馬 雯 徐玉音 仇 芝 范亞平 陳曉嵐

前列腺素E2受體1亞型在轉化生長因子β1誘導小鼠系膜細胞損傷中的作用機制

馬 雯 徐玉音 仇 芝 范亞平 陳曉嵐

目的:探討前列腺素E2受體1亞型(EP1)對轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的小鼠腎小球系膜細胞(MCs)增殖、細胞外基質的影響及可能機制。方法:體外原代培養(yǎng)MCs。采用脂質體LipofectamineTM 2000化學合成法將siRNA轉染至MCs中沉默EP1受體，篩選干擾效率最大的EP1-siRNA片段。實驗分組:(1)正常對照組;(2)TGF-β1(10 ng/ml)組;(3)NC-siRNA+TGF-β1(10 ng/m l)組;(4)EP1-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)組;(5) EP1-siRNA組。ELISA法檢測各組細胞上清中前列腺素E2(PGE2)的表達，實時熒光定量PCR方法檢測各組細胞纖維連接蛋白(FN)、結締組織生長因子(CTGF)、環(huán)氧化酶2(COX2)、膜結合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1) mRNA的表達。Western blot法檢測FN、CTGF、COX2、mPGES-1蛋白及p38MAPK、ERK活性的變化。結果:與正常對照組相比，TGF-β1組FN、CTGF、COX2、mPGES-1的mRNA和蛋白的表達上調(diào)(P＜0.05);與TGF-β1組相比，EP1-siRNA+TGF-β1組FN、CTGF、COX2、mPGES-1的mRNA和蛋白的表達下調(diào)(P＜0.05);TGF-β1刺激后，p38MAPK、ERK磷酸化水平明顯增強(P＜0.05)，EP1-siRNA+TGF-β1組，p38MAPK、ERK磷酸化水平較對照組明顯下調(diào)(P＜0.05)。結論:EP1-siRNA可能通過抑制ERK和p38MAPK磷酸化減輕TGF-β1誘導的小鼠系膜細胞損傷。

前列腺素E2受體1亞型siRNA轉化生長因子β1系膜細胞信號通路

腎臟纖維化是各種慢性腎臟病(CKD)的主要病理改變，也是進展到終末期腎病(ESRD)的共同途徑，主要病理特點為腎臟細胞外基質(ECM)生成細胞的活化，而系膜細胞(MCs)是腎臟ECM生成的主要固有細胞之一。受到損傷時，MCs的反應是增殖、發(fā)生表型改變并產(chǎn)生ECM主要成分，如纖維連接蛋白(FN)、結締組織生長因子(CTGF)等，直接導致和加劇ECM在腎小球沉積，參與腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展過程，最終導致腎纖維化。ERK和p38MAPK是重要的絲裂原活化蛋白激酶信號系統(tǒng)(MARKs)通路，其在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用。有報道稱，ERK和p38在糖尿病(DM)大鼠腎小管上皮細胞被激活，其可能介導高糖誘導的細胞肥大和轉化生長因子β (TGF-β)的表達［1］。TGF-β是公認的致纖維化生長因子，是ECM沉積、腎纖維化進展的重要調(diào)節(jié)因子，還能夠刺激MCs環(huán)氧化酶2(COX2)/膜結合型前列腺素E2合酶1(mPGES1)的表達及其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)的合成。

PGE2是腎臟中一種主要的花生四烯酸代謝產(chǎn)物，通過與4種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)前列腺素受體(EP1～EP4)作用而廣泛參與腎臟多種生理和病理生理過程，包括參與調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮、腎小球濾過、腎素釋放及腎小管水鹽轉運等［2］。目前EP1受體在慢性腎臟病腎纖維化發(fā)生機制中的作用所知甚少。

RNA干擾(RNAi)技術是一種新興的基因治療技術，是發(fā)生于mRNA水平的轉錄后基因沉默技術?？稍诓溉閯游锛毎M織內(nèi)起到基因封閉作用，其結構穩(wěn)定，無須像反義寡核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾才能提高其半衰期，而且干擾RNA(siRNA)能在低于反義寡核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因降至低水平甚至完全“敲除”，從而產(chǎn)生缺失突變型［3，4］。因此本研究中，我們原代培養(yǎng)野生型小鼠MCs，并采用了脂質體LipofectamineTM 2000化學合成法將siRNA轉染至小鼠系膜細胞中干擾PGE2受體1亞型(EP1)受體，篩選最佳EP1-siRNA序列并用最佳的siRNA沉默MCsEP1受體，同時給予TGF-β1刺激，研究EP1受體抑制后，TGF-β1誘導的小鼠腎小球系膜細胞FN、CTGF、COX2、mPGES1蛋白和mRNA的表達及下游信號通路p38、ERK活性的變化，探討EP1受體是否參與腎臟纖維化的發(fā)生及可能機制，為CKD的治療提供新的思路。

材料和方法

材料和試劑DMEM細胞培養(yǎng)基粉劑(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，重組人TGF-β1(英國PeproTech)，siRNA(上海吉瑪公司)，CCK-8試劑盒，Ttizol RNA抽提試劑盒(Invitrogen公司)，PGE2 ELISA試劑盒(美國R＆D)，逆轉錄試劑盒(美國fermentas)，實時定量PCR試劑盒(羅氏)，八聯(lián)管(荷蘭BIO plastics)。細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)，實時熒光定量PCR儀(美國MJ)，Western印跡設備(美國Bio-Rad)，酶標儀(美國Bio-Rad)。β-actin、FN、CTGF、COX2、mPGES-1單克隆抗體(美國abcam公司)，ERK、p38MAPK單克隆抗體，磷酸化ERK、p38MAPK單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，EP1抗體(Cayman公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)，F(xiàn)N、CTGF、COX2，mPGES1引物(上海invitrogen公司)。二甲基亞砜(Sigma公司)，細胞裂解液、ECL顯影劑(碧云天)，PVDF膜。

siRNA的設計由上海吉瑪公司設計并合成針對EP1-mRNA的3條特異性siRNA，作為陰性對照的無義siRNA(Negative control siRNA，NC-siRNA)。3條設計序列如下:EP1-siRNA-1(siRNA-1)正義鏈5'-GGUGUUUUAUUAGCCUUGGTT-3'，反義鏈5'-CCAAGGCUAAUAAAACACCTT-3';EP1-siRNA-2(siRNA-2)正義鏈5'-GCUGCCAACAGGCGAUAAUTT-3'，反義鏈5'-AUUAUCGCCUGUUGGCAGCTT-3';EP1-siRNA-3 (siRNA-3)正義鏈5'-GCUCUCGACGAUUCCGAAATT-3'，反義鏈5'-UUUCGGAAUCGUCGAGAGCTT-3'。

siRNA的篩選轉染前一天約5×105系膜細胞接種于六孔板中，使用含血清不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2天細胞達到70%～90%融合后，換無血清、無抗生素的培養(yǎng)液，備用于轉染。MCs分組為對照組、NC-siRNA組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組。按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染三種EP1-siRNA，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4～6h后換有血清的培養(yǎng)基同時加入TGF-β1 2μl，繼續(xù)培養(yǎng)。24h后實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組系膜細胞EP1mRNA的表達情況，篩選干擾效率最大的siRNA片段。

原代小鼠MCs培養(yǎng)和分組取8～12周齡C57BL6雄性小鼠(南通大學實驗動物中心提供)，在無菌條件下取腎臟，將皮質剪碎，分別過濾70μm，40 μm篩網(wǎng)，取40μm篩網(wǎng)上的腎小球，離心收集消化的腎小球，加入DMEM完全培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4～6d后換液，后每2～3d換液1次，約2～3周系膜細胞長滿瓶底，經(jīng)形態(tài)學和免疫細胞化學鑒定證實為系膜細胞［5］，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第8～10代系膜細胞分組進行實驗。實驗分組: (1)正常對照組;(2)TGF-β1(10 ng/ml)組;(3)NC-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)組;(4)EP1-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)組;(5)EP1-siRNA組。

小分子siRNA實驗調(diào)整原代小鼠系膜細胞濃度為1×105/ml，接種于六孔板，孵育過夜，待細胞生長至70%～80%融合時，更換為無血清培養(yǎng)基，將合成的EP1-siRNA和Negative control siRNA(NC-siRNA)按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染入WT小鼠系膜細胞，培養(yǎng)12h后追加20%FBS同時給予10 ng/ml TGF-β1干預24h。

ELISA方法檢測各組系膜細胞內(nèi)PGE2含量取對數(shù)生長期的小鼠系膜細胞接種于6孔板(1×105/孔)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同步靜止后分別進行siRNA轉染，孵育4～6h后，加入10μg/L的TGF-β1，對照組加入等體積0.1%的BSA，24h后，取上清，按照ELISA試劑盒說明進行PGE2含量的測定。

RT-PCR按Trizol試劑說明書提取各組MCs的總RNA，用紫外分光光度計測定濃度后，取2μg總RNA進行逆轉錄反應。采用RT-PCR儀以20μl反應體系進行PCR擴增。每個樣品均采用3復孔。PCR熱循環(huán)參數(shù):50℃2 min→95℃10 min→(95℃15s→60℃60s)×40。樣本擴增結果用GADPH的濃度校正，得出的值按公式2－△△Ct求出基因表達的相對變化量，再進行各組間比較。引物由上海invitrogen公司合成，序列如表1。

表1 實時熒光定量PCR引物分析

Western印跡法檢測蛋白的表達用PMSF及IP細胞裂解液提取系膜細胞總蛋白。紫外分光光度計測蛋白濃度。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜，封閉液(1×TBST，5%脫脂奶粉)封閉2h，加入一抗抗-FN、CTGF、COX2、mPGES1、ERK、p-ERK、p38MAPK、pp38MAPK、單克隆抗體，4℃過夜。1×TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗FN、、CTGF、COX2、mPGES-1、ERK、p38MAPK、p-ERK、p-p38MAPK、和-actin:抗兔，1∶1 000稀釋;室溫下孵育2h，1×TBST洗膜3次，最后用ECL化學顯色劑(北京Applygen公司)進行顯影。結果用吸光度掃描分析軟件Image J6.0進行分析，其中p-ERK，p-p38MAPK，與ERK，p38MAPK比值代表ERK，p38MAPK的活化度。其余蛋白表達量用內(nèi)參照-actin校正。

統(tǒng)計學分析SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以x ±s表示，各組間進行組間單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

最佳EP1-siRNA序列的篩選RT-PCR法檢測轉染后各組系膜細胞中EP1 mRNA的表達結果顯示，轉染siRNA-3的細胞中EP1 mRNA的表達水平與對照組和NC-siRNA組比較，均顯著降低(P＜0.05)，轉染siRNA-1和siRNA-2的細胞中EP1 mRNA的表達無明顯的變化。對照組和NC-siRNA組細胞中EP1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義，排除了轉染試劑的作用并且證實了siRNA分子對靶基因抑制作用的特異性。根據(jù)實驗結果，我們選取siRNA-3用于后續(xù)試驗(圖1A、B)。

各組小鼠腎小球MCs培養(yǎng)上清中PGE2含量的影響ELISA結果顯示，與TGF-β1組和NC-siRNA+ TGF-β1組比較，EP1-siRNA+TGF-β1組細胞培養(yǎng)上清中PGE2的表達均明顯下調(diào)(P＜0.05)(圖1C)。

siRNA轉染后各組TGF-β1誘導的系膜細胞FN、CTGF表達的影響Western Blot檢測結果顯示，10 ng/ml TGF-β1刺激各組細胞后，與正常對照組比較，TGF-β1組、NC-siRNA+TGF-β1組和EP1-siRNA+TGF-β1組細胞FN、CTGF蛋白表達量明顯增加(aP均＜0.05，圖2A、C);與TGF-β1組和NC-siRNA+TGF-β1組比較，EP2-siRNA+TGF-β1組細胞FN、CTGF蛋白表達量顯著減少(bP＜0.05，cP＜0.05，圖2A、C);RT-PCR結果與Western Blot結果一致(圖2B)。

圖1 轉染后各組腎小球系膜細胞EP1 m RNA的表達(RT-PCR)

圖2 各組系膜細胞FN、CTGF的表達(W estern Blot)TGF-β1:轉化生長因子β1;EP1:前列腺素E2受體1亞型;FN:纖維連接蛋白;CTGF:結締組織生長因子; NC:陰性對照;a:P＜0.05 vs正常對照組;b:P＜0.05 vs TGF-β1組;c:P＜0.05 vs NC-siRNA+TGF-β1組

siRNA轉染后TGF-β1誘導的各組系膜細胞PGE2合成通路中合酶的影響:RT-PCR和Western Blot檢測結果顯示，10ng/ml TGF-β1刺激后，與對照組比較，各組細胞COX2、mPGES1 mRNA和蛋白的表達明顯上調(diào)(P＜0.05);EP1-siRNA+TGF-β1組COX2、mPGES1 mRNA和蛋白的表達比陰性對照組減少(P＜0.05)(圖3)。

siRNA轉染后各組TGF-β誘導的系膜細胞p38MAPK和ERK磷酸化水平為了進一步了解EP1受體下游的相關信號通路分子的變化，我們采用Western Blot法觀察各組細胞p-p38MAPK，p-ERk的表達情況。結果顯示，10 ng/ml TGF-β1刺激后，TGF-β1組p-p38MAPK、p-ERk的表達顯著增加(P＜0.05);EP1受體沉默后，EP1-siRNA+TGF-β1組p-p38MAPK、P-Erk蛋白的表達比陰性對照組明顯下調(diào)(P＜0.05)(圖4)。

討論

隨著對腎纖維化機制研究的深入，前列腺素系統(tǒng)的作用受到廣泛關注［6，7］。有報道發(fā)現(xiàn)在腎小球系膜區(qū)存在明顯的EP1原位雜交信號，高糖條件誘導的系膜細胞增殖幾乎可以被EP1拮抗劑完全抑制［8］。動物實驗證明前列腺素受體EP1選擇性拮抗劑能有效阻止鏈脲佐菌素(STZ)誘導的大鼠糖尿病腎病的發(fā)展［8］，減輕高血壓引起的大鼠腎損害［9］。還證明了EP1拮抗劑(EP1A)治療顯著可改善卒中易感型自發(fā)性高血壓大鼠(SHRSP)中腎損傷的組織學和功能，即使在高血壓發(fā)病和出現(xiàn)蛋白尿時［8］。以上研究說明EP1可能參與了腎臟的多種病理生理過程。但是目前關于EP1在慢性腎纖維化作用方面還沒有相關報道。本文主要探究EP1在腎臟纖維化發(fā)生過程中的作用及可能機制。

圖3 各組腎小球系膜細胞PGE2合成通路中合酶的表達(Western Blot)TGF-β1:轉化生長因子β1;EP1:前列腺素E2受體1亞型;COX2:環(huán)氧化酶2;mPGES1:膜結合型前列腺素E2合酶1;NC:陰性對照;a:P＜0.05 vs正常對照組;b:P＜0.05 vs TGF-β1組;c:P＜0.05 vs NC-siRNA+TGF-β1組

圖4 siRNA轉染后各組細胞p-p38MAPK，p-ERk的表達(W estern Blot)

CTGF是TGF-β1的下游效應介質，后者具有促有絲分裂、細胞趨化、誘導黏附、促進細胞增殖及ECM合成的作用，在血管和軟骨生成、組織修復、腫瘤和組織纖維化中發(fā)揮重要病理作用［10］。在人類MCs發(fā)現(xiàn)TGF-β1和CTGF皆具有顯著的誘導膠原合成的作用，目前在糖尿病腎病和多種進展型腎臟疾病中已證實CTGF的表達顯著上調(diào)。我們的實驗結果顯示，小鼠MCs EP1沉默后，與對照組相比，TGF-β1誘導FN、 CTGFmRNA和蛋白的表達及MCs增殖明顯增加，而siRNA+TGF-β1組的FN、CTGF表達則顯著降低。提示EP1可能參與了MCs增殖過程，而且抑制EP1受體表達可能減輕TGF-β1的促纖維化作用。

COX2是PGE2合成過程中重要的酶，在多種腎臟疾病的動物實驗及臨床觀察中都發(fā)現(xiàn)COX2上調(diào)，提示環(huán)氧酶激活可能在腎臟疾病發(fā)病機制和發(fā)展過程中具有重要病理作用［11，12］。研究證明，mPGES-1主要與COX2偶聯(lián)發(fā)揮作用，尤其是在多種前炎癥因子誘發(fā)的遲發(fā)型反應中，mPGES-1和COX2在多種組織表達都顯著上調(diào)，同時伴PGE2合成增加［13－15］，在諸多病理過程中發(fā)揮重要的作用。在本研究中，siRNA轉染腎小球MCs使EP1沉默后，COX2表達水平下調(diào);而mPGES-1的表達也被下調(diào)。以上研究提示相互偶聯(lián)的COX2/mPGES-1可能在MCs損傷過程中發(fā)揮重要作用，而mPGES-1的高水平表達對于MCs后續(xù)PGE2的產(chǎn)生和EP1受體的激活至關重要。我們檢測了各組MCs培養(yǎng)液中PGE2的表達，結果顯示TGF-β1刺激后，PGE2的表達上調(diào)，EP1沉默后，PGE2的表達下調(diào)。因此我們推測TGF-β1刺激后，COX2/mPGES-1表達增加，可能使PGE2表達上調(diào)及激活EP1受體;而EP1受體表達降低反饋下調(diào)COX2和mPGES-1的表達，抑制MCs的增殖和ECM的合成，從而發(fā)揮抗炎作用，減輕MCs損傷和腎臟的纖維化，因此，上述結果提示EP1可能在TGF-β1誘導的MCs損傷中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

MAPKs是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸雙重磷酸化蛋白激酶家族，它存在于大多數(shù)原核生物和所有真核生物中，在細胞生物信號傳導中起著非常重要的作用。MAPKs家族主要包括ERK、p38MAPK和JNK，介導細胞生長、發(fā)育、分化及死亡及細胞間的功能同步等多種生理過程［16］。p38MAPK是控制炎癥反應最主要的MAPK家族成員之一，且有研究表明p38MAPK主要通過引起細胞增殖、肥大或凋亡在早期腎臟發(fā)育中起重要作用。有研究表明，在TGF-β1誘導的大鼠腎小球MCs，EP1參與的細胞增殖是通過ERK/MARK激酶途徑實現(xiàn)的［17］。我們的研究發(fā)現(xiàn)EP1受體沉默可顯著抑制TGF-β1誘導的ERK、P38磷酸化;這一結果提示TGF-β1誘導的細胞增殖及胞外基質聚積可能部分與EP1介導的ERK和P38磷酸化有關。

結合我們目前的實驗結果，我們認為沉默EP1受體可以抑制ERK、P38信號通路，從而抑制激酶級聯(lián)的下游靶位，比如FN、CTGF等從而發(fā)揮抑制MCs增殖的作用，TGF-β1刺激后，PGE2的表達上調(diào)，EP1受體沉默后反饋下調(diào)COX2/mPGES-1的表達，抑制MCs的增殖和細胞外基質的合成減輕MCs損傷。這些結果提示抑制EP1受體可能作為一個治療腎纖維化的潛在靶點，是否給慢性腎臟病的患者提供了一種新的治療觀念，則仍需在以后的研究中進一步確定。

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Role of prostaglandin E2 receptor subtype 1 on TGF-β1-induced mousem esangial cell

MAWen，XU Yuyin，QIU Zhi，F(xiàn)AN Yaping。CHEN Xiaolan
Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001，China

CHEN Xiaolan(E-mail:chenxl8448@sina．com)

Objective:To investigate the effect and mechanisms of prostaglandin E2 receptor subtype 1(EP1)on transforming growth factor-β1(TGF-β1)-induced mousemesangial cells(MCs)．M ethodology:The primary MCs were generated．Three siRNAswere designed and synthesized．One of them thatwas capable of silencing EP1most effectively in MCs．They were divided into five cell groups:(1)control group;(2)TGF-β1(10 ng/ml)group;(3)NC-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)group;(4)EP1-siRNA+TGF－β1(10 ng/m l)group;(5)EP1-siRNA group．The expression of PGE2 in cell supernatant of each group was detected by using ELISA，themRNA expression of fibronectin(FN)，connective tissue growth factor(CTGF)，cyclooxygenase-2(COX2)，and mPGES-1 of each group was determined by using Real-Time PCR，and the proteins of FN，CTGF，COX2，mPGES-1 and the variation of phosphorylation proteins relating to MAPKs signaling pathway，such as p38，ERK，were examined by using Western blot．Results:Compared with normal control group，mRNA and protein expressions of FN，CTGF，COX-2 andmPGES-1 were up-regulated in group 2(TGF-β1 group) (P＜0.05)．Compared with group 2(TGF-β1 group)，the expressions of FN，CTGF，COX-2 and mPGES-1 mRNA and proteinswere down-regulated in group 4(EP1-siRNA+TGF-β1 group)(P＜0.05)．The silencing EP1 also declined TGF-β1-induced p38 and ERK phosphorylation(P＜0.05)．Conclusion:EP1-siRNA may mitigate the damage of TGF-β1 induced MCs by inhabiting p38 and ERK1/2 phosphorylation．

prostaglandin E2 receptor subtype 1 siRNA transforming growth factorβ1 mesangial cells signaling pathway

2014-07-14

(本文編輯 青松春 江加則)

國家自然科學基金(81170656)，南通市科技項目(HS2011021)，南通大學研究生科技創(chuàng)新計劃項目(YKC13078)［作者單位］江蘇南通大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(南通，226001)

陳曉嵐(E-mail:chenxl8448@sina．com)

2015年版權歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有