐵銨濃度依賴性降低，而雜合型、復雜型（包括二天線型、三天線型和四天線型）、平分型、巖藻糖化和唾液酸化糖鏈的含量呈明顯枸櫞酸鐵銨濃度依賴性升高。

2.2 HH4細胞鐵過載前后凝集素免疫組化分析結果

圖1 正常肝細胞HH4和鐵過載肝細胞HH4 N-糖鏈一級質譜圖Fig 1 MALDI-TOF-MSspectra of N-glycans from HH4 cellsand iron overloaded HH4 cells

為了進一步驗證N-糖鏈質譜分析結果的準確性，實驗針對性的選取了凝集素ConA、PHA-E、AAL、LCA和MAL-II進行凝集素組織化學分析。吲哚菁熒光染料Cy3摩爾吸光系數(shù)高且性能優(yōu)良已作為生物熒光探針分子廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。本實驗利用Cy3對5種凝集素進行熒光標記，然后分別與鐵過載前后HH4細胞孵育，最后通過激光共聚焦顯微鏡進行掃描分析。熒光掃描結果如圖3所示，與正常人肝細胞相比，凝集素ConA耦合后的鐵過載肝細胞熒光強度明顯降低，表明鐵處理后胞內高甘露糖型糖鏈結構的表達下降；凝集素PHA-E耦合后的鐵過載肝細胞熒光強度明顯增強，表明鐵處理后胞內平分型N-乙酰葡萄糖胺糖鏈結構(bisecting GlcNAc)的表達上升；凝集素AAL和LCA耦合后的鐵過載肝細胞熒光強度明顯增強，表明鐵處理后胞內末端巖藻糖化(TerminalαFuc)和α1-6核心巖藻糖(Fucose α1-6GlcNAc)化的糖鏈結構表達上升；凝集素MAL-II耦合后的鐵過載肝細胞熒光強度明顯增強，表明鐵處理后胞內α2-3唾液酸(Sia2-3Galβ1-4GlcNAc)化的糖鏈結構表達上升。以上5種凝集素的鐵過載前后化學分析結果均與糖鏈質譜分析結果相一致。

圖2 m/z 1743.613和2174.901的糖鏈二級圖Fig 2 MALDI-TOF/TOF-MS/MSanalysisof glycansw ith m/z 1743.695 and 2174.901

3 討論

鐵元素是人體內必需的微量元素，為幾乎所有的生命體所必需，在DNA合成、電子傳遞、氧氣運輸?shù)壬锎x過程中發(fā)揮了重要的作用［9-10］。當機體內鐵過多時則被稱為“鐵負荷過載”,主要體現(xiàn)在血清游離鐵和結合鐵的濃度增高。一般認為男性血清鐵蛋白質量濃度＞300 ng/m L，女性血清鐵蛋白＞200 ng/m L，或轉鐵蛋白飽和度＞45%即可以診斷為鐵過載［11］。近年來陸續(xù)有研究證實血液系統(tǒng)疾病患者骨髓移植后鐵代謝存在明顯紊亂，表現(xiàn)為不同程度的鐵負荷過高，而長期鐵過載可引發(fā)肝實質細胞損傷乃至肝臟器官纖維化、肝硬化和肝癌等嚴重的病理改變［12］。目前臨床上利用地拉羅司(Deferasirox,DFX或ICL670)等祛鐵藥物降低實質細胞鐵水平并改善MDS患者預后，但祛鐵藥物治療是一個漫長且昂貴的過程［13］。基于此，近年來國際上關于鐵過載的研究越來越受到關注，但是其表達調控的分子機制仍不清晰。當前很多的研究多從基因水平和蛋白質水平解析鐵過載導致的肝細胞損傷機制［14-17］，而鐵過載引發(fā)的肝細胞糖譜變化迄今尚未見報道，因此本文擬從糖組學角度闡述肝細胞鐵過載前后全糖鏈變化，為肝細胞鐵過載研究提供新的思路。

表1 正常肝細胞HH4和鐵過載肝細胞HH4各N-糖鏈質譜數(shù)據(jù)以及結構信息Table 1 Proposed structuresand theirmolecular ions in MALDI spectraof N-Glycans from control,5mM FAC-treated and 10mM FAC-treated groups

表2 不同類型N-糖鏈的相對變化Table2 Relative variation of different typesof N-Glycans

圖3 鐵過載前后HH4細胞與凝集素相結合的熒光細胞凝集素免疫組化圖（60×）Fig 3 Theaffinity of different lectins to HH4 cellsbeforeand after FAC treatmentanalyzed by fluorescence cell lectin-immunochem istry(60×)

實驗利用布魯克公司新型1 kHz高通量質譜儀UltrafleXtremeMALDI-TOF/TOF-MS對枸櫞酸鐵銨過載人肝細胞HH4前后N-糖鏈的指紋圖譜進行鑒定，然后篩選信噪比高于6的糖鏈質譜峰依托Glycoworkbench軟件進行注釋。結果表明枸櫞酸鐵銨過載人肝細胞HH4后N-糖鏈發(fā)生明顯的差異變化，細胞高甘露糖型表達呈現(xiàn)濃度依賴性降低，而雜合型、復雜型、平分型、巖藻糖修飾以及唾液酸修飾則表現(xiàn)為濃度依賴性升高（圖1和表1）。其中，m/z為1793.760、1955.826和2101.891巖藻糖化和唾液酸化的N-糖鏈含量增加最為明顯。本文接著利用熒光Cy3標記的凝集素ConA、PHA-E、AAL、LCA和MAL-II對鐵處理前后的肝細胞進行免疫親和反應，激光共聚焦掃描結果顯示鐵處理導致細胞對凝集素ConA親和降低，而對凝集素PHA-E、AAL、LCA和MAL-II親和增強，驗證了質譜數(shù)據(jù)結果（圖3）。

另據(jù)報道，胞內鐵穩(wěn)態(tài)調節(jié)相關蛋白具有較普遍的糖基化修飾現(xiàn)象，例如轉鐵蛋白受體2（TfR2）的胞外域上攜有的4個潛在的N-糖基化位點能促進TfR2亞基間二硫鍵高效形成以及維持TfR2蛋白穩(wěn)定［21］。此外，近年來相關研究發(fā)現(xiàn)胞內N-糖鏈巖藻糖化和唾液酸化水平變化與細胞凋亡的發(fā)生有一定的關聯(lián)。例如，α-1,6核心巖藻糖基轉移酶（Fut8）能夠催化巖藻糖分子轉移到N-糖鏈核心五糖最內側的與Asn相連的β-N-乙酰葡糖胺基上添加巖藻糖，而Goupille等報道在小鼠結腸癌細胞中過表達巖藻糖基轉移酶能夠抑制凋亡［18］，同時楊雪松等也證實巖藻糖基轉移酶IV過表達能夠抑制A43l細胞凋亡［19］。溶酶體唾液酸酶(Neu1)能夠水解運輸至溶酶體的糖蛋白酮糖苷鍵而釋放出非還原末端的唾液酸，而趙豫剛等人的研究則表明大鼠睪丸上皮細胞唾液酸含量與凋亡呈明顯負相關［20］。本實驗室先前的研究證實肝細胞鐵過載能夠激活胞內鐵穩(wěn)態(tài)相關蛋白的表達以及細胞凋亡，基于此實驗下一步計劃利用凝集素親和CLINPROT技術(液體蛋白芯片指紋圖譜解決方案)篩選觀察肝細胞鐵過載模式下鐵穩(wěn)態(tài)相關蛋白的表達情況并明確糖鏈修飾變化對其蛋白功能發(fā)揮的影響，以及分析鐵過載前后多種糖基轉移酶和相關糖苷酶的表達差異。

總之，本實驗利用MALDI-TOF/TOF-MS技術和凝集素免疫組化方法首次證實枸櫞酸鐵銨過載能夠誘導HH4細胞雜合型、復雜型、平分型、巖藻糖修飾以及唾液酸修飾N-糖鏈的表達，同時抑制高甘露糖型N-糖鏈的表達，研究將有助于闡明鐵過載引發(fā)的肝細胞糖譜變化，為骨髓移植引發(fā)肝細胞鐵過載的具體分子機理提供重要的理論參考。

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Study on differentialexpression of N-linked glycans in iron overload-induced human hepatocytesHH 4

LIShi-wei1,2,GUAN Feng1,2,LIXiang3
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology M inistry of Education;
2.Schoolof Biotechnology; 3.WuxiMedical School,Jiangnan University,Wuxi214122,China）

Hepatic iron overload is common in patients undergoing hematopoietic cell transplantation and may be associated w ith hepatic injury.Here iron overloadmodel of HH4 cells induced by FAC(ferric ammonium citrate)was established.The total proteins of HH4 cells treated w ith or w ithout FAC were extracted,and total glycopeptides were isolated by an ultrafiltration unit.The glycopeptides were enzymatically hydrolyzed by Peptide-N-glycosidase F(PNGase F)and the released N-linked glycans were desalinated using Sepharose 4B.The structures of the purified N-glycans were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS).Furthermore,the comparative expression of N-glycans was analyzed by lectin immunohistochem istry.The result indicated that 16 N-glycanswere differentially expressed in HH4 cells treated w ith orw ithout FAC.The levels of high-mannose-type N-glycanswere decreased significantly,while the expression of hybrid type, complex type,bisecting type,fucosylation and sialylation of glycanswere enhancedmarkedly in FAC-treated HH4 cells.Consistentw ith MS analysis,lectin immunohistochem istry study showed that the binding affinity to lectin ConA was reduced in FAC-treated HH4 cells,but the binding affinities to 4 lectins PHA-E,AAL,LCA and MAL-IIwere significantly increased.The present research provides the fundamentalobservations for furtherunderstanding functional rolesof differentialexpression of N-linked glycans in ironoverload HH4 cells.

iron overload;human hepatocytes HH4;MALDI-TOF/TOF-MS;N-linked glycans;lectin immunohistochem istry

R735.7

A

2095－1736（2015）03－0009－06

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.009

2014-10-24；

2014-12-15

國家自然科學青年基金（31400691）；江蘇省自然科學基金（BK20140169）

關鋒，教授，主要從事糖生物學方面研究，E-mail:fengguan@jiangnan.edu.cn；李想，副教授，研究方向為骨髓微環(huán)境對造血干細胞的發(fā)育以及分化的影響，E-mail:xiangli@jiangnan.edu.cn。